木薯叶多酚氧化酶的制备方法

摘要

一种木薯叶多酚氧化酶的制备方法，将新鲜木薯叶洗净剪碎，按每克木薯叶配制pH为6的磷酸缓冲液4毫升，在45℃下加入质量为木薯叶总质量0.8%的纤维素酶作用45分钟，5℃下用组织捣碎仪捣碎至糊状后冷冻浸提5小时，抽滤后收集滤液；在5℃下冷冻离心，收集离心液得木薯叶多酚氧化酶粗酶液；粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集的沉淀溶于5℃预冷的磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，即得木薯叶多酚氧化酶纯化液，经真空冷冻干燥制成木薯叶多酚氧化酶冻干粉。本发明由于木薯叶廉价、易得且活性高，提供了高活性的木薯叶多酚氧化酶，具有实际应用价值。

权利要求

1.一种木薯叶多酚氧化酶的制备方法，将新鲜木薯叶洗净剪碎，加入磷酸缓冲液和纤维素酶作用后捣碎至糊状，再冷冻浸提、抽滤、滤液离心分离得木薯叶多酚氧化酶粗酶液；

粗酶液采用硫酸铵进行分级沉淀，沉淀溶于磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，所得木薯叶多酚氧化酶纯化液经真空冷冻干燥制成木薯叶多酚氧化酶；其特征是：⑴每克木薯叶配制pH为6的磷酸缓冲液4毫升，在45℃下加入木薯叶总质量0.8％的纤维素酶作用45分钟；

⑵5℃下用组织捣碎仪捣碎至糊状后冷冻浸提5小时，用纱布抽滤，弃去滤渣收集滤液；

⑶在5℃下以12000r/min冷冻离心25分钟，收集离心液得木薯叶多酚氧化酶粗酶液；

⑷木薯叶多酚氧化酶粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集40％至80％饱和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸缓冲液，纯化后经真空冷冻干燥制成木薯叶多酚氧化酶。

2.如权利要求1所述的木薯叶多酚氧化酶的制备方法，其特征是在木薯叶加入磷酸缓冲液和纤维素酶作用后，按每克木薯叶加入0.02克的交联聚乙烯吡咯烷酮，充分混匀，用高速组织捣碎仪匀浆捣碎，在5℃下浸提5小时后采用纱布过滤，弃去滤渣收集滤液。

3.如权利要求1所述的木薯叶多酚氧化酶的制备方法，其特征是在木薯叶加入磷酸缓冲液和纤维素酶作用后，加入木薯叶质量4倍的冷丙酮，用高速组织捣碎机捣成匀浆，抽滤，滤液待用；滤饼用冷冻丙酮再次提取抽滤，得到的白色物质，真空干燥，得木薯叶多酚氧化酶丙酮粉；将丙酮粉溶于pH6.0的磷酸缓冲液中提取3h，加入以上所述的待用滤液，在

5℃下以12000rmp/min离心25min，除去沉淀，取其上清液即为木薯叶多酚氧化酶粗酶液。

说明书

木薯叶多酚氧化酶的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种木薯叶多酚氧化酶的制备方法。

背景技术

[0002] 木薯又称树薯、木番薯（拉丁学名：Manihot esculenta crantz，英文名称Cassava），属于大戟科Euphorbiaceae木薯属Manihot，为多年生灌木状作物。木薯在全世界热带地区广泛种植，我国主要在两广地区及海南岛进行栽培。目前对木薯的利用主要是利用其块状根加工制备木薯淀粉和酒精、果糖、葡萄糖等，而数量众多的木薯叶则随木薯茎秆被丢弃。多酚氧化酶是一种含铜离子辅基的蛋白酶，广泛存在于植物细胞中，它能催化邻苯二酚氧化成邻苯二醌。植物中的多酚氧化酶主要存在于叶绿体的类囊体的基质中，从而不至于发生氧化反应。但当植物体的生理发生病变或者组织受到破坏时，这种酶与底物区域分开的平衡被打破，发生反应生成醌，连锁反应的结果导致发生果蔬保鲜中常见的褐变问题，直接影响到果蔬等农产品的外观、风味和营养。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种利用木薯叶提取木薯叶多酚氧化酶的制备方法，该方法能够从木薯叶获得高活性的多酚氧化酶，对于研究植物多酚氧化酶的酶学性质及其应用有重要的意义，为木薯的综合利用提供参考。

[0004] 本发明以如下技术方案解决上述技术问题：将新鲜木薯叶洗净剪碎，按每克木薯叶配制pH为6的磷酸缓冲液4毫升，在45℃下加入质量为木薯叶总质量0.8%的纤维素酶作用45分钟，冷至5℃；然后用高速组织捣碎仪捣碎至糊状，取出置于5℃下冷冻浸提5小时后进行抽滤，弃去滤渣收集滤液；在5℃下以12000r/min冷冻离心25分钟，收集离心液即得木薯叶多酚氧化酶粗酶液。木薯叶多酚氧化酶粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集40%至80%饱和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，即得木薯叶多酚氧化酶纯化液，经真空冷冻干燥制成冻干粉，即得木薯叶多酚氧化酶。

[0005] 一种木薯叶多酚氧化酶的制备方法，其特征是将新鲜木薯叶洗净剪碎，按每克木薯叶配制pH为6的磷酸缓冲液4毫升，在45℃下加入质量为木薯叶总质量0.8%的纤维素酶作用45分钟，按每克木薯叶加入0.02克的交联聚乙烯吡咯烷酮，充分混匀，用高速组织捣碎仪匀浆捣碎，在5℃下浸提5小时后采用纱布过滤，滤液用12000r/min5℃冷冻离心25分钟，收集滤液得到木薯叶多酚氧化酶粗酶液。木薯叶多酚氧化酶粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集40%至80%饱和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，即得木薯叶多酚氧化酶纯化液，经真空冷冻干燥制成冻干粉，即得木薯叶多酚氧化酶。

[0006] 一种木薯叶多酚氧化酶的制备方法，其特征是将新鲜木薯叶洗净剪碎，按每克木薯叶配制pH为6的磷酸缓冲液4毫升，在45℃下加入质量为木薯叶总质量0.8%的纤维素酶作用45分钟，加入木薯叶质量4倍的冷丙酮，用高速组织捣碎机捣成匀浆，抽滤，滤液待用；滤饼用冷冻丙酮再次提取抽滤，得到的白色物质，真空干燥，得木薯叶多酚氧化酶丙酮粉；将丙酮粉溶于pH6.0的磷酸缓冲液中提取3h，加入以上所述的待用滤液，在5℃下以12000rmp/min离心25min除去沉淀，取其上清液即为木薯叶多酚氧化酶粗酶液。木薯叶多酚氧化酶粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集40%至80%饱和度的沉淀，沉淀溶于
5℃的磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，即得木薯叶多酚氧化酶纯化液，经真空冷冻干燥制成冻干粉，即得木薯叶多酚氧化酶。

[0007] 本发明采用了来源广泛且缺乏利用的木薯叶为主要原料，能够得到廉价、易得、且活性很高的木薯叶多酚氧化酶，为多酚氧化酶的酶学性质研究及应用提供了高活性的酶，为木薯的综合利用提供了新的路子。而且采用了微生物酶或交联聚乙烯吡咯烷酮或丙酮辅助磷酸缓冲液提取法，得到了高活性的木薯叶多酚氧化酶，具有实际应用价值。

具体实施方式

[0008] 多酚氧化酶在植物的各个组织中都广泛存在，因为其对植物本身具有多种生理意义,特别在植物抗病中有重要作用。

[0009] 本发明利用生物和化学提取方法有机结合提取木薯叶多酚氧化酶。

[0010] 木薯叶多酚氧化酶结合能力最强的底物为焦性没食子酸，反应最适pH值为7.0，温度为40℃时，酶促氧化反应的Km值为0.8mol/L,Vmax=0.1510(U/min)。总酶活26000U，总蛋白269.4mg，比活力96.51U/mg。

[0011] 对木薯叶洗净剪碎的尺寸没有严格要求，大概是1～3cm左右就行，因为后面还要捣碎！

[0012] 实施例1

[0013] 采集新鲜木薯叶洗净剪碎约1cm，按照每克木薯叶加入4毫升pH为6的磷酸缓冲液，在45℃下加入质量为木薯叶总质量0.8%的纤维素酶作用45分钟。然后冷至5℃，用高速组织捣碎仪捣碎至糊状，取出置于5℃冰箱冷冻浸提5小时。再用2层纱布进行抽滤，弃去滤渣收集滤液，在5℃条件下以12000r/min冷冻离心25分钟，收集离心液即得木薯叶多酚氧化酶粗酶液。木薯叶多酚氧化酶粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集40%至80%饱和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，即得木薯叶多酚氧化酶纯化液，经真空冷冻干燥制成冻干粉，即得木薯叶多酚氧化酶。经测定单位酶活为260U/mL。

[0014] 实施例2

[0015] 采集新鲜木薯叶洗净剪碎为1cm，按照每克木薯叶加入4毫升pH为6的磷酸缓冲液，在45℃下加入质量为木薯叶总质量0.8%的纤维素酶作用45分钟，按每克木薯叶加入0.02克的交联聚乙烯吡咯烷酮，充分混匀，用高速组织捣碎仪匀浆捣碎1分钟，停机1分钟然后再次捣碎1分钟。所得匀浆在5℃浸提5小时后采用2层纱布过滤，滤液用12000r/min5℃冷冻离心25分钟，收集滤液得到木薯叶多酚氧化酶粗酶液。木薯叶多酚氧化酶粗酶液纯化先采用硫酸铵进行分级沉淀，收集40%至80%饱和度的沉淀，沉淀溶于5℃的磷酸缓冲液，再采用葡聚糖凝胶sephadex G-75纯化，即得木薯叶多酚氧化酶纯化液，经真空冷冻干燥制成冻干粉，即得木薯叶多酚氧化酶。经测定单位酶活为310U/mL。