大麻脱胶废液作为碳源发酵生产果胶酶

摘要

本发明公开了一种利用大麻脱胶废液作为碳源发酵制备果胶酶的方法，包括以下步骤：a、将大麻脱胶废液通过超滤设备去除大部分NaOH和水；b、用HCl调pH至4.0沉淀并获得木质素；c、将果胶和半纤维素作为主要碳源、以麦麸作为主要氮源，接种黑曲霉发酵生产果胶酶；d、浸泡发酵料、液-渣分离机分离出果胶液、超滤浓缩、DEAE-纤维素吸附、洗脱、浓缩、丙酮沉淀、乙醇脱水、冷冻干燥获得比活力为15000u/g、最适pH为4.3、最适温度为43℃的果胶酶。本发明方法工艺简单，容易实现产业化，不但减少大麻脱胶废液对环境的污染，同时降低果胶酶的生产成本，增加企业经济效益和社会效益。

权利要求

1.一种利用大麻脱胶废液作为碳源发酵制备果胶酶的方法，其特征在于包括以下步骤：a、将大麻脱胶废液通过截留分子量150-300道尔顿超滤设备去除大部分NaOH和水；

b、用HCl调pH至4.0沉淀木质素，离心获得木质素，果胶和半纤维素在液相，将液相调pH至5.6；

c、将上述溶液作为主要碳源、以麦麸作为主要氮源，添加磷酸氢二铵和硫酸亚铁，混合、灭菌、接种黑曲霉孢子后进行发酵；

d、用去离子水浸泡发酵料，液-渣分离机分离出果胶液，超滤浓缩去除大部分水和盐，DEAE-纤维素吸附、洗脱、浓缩、丙酮沉淀、乙醇脱水、冷冻干燥。

说明书

大麻脱胶废液作为碳源发酵生产果胶酶

技术领域

[0001] 本发明涉及一种利用大麻脱胶废液发酵生产果胶酶的方法，属于微生物发酵领域。

背景技术

[0002] 纤维用大麻是我国重要的纺织麻类之一。将大麻韧皮部剥离后晒干成大麻韧皮，大麻韧皮约含40％左右的胶质，胶质包括果胶、半纤维素和木质素，其中果胶占胶质的70％以上。韧皮部脱胶后的产品为大麻精干麻，可以纯纺也可以与棉混纺成大麻纱，后者织成布。大麻产品具有挺括滑爽、通风透气、抗霉防蛀、抗静电、易洗快干等优点，在国际市场享有盛誉，是我国纺织出口的优势产品，每年为国家创造大量外汇。在众多的麻类纺织品中，大麻纺织品是欧共体和美国不设限的产品。

[0003] 脱胶是大麻加工的首道工序，一般采用生物-化学联合脱胶法。先用脱胶菌液(含果胶酶)在常温下浸泡大麻韧皮，脱胶菌分泌的果胶酶将大部分果胶分解(生物脱胶)；半纤维素和木质素通过NaOH溶液(6％)蒸煮去除(化学脱胶)。生物脱胶与化学脱胶产生的废水合并为脱胶废水，废水含NaOH、果胶、半纤维素、木质素和色素等。根据对部分大麻脱胶企业废水的分析，废水NaOH浓度约4.5-5.0％(w/v)，CODCr约10.6-12.8g/L，BOD5约3
5.5-6.8g/L，SS约1.02-1.15g/L。中等规模的大麻脱胶加工厂每天排放脱胶废水约30m，废水达标处理每天需要约600元，每年需要直接治污费约20万元，加上设备投资和运行管理费用，治污费用很高。

[0004] 果胶酶是世界四大酶制剂之一，是分解果胶多种酶的总称，分为果胶解聚酶和果胶酯酶(PE)。PE水解果胶大分子侧链中的酯键；果胶解聚酶又包括聚半乳糖醛酸酶(PG)和果胶裂解酶(PL)二个亚类，PG通过水解α-1，4糖苷键起作用将大分子果胶水解成小分子，PL通过反式消去作用切断果胶分子中的α-1，4糖苷键将果胶分子降解为小分子，工业上使用的多为PG。

[0005] 能产果胶酶的菌有多种，许多霉菌、少量细菌和酵母都能分泌果胶酶。黑曲霉是常用的果胶酶发酵菌，属于真菌，有多种突变种，产物为PG。由于黑曲霉发酵生产果胶酶工艺成熟、单位原料生产的果胶酶活性高、安全性高，因此国内外基本上都以黑曲霉作为果胶酶生产菌。

[0006] 正常情况下黑曲霉发酵的主要原料为麦麸，少量碎米和其他辅料，麦麸主要提供氮源和碳源，碎米补充碳源和部分氮源，其他辅料作为微量元素的补充。黑曲霉发酵为固体发酵，30℃左右发酵约3-4天。用生理盐水浸泡发酵料，离心分离出果胶液，超滤浓缩后经过DEAE-纤维素吸附、洗脱、浓缩、丙酮沉淀、乙醇脱水、冷冻干燥获得果胶酶。

发明内容

[0007] 大麻脱胶废液含NaOH高达4.5-5.0％，黑曲霉的发酵环境为酸性，因此要除去NaOH，如果用HCl中和NaOH不但增加成本，而且生成大量NaCl，影响脱胶废液的添加量，添加量超过一定量就会渗透压过高，黑曲霉菌不能生长。废脱胶液含有木质素，木质素不能被黑曲霉分解。木质素有广泛的用途，可以作为制备酚醛树脂的原料，可以加HCl调pH至4.0沉淀、离心获得木质素。本发明旨在利用去除大部分NaOH和木质素的大麻脱胶废液(含果胶和半纤维素等成分)代替淀粉，其他工艺与常规方法基本相同。本发明不但解决了大麻脱胶废液对环境的污染问题，又降低了果胶酶的生产成本。本发明的技术效果体现在几个方面：

[0008] 1、降低了大麻脱胶废液的污染，环境效益明显

[0009] 先将大麻脱胶废液通过超滤设备去除大部分NaOH和水，添加新的固体NaOH循环使用(用于化学脱胶)；其中的木质素通过调pH至4.0沉淀获得，木质素有广泛的用途，可以作为制备酚醛树脂的原料；最后剩余的果胶和半纤维素作为黑曲霉发酵的碳源。因此，本发明专利基本上将废脱胶液全部利用，环境效益明显。

[0010] 2、减少了企业的治污费用，提高了企业的经济效益

[0011] 按照一般大麻脱胶企业每天排放脱胶废水30m3计算，废水达标处理每天约需要600元，每年直接需要治污费约20万元，设备投资大概需要200万元，每年的运行管理费约
10万元，综合固定资产折旧、直接费用和运营管理费，每年在废水处理方面的费用约50万元。虽然在果胶酶生产过程中也有部分废水需要处理，但每年仅仅需要约15万元，本发明每年可减少企业的治污费用约35万元。

[0012] 3、降低了果胶酶的生产成本，增强了产品的竞争力。

[0013] 本发明利用去除大部分NaOH和木质素的大麻脱胶废液(含果胶和半纤维素等成分)代替淀粉，麦麸提供氮源，同时添加磷酸氢二铵补充氮源和磷元素，添加硫酸亚铁补充铁元素。用废脱胶水代替部分原料比常规方法降低了果胶酶的生产成本，以1吨发酵料生产6.8kg果胶酶的发酵原料成本计算，二种方法的成本比较见下表，发酵原成本降低十分显著。

[0014] 二种方法生产的果胶酶原料成本分析(以1吨发酵料生产6.8kg果胶酶为例，单位：元)

[0015]

[0016] 由上表可以看出每吨发酵料节省原料成本253元，大麻厂每年排放脱胶废水约9000吨，可以配制发酵料6000吨，可生产工业用果胶酶40.8吨，全年可节省原料成本
151.1万元。

具体实施方式

[0017] 去除大部分NaOH和木质素的废脱胶液含果胶12.5-13.0％；半纤维素6.2-6.4％；木质素1.1-1.2％；其他固体成分1.9-2.1％；水74.6-75.8％。

[0018] 实施例一：

[0019] 第一步：超滤去除废脱胶液中的NaOH

[0020] 取1500kg废脱胶液，选用杭州欧凯膜技术有限公司生产的超滤膜浓缩除盐设备(DK8048型膜组件，截留分子量150-300道尔顿)超滤。超滤出溶液900kg(占总体积的60％，含NaOH、水和其他小分子)，添加固体NaOH后作为化学脱胶液循环使用，浓缩液600kg(占总体积的40％)。

[0021] 第二步：木质素的提取

[0022] 在搅拌条件下添加工业HCl(浓度约21％)至pH 4.0，静止24h沉淀木质素，通过液-固连续离心机分离出木质素(转鼓转速6000rpm，输出压力200Kpa)，将去除木质素后的液体(含果胶和半纤维素)用废脱胶原液(未作超滤和去木质素处理，含约4.5％NaOH)调pH至5.6。测得废胶液含果胶12.5％、半纤维素6.2％、木质素1.1％、其他固体成分1.9％、水78.3％。

[0023] 第三步：接种与发酵

[0024] 将废脱胶液600kg、麦麸395kg、(NH4)2HPO4 4kg、FeSO4.7H2O 1kg、搅拌均匀后灭菌。6
将混合料冷却至室温，喷洒黑曲霉孢子并混匀(约10个孢子/克)，在消毒过的发酵房中
30±2℃发酵，一定间隔取样测定果胶酶的活性，达到果胶酶最大活性(84小时)结束发酵，果胶酶活力1900U/g干基质。

[0025] 第四步：果胶酶的提取、纯化与活性测定

[0026] 用去离子水浸泡发酵料，第一次料液比为1∶4，浸提30分钟后通过液-渣分离机分离(转鼓转速6000rpm，输出压力200Kpa)；第二次料液比为1∶3，浸提30分钟后通过液-渣分离机分离(转鼓转速6000rpm，输出压力200Kpa)；渣主要为木屑，可以重复利用。通过超滤浓缩去除大部分水和盐，加0.05M NaAC-HAC缓冲液后再进行浓缩。按照说明书处理国产DEAE-纤维素(上海恒信化学试剂有限公司)，浓缩液中加DEAE-纤维素进行吸附，用0.05M NaAC-HAC(含0.2M NaCl)洗脱杂蛋白，用0.05M NaAC-HAC(含0.3M NaCl)洗脱果胶酶。通过超滤浓缩去除大部分水和盐(DK8048型膜组件，截留分子量150-300道尔顿)，浓缩至原来体积的1/4，加预冷的丙酮浓度至66％，沉淀4小时后离心(转鼓转速7000rpm，输出压力250Kpa)获得果胶酶沉淀，无水乙醇脱水，冷冻干燥(-20℃)。每吨发酵料产果胶酶6.83kg，得率为38％。

[0027] 制备的果胶酶特征如下：外观为浅黄色粉末；按照国家标准(QB1502-92)测定的酶活力为15000u/g；最适pH为4.3；最适温度为43℃。

[0028] 实施例二：

[0029] 第一步：超滤去除废脱胶液中的NaOH

[0030] 取1500kg废脱胶液，其他操作同实施例一。

[0031] 第二步：木质素的提取

[0032] 操作同实施例一。去除大部分NaOH和木质素后测得废胶液含果胶13.0％、半纤维素6.4％、木质素1.2％、其他固体成分2.1％、水77.3％。

[0033] 第三步：接种与发酵