一种重组噬菌体双表达载体及应用

摘要

本发明提供一种重组噬菌体双表达载体及应用，涉及生物技术领域。所述重组噬菌体双表达载体，是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体。本发明重组噬菌体双表达载体，稳定性高，能够在噬菌体表面展示目的基因1编码的蛋白，同时能够将真核表达盒运到免疫细胞内部，实现目的基因2的真核表达，可作为各种抗原表位多肽表达的通用平台。通过免疫效力检测发现，该疫苗免疫后，机体能够产生高水平的抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体，而且抗体持续期长。

权利要求

1.一种重组噬菌体双表达载体，其特征在于：是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体；所述T7噬菌体基因组中非编码区为T7噬菌体基因组左侧578-2746位的区域；

所述目的基因1为SEQ ID NO：1所示核苷酸序列；

所述目的基因2为编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。

2.根据权利要求1所述重组噬菌体双表达载体，其特征在于：所述重组噬菌体双表达载体的表面展示有目的基因1编码的多肽，同时又能在免疫细胞内真核表达目的基因2编码的蛋白质。

3.根据权利要求1或2所述重组噬菌体双表达载体，其特征在于：所述真核表达盒含有CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴。

4.根据权利要求3所述重组噬菌体双表达载体，其特征在于：在T7噬菌体非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒的具体方法为：在T7噬菌体的非编码区选择插入位点，分别PCR扩增该插入位点上、下游基因序列作为左、右同源臂，构建自上游到下游依次含有左同源臂和右同源臂的重组克隆载体；

将目的基因2插入CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴之间，得到真核表达盒；

将所述真核表达盒插入所述重组克隆载体的左、右同源臂之间，得到同源重组质粒；

所述同源重组质粒与T7噬菌体基因组进行同源重组，得到非编码区插入了含有目的基因2的真核表达盒的重组T7噬菌体。

5.一种以权利要求1－4之一所述重组噬菌体双表达载体为抗原的疫苗。

说明书

一种重组噬菌体双表达载体及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种重组噬菌体双表达载体及其应用。

背景技术

[0002] T7噬菌体是感染大肠杆菌的小型烈性噬菌体，基因组为线状双链DNA，长39936bp。其衣壳蛋白包括主要头蛋白(P10A)、次要头蛋白(P10B)、颈圈蛋白(P8)、尾蛋白(P11、P12)和尾丝蛋白(P17)，其中P10A和P10B是由p10编码的是一对重叠蛋白，P10A有
344个氨基酸残基，P10B有397个氨基酸残基，是在P10A的phe341处翻译移码产生的，在野生型T7噬菌体中，P10B约占衣壳蛋白总量(415拷贝)的10%。T7噬菌体展示系统是一种新型的展示系统，对p10进行了改造，自然状态下的翻译移码位点被去除，并在348位氨基酸之后重组入了一个多克隆位点，使得基因组中仅表达改造后的P10B (415拷贝)，因而可以将外源肽段以融合蛋白的形式展示在P10B上。利用噬菌体作为抗原表位的载体，其表面展示的多肽是生物体自身翻译机制产生的天然构象产物，能很好的诱发机体的抗原-抗体免疫反应；噬菌体有较强的免疫原性，在噬菌体表面表达的多肽易于接近抗体，容易被免疫系统识别；噬菌体可以募集T辅助细胞，而且噬菌体颗粒的不对称性有利于引发T细胞依赖的免疫反应；由于噬菌体颗粒是由感染的细菌分泌，噬菌体颗粒可以方便的大规模生产疫苗用抗原表位，还可以在同一噬菌体上展示多个具有保护性作用的抗原决定簇，构建多价疫苗；噬菌体生长迅速，纯化简单、花费少；噬菌体颗粒稳定，对理化因素的抵抗力强。

[0003] 但是，以表面展示有抗原表位的噬菌体颗粒作为抗原制备的疫苗，其免疫效果也不能令人满意。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种重组噬菌体双表达载体，利用T7噬菌体的生物学特性，将其作为半抗原的表达和递呈载体又作为DNA疫苗的转运载体，实现外源基因在真、原核条件下的双表达，该方法操作简单，稳定性高，可作为外源基因表达的通用平台。

[0005] 本发明的目的采用如下技术方案实现。

[0006] 一种重组噬菌体双表达载体，是在T7噬菌体基因组中p10B基因的下游插入目的基因1，在T7噬菌体基因组中非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒后得到的重组双表达载体。

[0007] 所述重组噬菌体双表达载体的表面展示有目的基因1编码的多肽，同时又能在免疫细胞内真核表达目的基因2编码的多肽。

[0008] 所述真核表达盒含有CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴。

[0009] 所述T7噬菌体基因组中非编码区为T7噬菌体基因组左侧578-2746位的区域。

[0010] 所述目的基因1为（1）或（2）或（3）的核苷酸序列：

[0011] （1）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列；

[0012] （2）编码在口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽氨基端添加了柔性Linker氨基酸后所得多肽的核苷酸序列；

[0013] （3）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍具有口蹄疫病毒VP1（129-169）位多肽的主要抗原活性的核苷酸序列。

[0014] 所述目的基因2为（4）或（5）的核苷酸序列：

[0015] （4）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示；

[0016] （5）编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白的核苷酸序列经改变、缺失或增加一个或几个核苷酸但仍具有口蹄疫病毒VP1结构蛋白的主要抗原活性的核苷酸序列。

[0017] 在T7噬菌体非编码区插入含有目的基因2的真核表达盒的具体方法为：

[0018] 在T7噬菌体的非编码区选择插入位点，分别PCR扩增该插入位点上、下游基因序列作为左、右同源臂，构建自上游到下游依次含有左同源臂和右同源臂的重组克隆载体；

[0019] 将目的基因2插入CMV真核启动子和SV40 PolyA尾巴之间，得到真核表达盒；

[0020] 将所述真核表达盒插入所述重组克隆载体的左、右同源臂之间，得到同源重组质粒；

[0021] 所述同源重组质粒与T7噬菌体基因组进行同源重组，得到非编码区插入了含有目的基因2的真核表达盒的重组T7噬菌体。

[0022] 一种以所述重组噬菌体双表达载体为抗原的疫苗。

[0023] 本发明具有如下技术效果：

[0024] 本发明重组噬菌体双表达载体，稳定性高，能够在噬菌体表面展示目的基因1编码的蛋白，同时能够将真核表达盒运到免疫细胞内部，实现目的基因2的真核表达，可作为各种抗原表位多肽表达的通用平台。

[0025] 本发明将抗原表位的多肽（口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽）展示在噬菌体表面，同时又通过同源重组的方法将含有口蹄疫病毒VP1结构蛋白的真核表达盒导入T7噬菌体基因组左侧非编码区，得到重组噬菌体双表达载体。利用该重组噬菌体双表达载体作为免疫原制备的疫苗，重组噬菌体颗粒既可作为多肽抗原的半抗原载体，将抗原表位递呈给免疫细胞，同时又是DNA疫苗的转运载体，将DNA疫苗高效的转运到免疫细胞内部，实现亚单位抗原的表达。通过免疫效力检测发现，该疫苗免疫后，机体能够产生高水平的抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白抗体，而且抗体持续期长。

[0026] 本发明重组噬菌体双表达载体的制备方法简单，稳定性高，成本低，便于大规模生产。

附图说明

[0027] 图1为T7-VP1129-169重组噬菌体PCR鉴定的电泳图。泳道1为DL2000 DNA Marker；泳道2为T7 Select 415-1b的PCR产物；泳道3为T7-VP1129-169重组噬菌体PCR产物。

[0028] 图2为重组噬菌体T7- VP1129-169-VP1酶切后的电泳鉴定图，其中泳道1为λ-HindⅢ digest DNA Marker；泳道2为重组噬菌体T7-VP1129-169基因组SwaⅠ酶切产物；泳道3为重组噬菌体T7- VP1129-169-VP1基因组SwaⅠ酶切产物。

[0029] 图3重组噬菌体T7- VP1129-169-VP1体外表达鉴定的荧光显微镜图像；其中图A为空白对照的荧光显微镜图像；图B为重组噬菌体T7- VP1129-169-VP1体外表达鉴定的荧光显微镜图像。

[0030] 图4 显示了UBI®VP1多肽ELISA检测试剂盒检测各猪免疫后不同时间产生的平均抗体水平。

[0031] 图5显示了采用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测各组猪免疫后第4周的抗体水平。

具体实施方式

[0032] 编码如SEQ ID NO：1所示基因，CMV真核启动子、SV40 PolyA尾巴为常规技术。限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ购自大连宝生物生物工程公司。

[0033] T7噬菌体载体、E.coli BL21购自Novagen公司。

[0034] T7噬菌体滴度的测定为常规技术。

[0035] 实施例1构建重组噬菌体T7-VP1129-169

[0036] 重组噬菌体T7-VP1129-169是在T7 Select 415-1b的p10B基因下游插入编码口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽的核苷酸序列后形成的，其衣壳蛋白p10B的羧基端融合表达了口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽。

[0037] 在口蹄疫病毒VP1结构蛋白（129-169）位多肽（如SEQ ID NO:3所示）的氨基端添加柔性Linker氨基酸GGGGS，形成了多肽A。在编码多肽A的核苷酸序列的5’端添加酶切位点EcoRⅠ，3’端添加酶切位点HindⅢ，形成了SEQ ID NO：1所示的DNA序列。

[0038] 由商业公司合成SEQ ID NO：1所示的DNA序列，并克隆至pUC-19载体多克隆位点中。

[0039] 用限制性内切酶EcoRⅠ、HindⅢ将SEQ ID NO：1所示DNA序列从重组pUC-19载体上切下后插入T7噬菌体多克隆位点的EcoRⅠ和HindⅢ之间，构建重组噬菌体。

[0040] 插入SEQ ID NO：1的重组pUC-19载体双酶切体系：

[0041]ddH2O 16.0 μL
10×H Buffer 5.0 μL
插入SEQ ID NO：1的重组pUC-19载体 25.0μL
EcoRⅠ 2.0 μL
HindⅢ 2.0 μL

[0042] 混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4 小时，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

[0043] T7 Select 415-1b（T7噬菌体载体）双酶切体系：

[0044]ddH2O 11.0 μL
10×T Buffer 2.0 μL
T7 Select 415-1b 5.0μL
EcoRⅠ 1.0 μL
HindⅢ 1.0 μL

[0045] 混匀上述反应体系，并置于37 ℃水浴作用4 小时，酶切产物经0.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定后，胶回收试剂盒进行切胶回收鉴定。

[0046] 连接反应体系：

[0047]SEQ ID NO：1所示DNA序列回收产物 2.0 μL
T7 Select 415-1b回收产物 0.5 μL
ddH2O 1.75 μL
T4 DNA Ligase 0.25 μL
10×T4 DNA Ligase Buffer 0.5 μL

[0048] 16℃连接过夜，得到连接产物1。

[0049] 重组噬菌体的包装：

[0050]连接产物1 5.0 μL
T7 噬菌体Packing Extracts 25.0 μL

[0051] 22℃包装2小时，在包装反应体系中加入270μL LB培养液终止反应，得到包装产物。

[0052] 包装产物的平板扩增：

[0053] 100μL包装产物与250μL新鲜过夜培养的BL21菌液(OD600=1.0)混匀后，迅速与3mL融化的45℃温浴的顶层琼脂混合均匀平铺LB平皿，待顶层琼脂凝固后，37℃倒置培养至形成噬菌斑。挑取噬菌斑，PCR方法筛选和鉴定阳性重组噬菌体T7-VP1129-169，结果见图1。阳性重组噬菌体T7-VP1129-169可以扩增出520bp目的片段。

[0054] 实施例2同源重组中间质粒载体的构建

[0055] 分析重组噬菌体T7-VP1129-169基因组，选择基因组左侧第578位A为真核表达盒的插入位点。将重组噬菌体T7-VP1129-169基因组左侧1-578位的基因片段作为左同源臂，基因组左侧2746-2946位的基因片段为右同源臂。针对两个同源臂设计两对引物，并在引物5’端添加XhoⅠ、HindⅢ和EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点。左同源臂引物为L1-578UP和L1-578DOWN，右同源臂引物为R2746-2946UP和R2746-2946DOWN。

[0056] L1-578UP：5’- aactcgagTCTCACAGTGTACGGACCTA，

[0057] L1-578DOWN：5’-AAAAGCTTTCGTGCGACTTATCAGGCTG。

[0058] R2746-2946UP：5’- AAGAATTCcaGAATTCCAGAAAGAAATTGACCGCGC，[0059] R2746-2946DOWN：5’-AAGGATCCTGACCCAGAGCATAGCGTTA。

[0060] 以T7 Select 415-1b基因组为模板，分别PCR扩增左同源臂和右同源臂。

[0061] 左同源臂扩增体系如下：

[0062]L1-578UP 1.0 μL
L1-578DOWN 1.0μL
T7 Select 415-1b 1.0μL
Mg2+ 3.0μL
dNTP 2.0 μL
10×Buffer 5.0 μL
Ex TaqE 0.5μL
H2O 36.5μL

[0063] 反应程序为：94℃ 4min；94℃ 45sec，55℃ 45sec，72℃ 45sec，30个循环；72℃10min。

[0064] 右同源臂扩增体系如下：

[0065]R2746-2946UP： 1.0 μL
R2746-2946DOWN 1.0μL
T7 Select 415-1b 1.0μL
Mg2+ 3.0μL
dNTP 1.0 μL
10×Buffer 5.0 μL
Ex TaqE 0.5μL
H2O 37.5μL

[0066] 反应程序为：94℃ 4min；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 30sec， 30个循环；72℃10min。

[0067] 将左同源臂PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收，酶切处理后插入pBluescript II SK载体，得到重组质粒pBluescript-L。

[0068] 将右同源臂PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定、回收，酶切处理后插入重组质粒pBluescript-L的左同源臂下游，构建重组质粒pBluescript-L-R。即重组质粒pBluescript-L-R中左、右同源臂的位置关系与重组噬菌体T7-VP1129-169基因组中位置一致。

[0069] 由商业公司合成口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列（如SEQ ID NO：2所示），该基因序列已克隆至商品化质粒pEGFP-N1（美国CLONTECH）的CMV真核启动子和SV40 polyA之间，命名为p-VP1。CMV真核启动子、口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列和SV40 polyA构成真核表达盒。以p-VP1为模板，针对CMV真核启动子和SV40 polyA设计引物Pcmv UP和SV40 polyA DOWN，扩增含有CMV真核启动子、口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列和SV40 polyA的真核表达盒。引物序列为：

[0070] Pcmv UP：AAAAGCTTattaatagtaatcaattacg；

[0071] SV40 polyA DOWN：AAGAATTCatacattgatgagtttggac。

[0072] PCR扩增真核表达盒的反应体系如下：

[0073]Pcmv UP： 1.0 μL
SV40 polyA DOWN 1.0μL
p-VP1 1.0μL
Mg2+ 3.0μL
dNTP 2.0 μL
10×Buffer 5.0 μL
Ex TaqE 0.5μL
H2O 36.5μL

[0074] 反应程序为：94℃ 4min；94℃ 30sec，55℃ 1min，72℃ 1min 30个循环；72℃10min。

[0075] 将PCR扩增的真核表达盒通过两端酶切位点插入重组质粒pBluescript-L-R的左同源臂和右同源臂之间，得到同源重组质粒pBluescript-L-VP1-R。将pBluescript-L-VP1-R送华大基因测序，序列完全正确的质粒用于同源重组。

[0076] 实施例3 插入真核表达盒的重组T7噬菌体构建

[0077] 同源重组质粒pBluescript-L-VP1-R与重组噬菌体T7-VP1129-169DNA发生同源重组后，由CMV真核启动子、口蹄疫病毒VP1结构蛋白基因序列和SV40 polyA构成的真核表达盒插入到重组噬菌体T7-VP1129-169基因组左侧第578位A之后，替换了重组噬菌体T7-VP1129-169基因组中579-2745位的片段，获得重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1。

[0078] 同源重组的具体方法如下：将中间载体pBluescript-L-VP1-R导入E.coliBL21中，获得BL21-pBluescript-L-VP1-R。将BL21-pBluescript-L-VP1-R在含氨苄西林抗性的LB固体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种3mL在含氨苄西林抗性的LB液体培养基，37℃、200转/分震荡培养过夜，获得BL21-pBluescript-L-VP1-R菌液。同时，培养重组噬菌体T7-VP1129-169。分别测定BL21-pBluescript-L-VP1-R菌液的菌落数、重组噬菌体T7-VP1129-169噬斑数；在1mL LB液体培养基中加入BL21-pBluescript-L-VP1-R菌液10μL，按照MOI=0.001加入T7-VP1129-169噬菌体培养液和适量的氨苄西林，37℃、200转/分震荡培养，2-3小时后培养液保持澄清即可停止，回收培养液。将回收的培养液进行10倍梯度稀释，通过双层琼脂夹心法测定培养液滴度，挑选平板上单个噬菌体噬斑，用引物Pcmv UP和SV40 polyA DOWN进行菌落PCR。能够扩增出含有VP1结构蛋白编码基因（SEQ ID NO：2）的真核表达盒的噬斑，即为插入了真核表达盒的重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1。重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1的酶切鉴定电泳图如图2所示。从图2可以看出重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1通过酶切后可以切出6000bp目的片段。

[0079] 另外，将同源重组中间载体pBluescript-L-VP1-R与T7噬菌体DNA发生同源重组，获得插入了真核表达盒的重组噬菌体T7-VP1。重组噬菌体T7-VP1将用于后续试验中的对照。

[0080] 实施例4T7-VP1129-169-VP1重组噬菌体的扩增及基因组提取

[0081] 甘油冻存的E.coli BL21菌株在LB固体培养基平面上划线接种，37℃过夜培养；从平皿上挑取单菌落，接种5mL LB液体培养基，37℃、200转/分震荡培养过夜。取3mL过夜培养物接种300mL LB液体培养基，培养至OD600=0.8左右。挑取平皿上的单个重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1噬菌斑，接种到培养好的BL21宿主菌中，37℃、100转/分震荡培养2-3小时，直至菌液由浑浊变为澄清。用PEG-NaCl沉淀的方法回收噬菌体，并用双层琼脂夹心方法测定噬菌体滴度。在回收的重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1中添加终浓度为1μg/mL的RNase A（核糖核酸酶A）、DNaseI（脱氧核糖核酸酶Ⅰ），37℃反应1小时，然后调整噬菌体
12
浓度为2.0×10 pfu/mL，4℃保存。

[0082] 取5mL回收的重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1，添加50μL 10%SDS、50μL 0.5M EDTA，65℃消化30分钟，中间轻轻摇匀2-3次。加等体积苯酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，轻轻混匀，12000转/分钟离心5分钟，取上层清液到一新离心管，重复该操作一次。然后加等体积氯仿/异戊醇(24：1)，轻轻混匀， 12000转/分钟离心5分钟，取上层清液到一新离心管，重复该操作一次。转移上清到一新离心管，加等体积异丙醇，轻轻混匀，-20℃放置1小时，12000转离心10分钟，去除上清，用1mL预冷的70%乙醇洗涤沉淀1-2次，瞬时离心，弃上清，将沉淀室温下晾干，然后溶于200μL TE缓冲液，即为提取的重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1的DNA。取部分DNA用SmaⅠ进行酶切鉴定，剩余部分-20℃冻存备用。

[0083] 实施例5重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1的体外表达

[0084] 将处于对数生长期的Vero细胞经胰酶消化后用无抗生素含10%FCS的MEM培养液6
轻轻吹下，调整细胞密度到1.0×10个/mL，然后均匀分布于6孔细胞培养样板，用不含抗生素的MEM培养基调整体积到2mL，于二氧化碳培养箱37℃过夜培养。将提取的重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1的DNA（实施例4制备）经脂质体(LipofectamineTM 2000)包裹，与Vero细胞共培养36h；另留两孔细胞不转染DNA，用作空白对照。弃去培养液，PBS缓冲液洗涤3次，75%乙醇固定细胞。加入抗口蹄疫病毒VP1结构蛋白阳性血清（上海吉尔生化有限公司制备），于37℃孵育1h，PBS冲洗3次，加入荧光标记的羊抗兔免疫球蛋白抗体（美国abcam公司），避光37℃反应30min。用PBS洗涤3次后用荧光显微镜观察。

[0085] 如图3所示，荧光显微镜观察表明：转染重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1 DNA的Vero细胞有很强的荧光显色，说明插入的真核表达盒能够正确表达VP1结构蛋白；空白对照中的细胞内部未见荧光显色。

[0086] 实施例6重组噬菌体油乳剂疫苗的制备

[0087] 重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1油乳剂疫苗的制备方法如下：

[0088] 疫苗油相的制备：4mL司本80，2mL司本85，94mL 10号矿物油，2g硬脂酸铝，充分混匀，121℃高压20分钟。

[0089] 疫苗水相的制备：将94mL滴度为2×1013pfu/mL的重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1灭活后，加入4mL高压灭菌吐温-80，3000转/分钟搅拌均匀，即得疫苗水相。

[0090] 在组织捣碎机加入150mL疫苗油相，一边缓慢搅拌一边缓慢加入50mL疫苗水相，待充分混匀后，10000转/分钟快速搅拌2分钟，形成稳定的油包水结构，即为制备的重组噬11
菌体T7-VP1129-169-VP1油乳剂疫苗（抗原含量为1.0×10 pfu/mL），4℃保存备用。

[0091] 按照上述方法，分别将重组噬菌体T7-VP1和T7-VP1129-169制备成相应的油乳剂疫11
苗。各疫苗中的抗原含量为1.0×10 pfu/mL。

[0092] 实施例7重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1疫苗免疫效力检测

[0093] 采用实施例6中制备的各重组噬菌体疫苗进行下面的试验。

[0094] 在仔猪40日龄时，分别采用重组噬菌体T7-VP1129-169、T7-VP1、T7-VP1129-169-VP1的油乳剂疫苗进行一次免疫，每头猪免疫2mL，期间定期采集血液样品检测抗体。具体操作如下：

[0095] 挑选出生日龄相近的健康猪40头，同群饲养至40日龄，其中10头为重组噬菌体T7-VP1129-169免疫组，接种重组噬菌体T7-VP1129-169油乳剂疫苗；10头为重组噬菌体T7-VP1免疫组，接种重组噬菌体T7-VP1油乳剂疫苗；10头为重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1免疫组，接种重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1油乳剂疫苗；10头为商品化多肽疫苗免疫组，接种猪口蹄疫O型合成肽疫苗(多肽2570+7309，中牧兰州生物制药厂)。在免疫后的0、2、4、6、8周采®血分离血清，分别用UBIVP1多肽ELISA检测试剂盒和口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒（中国农业科学研兰州兽医研究所）检测抗体。

[0096] 采用UBI®VP1多肽ELISA检测试剂盒检测各猪免疫后不同时间产生的抗体水平，计算平均抗体水平，结果如图4所示。从图4可以看出，各疫苗免疫后机体均产生抗口蹄疫VP1结构蛋白抗体，其中重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1疫苗免疫后两周抗体迅速升高，OD450值达到2.8以上，免疫后2到8周抗体水平仍有小幅上升，并能维持在OD450 3.0左右，抗体持续期长；猪口蹄疫O型合成肽疫苗免疫后抗体上升缓慢，免疫后4周抗体到达高峰，但OD450值仅有1.2。其他重组噬菌体疫苗免疫后，猪产生的抗体水平也显著低于重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1疫苗免疫后产生的抗体水平。

[0097] 采用口蹄疫O型抗体液相阻断ELISA检测试剂盒检测各组猪免疫后第4周的抗体水平，结果如图5。从图5可以看出，免疫后第4周，重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1免疫组中，有9头猪阻断抗体不低于1:64，即免疫后的保护率达到了90％，其中6头阻断抗体达到1:128的高水平；重组噬菌体T7-VP1疫苗免疫组中，有8头猪阻断抗体不低于1:64，其中4头达到1:128；重组噬菌体T7-VP1129-169免疫组中，8头猪阻断抗体不低于1:64，但仅2头达到1:128；猪口蹄疫O型合成肽疫苗仅有一头猪阻断抗体达到1:64，满足免疫保护的要求。
该结果说明，重组噬菌体T7-VP1129-169-VP1疫苗免疫后，试验猪能够产生较高抗体水平，保护率能够达到90％。