pGreenMax1真核表达载体及其制备方法

摘要

本发明涉及一种的是分子生物技术领域的pGreen Max1真核表达载体及其制备方法。由Mex、IRES-EGFP片段和真核表达载体重组获得序列1，序列1共计8003bp，其中在第1769bp-2415bp之间插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之间插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列；制备方法包括：设计引物从质粒中通过PCR的方法克隆得到Mex，并将PCR产物经过SmaI位点定向插入到表达载体中，并经过BamHI和NotI双酶切将IRES-EGFP插入到载体中，构建重组的pGreen Max真核表达载体。本发明载体作为在真核细胞中获取目的蛋白或抗体的应用，并为高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记。

权利要求

1.一种pGreen Max1 真核表达载体，其特征在于，所述载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：

1所示，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表达载体重组获得序列1，序列1共计8003bp。

2.一种根据权利要求1所述的pGreen Max1 真核表达载体的制备方法，其特征在于，通过设计引物从质粒中通过PCR的方法克隆得到Mex，并将PCR产物经过SmaI位点定向插入到表达载体，并经过BamHI和NotI双酶切将IRES-EGFP插入到载体中，构建重组的pGreen Max1真核表达载体。

3.一种根据权利要求1所述的pGreen Max1 真核表达载体的应用，其特征在于，pGreen Max1真核表达载体在真核细胞中获取目的蛋白并为高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征是，所述的目的蛋白为抗体。

说明书

pGreen Max1真核表达载体及其制备方法

[0001] 本发明是由专利申请号为：201110099371.6，专利申请名称为：“pGreen Max1真核表达载体及其制备方法”，专利申请人为：上海交通大学，专利申请日为：2011年4月20日的专利分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及的是一种分子生物技术领域的载体及其制备方法，特别涉及的是一种pGreen Max1真核表达载体及其制备方法。

背景技术

[0003] 真核表达载体主要用于在细胞内大量表达某些特定的蛋白，目前已有的真核表达载体主要有：

[0004] (1)pCMVp-NEO-BAN载体，该载体在大多数真核细胞中都可以高水平稳定地表达外源目的基因，并可以利用G418进行筛选。

[0005] (2)pEGFP载体，如U.S.Patent Nos.5625048issued on April29,1997。pEGFP载体的特点是可以表达绿荧光蛋白，通过固定波长的光波激发可以发出绿荧光，该载体可以表达一个蛋白，使之与绿荧光形成融合蛋白，用于确定外源基因在细胞中的定位，同时，该载体可以用G418来筛选。

[0006] 上述载体都有不足之处，pCMVp-NEO-BAN载体可以很好的表达外援蛋白，但筛选克隆和鉴定蛋白的表达量比较困难，不利于筛选。pEGFP载体可以比较简单的用于筛选和检测蛋白的表达量，但是由于要与绿荧光蛋白融合形成融合蛋白，对目的蛋白构象、后续加工和分布会有影响。pGreen Max1载体很好的解决了这几个问题。它可以通过G418先进行初步的筛选克隆，然后可以根据细胞绿荧光的表达量来判断稳定细胞株的目的蛋白的表达量，并且绿荧光蛋白和目的蛋白不是形成融合蛋白，而是分别形成两个蛋白，对于目的蛋白构象和后续加工完全没有影响。

发明内容

[0007] 本发明的目的是针对现有技术中存在的不足，提供一种pGreen Max1真核表达载体及其制备方法，本发明可在哺乳动物细胞内高效表达蛋白或抗体，实现高产细胞株筛选提供稳定筛选标记。

[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：

[0009] 本发明涉及的pGreen Max1真核表达载体，由Mex、IRES-EGFP片段和真核表达载体重组获得序列1，序列1共计8003bp，其中在第1769bp-2415bp之间插入了含有647bp的Mex片段，在第3120bp-4428bp之间插入了含有1309bp的IRES-EGFP序列。

[0010] 本发明涉及的上述pGreen Max1真核表达载体的制备方法，通过设计引物从质粒中通过PCR的方法克隆得到Mex，并将PCR产物经过SmaI位点定向插入到表达载体中，并经过BamHI和NotI双酶切将IRES-EGFP插入到载体中，构建重组的pGreen Max真核表达载体。

[0011] 所述的pGreen Max1真核表达载体的制备方法，包括如下步骤：

[0012] A、设计引物：根据Mex序列设计引物，上游引物加入PmeI位点，引物序列如下：

[0013] Mex F：GATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGAT

[0014] Mex R：TGAGGCCTGA GTTCAGACCG GT

[0015] B、目的片段的克隆：以带有Mex的质粒为模板，进行PCR扩增：模板1μl，上下游引物10μM各1μl，2.5mM的dNTP底物4μl，10倍缓冲液5μl，pfu聚合酶1μl，双蒸水37μl；95℃变性2分钟；然后94℃变性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸50秒，进行30-40个循环；最后72℃延伸7-10分钟；

[0016] C、扩增产物纯化：PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约647bp的扩增条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；

[0017] D、pMex真核载体的构建：

[0018] D-1、酶切：将载体用SmaI酶进行酶切，酶切时在反应体系中加入10倍缓冲液2μl，SmaI1μl，载体5μl，无离子水12μl，37℃水浴4个小时，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

[0019] D-2、连接：回收的Mex的片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应；

[0020] D-3、转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素100μl/ml的LB培养基上37℃培养12-16小时；

[0021] D-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒；

[0022] D-5、利用SpeI进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒；

[0023] E、得到IRES-EGFP序列：在质粒中利用BamHI和NotI双酶切得到IRES-EGFP序列，并经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约1300bp的条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化；

[0024] F、pGreen Max1真核表达载体的构建：

[0025] F-1、酶切：将载体用BamHI和NotI双酶切，酶切时在反应体系中加入10倍缓冲液2μl，BamHI1μl，NotIμl，pMex载体5μl，无离子水12μl，37℃水浴4个小时，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收；

[0026] F-2、连接：回收的IRES-EGFP片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应；

[0027] F-3、转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素100μl/ml的LB培养基上37℃培养12-16小时；

[0028] F-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒；

[0029] F-5、利用HindIII进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pGreen Max1真核表达质粒。

[0030] 步骤C中所述的PCR产物，其纯化方法步骤如下：

[0031] ①从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55℃下温浴7分钟使得凝胶溶解；

[0032] ②将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心2分钟；

[0033] ③向DNA吸附柱中加入700μl漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液，再加入500μl漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心2分钟，室温放置5分钟；

[0034] ④将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65℃预热的洗脱缓冲液70μl，13000转/分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。

[0035] 步骤D-2中所述的连接，其连接方法如下：在反应体系中加入回收的PCR产物DNA片段8μl和载体片段2μl，10倍缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl，去离子水7μl，16℃反应10h。步骤F-2所述的连接方法是：在反应体系中加入回收的DNA片段8μl和载体片段2μl，10倍缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl，去离子水7μl，16℃反应10h。

[0036] 步骤D-3所述的转化大肠杆菌，其转化大肠杆菌方法步骤如下：

[0037] ①取连接产物10μL加到50μL的感受态细胞中，轻轻摇匀，冰浴30min.[0038] ②42℃热激90s,快速转到冰浴2-3min,注意不要摇动管。

[0039] ③向管中加入500μL的LB培养基，150rmp,37℃，45min.

[0040] ④将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.

[0041] ⑤将平板正置直至液体全部吸收。

[0042] ⑥倒置平板，于37℃培养12－16h.

[0043] 步骤D-4中所述的筛选重组真核表达载体阳性克隆，其筛选重组真核表达载体阳性克隆方法步骤如下：

[0044] ①挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，150rpm，摇床培养12～16hr；

[0045] ②取1-1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，4℃，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4℃保存；

[0046] ③将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μl冰预冷的碱裂解液Ⅰ中，漩涡震荡，使细菌悬浮均匀；

[0047] ④细菌重悬液中加入200μl碱裂解液Ⅱ，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(<5min)；

[0048] ⑤加入150μl冰预冷的碱裂解液Ⅲ,上下翻转离心管8次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并将离心管置于冰上1～3min,4℃，13000rpm离心5min，将～400μl的上清转移至另一个离心管中；

[0049] ⑥加400μl酚:氯仿(V:V＝1:1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取上清于新离心管中；

[0050] ⑦用2～2.5体积的乙醇(850μl)室温沉淀核酸，混合均匀，室温静置2min。13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉；

[0051] ⑧加1ml左右70％乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心1min。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)；

[0052] ⑨打开离心管，室温静置3～5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在；

[0053] ⑩加50μl TE缓冲液(含20μg/ml RNase A)于离心管中，静置5min，温和震荡混匀，贮存于-20℃。

[0054] 步骤D-5中所述的酶切鉴定和测序，其酶切鉴定和测序方法如下：

[0055] 在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5μl，10倍缓冲液2μl，限制性内切酶SpeI1μl，去离子水13μl，37℃反应2h；经1％琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pMex的目的条带，SpeI酶切后可切出约1.3kb和5.3kb的两个片段，与预期相符，表明目的片段已正确的插入载体中；

[0056] 步骤F-5中的酶切鉴定和测序，其酶切鉴定和测序方法如下：

[0057] 在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5μl，10倍缓冲液2μl，限制性内切酶HindIII1μl，去离子水13μl，37℃反应2h；经1％琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pGreen Max1的目的条带，HindIII酶切后可切出约4.9kb、2.9kb和230bp的三个片段，与预期相符，表明目的片段已正确的插入载体中。

[0058] 本发明应用的是EF1α启动子，是人体内高表达蛋白的启动子，可以避免外源启动子对细胞的不良影响。同时该载体可以利用绿荧光的发光来表征蛋白在细胞中的表达，便于细胞株的筛选。可在高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记，为蛋白高效表达提供了很好的载体，也为细胞株的筛选提供一种新的方法和便利。

附图说明

[0059] 图1是本发明的PCR的电泳照片；

[0060] 其中：可以看到500bp到750bp之间有一个明显的条带，条带大小与预期的647bp大致相等，与预期相符，表明Mex序列PCR成功。

[0061] 图2是本发明的pMex质粒的酶切鉴定的电泳图片；

[0062] 其中：经过SpeI酶切后，可以切出1.3kb和5.3kb两个条带，与预期相符，表明Mex片段已正确的插入到载体当中。

[0063] 图3是pMex和IRES-EGFP的酶切电泳照片；

[0064] 其中：经过BamHI和NotI酶切，载体大小为6.6kb，IRES-EGFP序列为1.3kb，与预期大小相符。

[0065] 图4是pGreen Max1质粒酶切照片；

[0066] 其中，经过HindIII酶切，可以切出三个条带，分别是4.9kb、2.9kb和230bp的条带，与预期条带相符，表明IRES-EGFP序列已经正确插入到pMex载体当中。

[0067] 图5是转染了蛋白A重组真核表达载体的细胞

[0068] 其中，转染以后，细胞中可以表达绿荧光蛋白，可以用于细胞株的筛选。

[0069] 图6是转染了蛋白A重组真核表达载体的细胞的上清免疫荧光的照片。

[0070] 图7为抗体B蛋白电泳照片。

[0071] 其中，转染以后，在细胞的上清中可以检测到蛋白A的表达。表明载体构建成功并可以应用。

具体实施方式

[0072] 以下结合附图对本发明的担载蛋白的组织工程纤维支架及其制备和体外释放实验实施作详细说明：以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

[0073] 以下实施例中载体及基因来源说明：特异引物由上海生工合成；载体构建中使用的限制性内切酶BamHI、NotI、pfu酶和T4连接酶均Fermentas公司产品(生工生物工程(上海)有限公司，021-37772180)；载体构建中使用的DNA纯化试剂盒为索莱宝公司(上海索宝生物科技有限公司，上海市徐汇区钦江路)产品，按说明书进行；载体转染(PEI为sigma公司产品)及分泌表达检测试剂均为市售试剂。未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

[0074] 实施例1

[0075] pGreen Max1真核表达载体构建方法

[0076] A、设计引物：

[0077] 根据Mex序列设计引物，上游引物加入PmeI位点，引物序列如下：

[0078] Mex F：GATATCGTTT AAACGCTCTT CCTGCATCAC GGGAGAT

[0079] Mex R：TGAGGCCTGA GTTCAGACCG GT

[0080] B、目的片段的克隆：

[0081] 以带有Mex的质粒为模板，进行PCR扩增：模板1μl，上下游引物10μM各1μl，2.5mM的dNTP底物4μl，10倍缓冲液5μl，pfu聚合酶1μl，双蒸水37μl；95℃变性2分钟；然后94℃变性30秒、55-65℃退火30秒、72℃延伸50秒，进行30-40个循环；最后72℃延伸7-10分钟；

[0082] C、扩展产物纯化：

[0083] PCR产物经1％琼脂糖电泳分离后，可见一条约647bp的扩增条带，将目的条带切下，用公司琼脂糖凝胶纯化试剂盒进行纯化，方法是：

[0084] C-1、从琼脂糖凝胶中将PCR产物DNA条带切下，转入离心管中，加入2倍体积的结合缓冲液，55℃下温浴7分钟使得凝胶溶解；

[0085] C-2、将离心管中溶解的凝胶溶液转移到试剂盒自带的DNA吸附柱中，13000转/分钟离心2分钟；

[0086] C-3、向DNA吸附柱中加入700μl漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液，再加入500μl漂洗液，13000转/分钟离心2分钟；弃去漂洗液后，13000转/分钟离心2分钟，室温放置5分钟；

[0087] C-4、将DNA吸附柱加入一个新的离心管中，加入65℃预热的洗脱缓冲液70μl，13000转/分钟离心2分钟，离心管底的溶液即为回收的PCR产物DNA片段。

[0088] 如图1所示，可以看到500bp到750bp之间有一个明显的条带，条带大小与预期的647bp大致相等，与预期相符，表明Mex序列PCR成功。

[0089] D、pMex真核表达载体的构建：

[0090] D-1、酶切：将载体用SmaI酶切，酶切的片段和载体经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收的方法是：在反应体系中加入10倍缓冲液2μl，SmaI1μl，载体5μl，无离子水12μl，37℃水浴4个小时。

[0091] D-2、连接：回收的Mex片段和载体用T4连接美俄进行体外连接反应方法是：在反应体系中加入回收的PCR产物DNA片段8μl和载体片段2μl，10倍缓冲液2μl，T4DNA连接酶1μl，去离子水7μl，16℃反应10h。

[0092] D-3、转化大肠杆菌：将连接产物转化入大肠杆菌感受态细胞中，在含有氨苄青霉素100μl/ml的LB培养基上37℃培养12-16小时，方法是：

[0093] a、取连接产物10μL加到50μL的感受态细胞中，轻轻摇匀，冰浴30min.[0094] b、42℃热激90s,快速转到冰浴2-3min,注意不要摇动管。

[0095] c、向管中加入500μL的LB培养基，150rmp,37℃，45min.

[0096] d、将菌液全部涂到LB平板上，含100ug/ml Amp.

[0097] e、将平板正置直至液体全部吸收。

[0098] f、倒置平板，于37℃培养12－16h.

[0099] D-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒，方法是：

[0100] a.挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，150rpm，摇床培养12～16hr。

[0101] b.取1-1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，4℃，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4℃保存。

[0102] c.将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μl冰预冷的碱裂解液Ⅰ中，漩涡震荡，使细菌悬浮均匀。

[0103] d.细菌重悬液中加入200μl碱裂解液Ⅱ，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(<5min)。

[0104] e.加入150μl冰预冷的碱裂解液Ⅲ,上下翻转离心管8次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并将离心管置于冰上1～3min,4℃，13000rpm离心5min，将～400μl的上清转移至另一个离心管中。

[0105] f.加400μl酚:氯仿(V:V＝1:1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取上清于新离心管中。

[0106] g.用2～2.5体积的乙醇(850μl)室温沉淀核酸，混合均匀，室温静置2min。13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。

[0107] h.加1ml左右70％乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心1min。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。

[0108] i.打开离心管，室温静置3～5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。

[0109] j.加50μl TE缓冲液(含20μg/ml RNase A)于离心管中，静置5min，温和震荡混匀。贮存于-20℃。

[0110] D-5、酶切鉴定和测序，证实得到的序列是真核表达质粒，方法是：

[0111] 在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5μl，10倍缓冲液2μl，限制性内切酶SpeI1μl，去离子水13μl，37℃反应2h；

[0112] 如图2所示，经过SpeI酶切后，可以切出1.3kb和5.3kb两个条带，与预期相符，表明Mex片段已正确的插入到载体当中；

[0113] E、得到IRES-EGFP序列：

[0114] 在质粒中利用BamHI和NotI双酶切得到IRES-EGFP序列，并经1％的琼脂糖凝胶电泳分离后，可见一条约1300bp的条带，将目的条带切下，用Gel Extraction Kit DNA纯化试剂盒进行纯化

[0115] 如图3所示，经过BamHI和NotI酶切，载体大小为6.6kb，IRES-EGFP序列为1.3kb，与预期大小相符。

[0116] F、pGreen Max真核表达载体的构建：

[0117] F-1、酶切：将载体用BamHI和NotI双酶切，酶切后的载体片段经1％琼脂糖凝胶电泳分离后切胶回收。方法是：在反应体系中加入10倍缓冲液2μl，BamHI1μl，NotIμl，pMex载体5μl，无离子水12μl，37℃水浴4个小时。

[0118] F-2、连接：回收的IRES-EGFP片段和载体用T4连接酶进行体外连接反应，方法是：在反应体系中加入回收的DNA片段8μl和载体片段2μl，10倍缓冲液2μl，T4DNA连接酶
1μl，去离子水7μl，16℃反应10h。

[0119] F-3、转化大肠杆菌：将连接的产物转入大肠杆菌感受态细胞中，在含氨苄霉素100μl/ml的LB培养基上37℃培养12-16小时；

[0120] F-4、筛选重组真核表达载体的阳性克隆：将菌落放大培养，纯化提取质粒；

[0121] F-5、利用HindIII进行酶切鉴定和测序，证实得到序列1的pMex真核表达质粒。方法是：在反应体系中加入提取的重组真核表达载体5μl，10倍缓冲液2μl，限制性内切酶HindIII1μl，去离子水13μl，37℃反应2h；

[0122] 如图4所示，用1％琼脂糖凝胶电泳分离后鉴定pGreen Max1的目的条带，经过HindIII酶切，可以切出三个条带，分别是4.9kb、2.9kb和230bp的条带，与预期条带相符，表明IRES-EGFP序列已经正确插入到pMex载体当中。

[0123] 进行重组真核表达载体的测序，测序结果显示该重组真核表达载体的序列1大小为，在与Mex、IRES-EGFP序列完全一致，说明成功构建了命名为pGreen Max1真核表达载体，如序列1所示。

[0124] 实施例2

[0125] 真核表达载体的表达蛋白

[0126] A、重组真核表达载体的获得

[0127] 以蛋白A和蛋白B为例来进行说明。

[0128] A-1、得到含有蛋白A和抗体B的重组载体

[0129] 通过PCR等技术获得蛋白A和抗体B的序列，利用T4DNA连接酶的体外连接，得到含有蛋白A和抗体B的重组载体。

[0130] A-2、重组表达载体的提取与纯化

[0131] 用于转染的pGreen Max1重组蛋白A和pGreen Max1重组抗体B的质粒用质粒小量抽提的方法进行提取与纯化，具体操作步骤如下：

[0132] a.挑取转化后的单菌落，接种到2ml含有氨苄青霉素(100μg/ml)的LB培养基中，37℃，150rpm，摇床培养12～16hr。

[0133] b.取1-1.5ml培养物倒入1.5ml离心管中，4℃，13000rpm离心30s，弃上清，然后再短暂离心，用枪头将离心管底部少量残液吸出弃掉。剩余菌液4℃保存。

[0134] c.将细胞沉淀漩涡震荡打散后，重悬于100μl冰预冷的碱裂解液Ⅰ中，漩涡震荡，使细菌悬浮均匀。

[0135] d.细菌重悬液中加入200μl碱裂解液Ⅱ，上下翻转离心管5次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，置于冰上(<5min)。

[0136] e.加入150μl冰预冷的碱裂解液Ⅲ,上下翻转离心管8次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀，并将离心管置于冰上1～3min,4℃，13000rpm离心5min，将～400μl的上清转移至另一个离心管中。

[0137] f.加400μl酚:氯仿(V:V＝1:1)，震荡充分混合有机相和水相，13000rpm离心2min，取上清于新离心管中。

[0138] g.用2～2.5体积的乙醇(850μl)室温沉淀核酸，混合均匀，室温静置2min。13000rpm离心5min。小心的把上清倒掉；然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出弃掉。

[0139] h.加1ml左右70％乙醇于沉淀中，颠倒离心管数次，洗涤管壁与沉淀，如沉淀偏离管底需13000rpm离心1min。小心的把上清倒掉，然后再短暂离心，用枪头把离心管底部少量残液小心的吸出(若沉淀漂浮，用枪头将其置于离心管底部)。

[0140] i.打开离心管，室温静置3～5min，使乙醇充分挥发，直至离心管内没有可见的液体存在。

[0141] j.加50μl TE缓冲液(含20μg/ml RNase A)于离心管中，静置5min，温和震荡混匀。贮存于-20℃。

[0142] B、蛋白A重组真核表达载体和抗体B重组真核表达载体在293T细胞中的分泌表达

[0143] 转染腺病毒E1A基因的人肾上皮细胞系293T细胞培养与含有10％FCS(胎牛血清)的DMEM完全培养液中，转染前将细胞均匀的铺在10cm培养皿中，具体步骤按照PEI介导的细胞转染实验进行：

[0144] 1、分别将DNA和PEI加入无抗生素、无血清的DMEM培养液1ml中混匀，然后将两液混合成转染液，室温放置10-20分钟；

[0145] 2、吸弃培养皿中的培养液，用无抗生素无血清的DMEM培养液轻轻洗两次，加入3ml无抗生素无血清的DMEM培养液；

[0146] 3、按蛋白A重组表达载体10μg/皿，将转染液逐滴加入培养皿中，置于5％二氧化碳、37℃培养箱中培养4-6小时后，置换无血清培养基继续培养24-48小时后，手机细胞培养上清；

[0147] 4、取转染上清，用浓度为10％的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，通过免疫印记(Western Blot)检测蛋白A和抗体B的分泌表达情况。

[0148] 如图5所示，转染以后，细胞中可以表达绿荧光蛋白，可以用于细胞株的筛选。

[0149] 如图6所示，转染以后，在细胞的上清中可以检测到蛋白A的表达。表明载体构建成功并可以应用。

[0150] 如图7所示，蛋白为抗体B的蛋白。蛋白大小为19kD左右。通过图片可以很好的看出细胞上清中含有该抗体并且可以很好的检测出该蛋白，表明该载体可以应用。

[0151] 上述实施例pGreen Max1真核表达载体作为在真核细胞中获取目的蛋白或抗体的应用，用于制备大量所需目的蛋白以进行临床前研究，并为高产哺乳动物细胞株的筛选提供蛋白表达及筛选的标记，为蛋白高效表达提供了很好的载体，也为细胞株的筛选提供一种新的方法和便利。