一种重组人胰岛素的制备方法

摘要

本发明公开了一种重组人胰岛素的制备方法，包括如下步骤：在有机溶液与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，得到含有desB30人胰岛素溶液；从含有desB30人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末；使用desB30人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB30人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为12.1mM～33mM，desB30人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB30人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～80：1；将重组人胰岛素酯脱酯，即得重组人胰岛素。本方法适合酵母表达的胰岛素原转化成人胰岛素的工业化生产，收率高，而且操作简单，成本低。

权利要求

1.一种重组人胰岛素的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)在有机溶剂与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，得到含有desB30人胰岛素溶液；

(2)从含有desB30人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末；

(3)使用desB30人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB30人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为12.1mM～33mM；

(4)将重组人胰岛素酯脱酯，即得重组人胰岛素；

步骤(1)中所述的有机溶剂的浓度为体积百分比0.1～30％；

所述的有机溶剂为异丙醇或乙醇。

2.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤(1)为：在有机溶剂与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，酶切的条件为将pH值调节为

7～9，于20～30℃反应，得到含有人胰岛素B链第30位缺少苏氨酸的人胰岛素溶液；其中，胰蛋白酶与重组人胰岛素前体按质量比1：50～500配比。

3.根据权利要求2所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的反应的时间为1～8小时；

步骤(1)中所述的pH值用氨水调节；

所述的胰蛋白酶与所述的重组人胰岛素前体按质量比1：300配比。

4.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述的离心或抽滤之前，先对含有desB30人胰岛素的溶液进行沉淀。

5.根据权利要求4所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：所述的对含有desB30

2+

人胰岛素的溶液进行沉淀的方式为调节pH值之后静置沉淀，或是先加入Zn ，再调节pH值，之后静置沉淀。

6.根据权利要求5所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：所述的pH值为

5.6～6；

所述的调节pH值的试剂可以为磷酸、醋酸和氨水中一种或至少两种；

2+ 2+

所述的Zn 的用量按desB30人胰岛素与Zn 的摩尔比为1：0.5～1.5进行计算添加；

所述的静置的温度为4～8℃。

7.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述的转肽反应包括如下步骤：用二甲基亚砜溶解苏氨酸酯或其衍生物，以及desB30人胰岛素含水粉末，再加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液或是只加入胰蛋白酶水溶液，获得转肽的反应体系；然后搅拌进行反应；

desB30人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB30人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～80：1。

8.根据权利要求7所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：所述的苏氨酸酯为o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯；

所述的衍生物指的是o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐类衍生物；

所述的反应体系中溶剂的比例为二甲基亚砜：1,4-丁二醇：水按体积比15％～50％：

0～65％：20％～50％；其中水的含量中包含了desB30人胰岛素含水粉末中包含的水分。

9.根据权利要求1所述的重组人胰岛素的制备方法，其特征在于：步骤(4)中所述的脱酯为采用三氟乙酸试剂进行脱酯。

说明书

一种重组人胰岛素的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于胰岛素制备领域，特别涉及一种重组人胰岛素的制备方法。

背景技术

[0002] 目前，据国际糖尿病联盟2011年统计，全球糖尿病患病人数为3.66亿，预计2030年将达到5.52亿，相当于每十秒钟增加一名糖尿病患者，或者每年增加一千万名患者。在我国，糖尿病的患病率在近10年翻了近两倍。2010年，我国成人糖尿病的患病率为9.7%，患者总数已超过9000万，成为世界第一糖尿病大国;同时，糖尿病前期的糖耐量受损人群达到了1亿4千8百万人，患病率为15.5%。所以用胰岛素治疗糖尿病市场巨大。

[0003] 目前临床应用中，胰岛素是降低体内血糖最有效的药物，一型糖尿病患者和严重的二型糖尿病患者都必须注射胰岛素，补充胰岛素以控制血糖的水平，提高患者的生活质量的同时降低糖尿病并发症的发生。我国胰岛素的市场95%的由国外厂商垄断，价格比较昂贵，严重影响到我国糖尿病用药的安全；同时由于国外公司把持我国胰岛素市场，导致胰岛素在我国糖尿病患者的使用率较低。为了打破国外厂商对于我国胰岛素市场的垄断，提高国产重组人胰岛素的竞争优势，势必需要对现有的重组人胰岛素生产工艺进行革新，以降低生产成本。

[0004] 目前重组人胰岛素及其类似物的生产采用了两套系统，其一是用酵母系统（CN1414974A；CN1873006A；CN1125081C）；其二 是用大 肠杆菌 系统（CN1163600C；CN1011073006A）。酵母系统采用了分泌人胰岛素原类似物的方式，分泌出来的人胰岛素前体已具有了天然的二硫键及正确的N-端。缺点在于酵母菌生长慢，导致生产周期长，且表达水平很低。应用大肠杆菌表达重组人胰岛素生产的方式主要包括三种方式：一种是美国礼来公司1982年采用的重组大肠杆菌分别表达胰岛素的A链和B链，表达产物经溴化氰（bromine cyanide,CNBr）切下融合导肽片段后，得到的A链和B链经纯化后再进行复性，最后得到有活性的重组人胰岛素。由于该方式的复性率只有10%左右，采用这条工艺生产的胰岛素成本太高。第二种也是美国礼来公司建立的，目前仍然是诸多公司生产重组人胰岛素的主要方式。由于正常序列的人胰岛素原（B-C-A）在大肠杆菌中不稳定而容易降解，通常采用融合蛋白的形式，将人胰岛素原接在一个较大的N-端融合蛋白后面，大大增加了胰岛素原的表达量（10%-30%）（Castellanos-Serra,et al.1996;Tikhonov,et al.2001），表达产物通过溴化氰释放出人胰岛素原。由于C肽的存在，胰岛素原能形成良好的空间构象，折叠率达到70%，从而在一定程度上降低了胰岛素的生产成本。第三种方式是丹麦诺和诺德公司采用的A、B链同时表达的方法，在A链前端和A、B链中间均有甲硫氨酸。表达产物经溴化氰处理，得到A链和B链，再经过复性和纯化得到有活性的重组人胰岛素，这种方式与第一种方式存在着同样的因为复性效率带来的成本问题。

[0005] 巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是目前进行胰岛素前体表达来进行胰岛素生产的热点，也是近十年来受到广大研究者的青睐。主要原因是：一、该表达系统同时兼有原核表达系统和真核表达系统的优点；二、培养操作容易，生长速度快，表达量高，产物不会过度糖基化，蛋白抗原性低。

[0006] 虽然，用毕赤酵母表达生产重组人胰岛素前体量高，但是最重要的步骤是转肽，该步骤最为明显的是成本高、收率低、时间长，要想产品有竞争力，降低成本、提高收率将是我们转肽重点。

[0007] 在已经报道的文献中，转肽反应都是在少水的有机相中一步进行完成的。常用的有机溶剂：DMF（N、N-二甲基甲酰胺）、DMA（N、N-二甲基乙酰胺）、DMSO（二甲基亚砜）、1,4-丁二醇、THF（四氢呋喃）或二氧六环等。为了提高收率减少转肽反应时间，叔丁醚苏氨酸叔丁酯与重组人胰岛素前体的摩尔比达到近100：1甚至更高。而胰蛋白酶与重组人胰岛素前体的质量比也将近1：5，虽然加的酶量很高，但是转肽反应时间一般都要10小时以上，也是因为反应时间长反应生产出来的杂质也很多，这样对后序纯化带来了麻烦和压力，同时使整个下游工序成本升高，收率降低。

[0008] 在国家发明专利申请CN102703552A中披露了采用两步法代替一步法的胰岛素生产工艺的具有提高的转化效率，降低整个生产工艺的成本。但是工艺开发过程中，采用了两次冻干的工艺，不适合工业的放大和成本的降低，另外转肽反应中胰岛素的浓度比较低，为2.5～10mM。在专利CN100424179C中也提到了采用先酶切后转肽的思路，其酶切后的产物不需要分离，其具有技术上的优势，但是从酶切体系转换成转肽体系中，需要添加入大量的有机化合物，同时也降低了转肽反应的胰岛素浓度（约5mM）。

发明内容

[0009] 为克服现有技术的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种重组人胰岛素的制备方法。本发明所要解决的技术问题是改进目前重组人胰岛素制备过程中多步骤、转肽率低、高成本、不稳定等缺点。采用新改进制备工艺进行生产，上下游连接顺畅、步骤少、成本低、转肽率高、稳定。此方法已经从实验阶段投放到生产中验证并得到预期的效果。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：一种重组人胰岛素的制备方法，包括以下步骤：

[0011] （1）在有机溶剂与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，得到含有人胰岛素B链第30位缺少苏氨酸的人胰岛素（desB30人胰岛素）溶液；

[0012] （2）从含有desB30人胰岛素的溶液，离心或抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末；

[0013] （3）使用desB30人胰岛素含水粉末进行转肽反应，得到人胰岛素酯；其中，desB30人胰岛素在转肽反应体系中的终浓度为12.1mM～33mM；该步骤是将desB30人胰岛素的B29位赖氨酸C末端转接一个叔丁醚苏氨酸叔丁酯；

[0014] （4）将重组人胰岛素酯脱酯，即得重组人胰岛素。

[0015] 步骤（1）中所述的有机溶剂在所述的混合溶液中的浓度为体积百分比0.1～30%；优选为体积百分比5～30%；

[0016] 所述的有机溶剂为可作为反相色谱洗脱流动相的有机溶剂，优选为异丙醇或乙醇；

[0017] 步骤（1）优选为：在有机溶剂与水的混合溶液中对重组人胰岛素前体进行酶切反应，酶切的条件为将pH值调节为7～9，于20～30℃反应，得到含有人胰岛素B链第30位缺少苏氨酸的人胰岛素溶液；其中，胰蛋白酶与重组人胰岛素前体按质量比1：50～500配比；

[0018] 所述的反应的时间优选为1～8小时；更优选为3～8小时；

[0019] 所述的重组胰岛素前体优选为通过采用基因工程技术用于毕赤酵母菌株进行分泌表达的重组人胰岛素前体，或是来自原核细胞（大肠杆菌）表达的包涵体、复性后得到的重组人胰岛素前体；

[0020] 所述的pH值优选用氨水调节；更优选使用5mol/L的氨水调节；

[0021] 所述的酶切条件优选为将pH值调节为8.5，于25℃反应3小时；

[0022] 所述的胰蛋白酶与所述的重组人胰岛素前体优选按质量比1：300配比；

[0023] 步骤（2）中所述的离心或抽滤之前，先对含有desB30人胰岛素的溶液进行沉淀；

[0024] 所述的对含有desB30人胰岛素的溶液进行沉淀的方式优选为调节pH值之后静置2+
沉淀，或是先加入Zn ，再调节pH值，之后静置沉淀；

[0025] 所述的pH值为5.6～6，更优选为5.8；

[0026] 所述的调节pH值的试剂可以为磷酸、醋酸和氨水中的一种或至少两种；优选为3mol/L的磷酸溶液；

[0027] 所述的Zn2+可由氯化锌或硫酸锌提供，优选氯化锌；

[0028] 所述的Zn2+的用量按desB30人胰岛素与Zn2+的摩尔比为1：0.5～1.5进行计算添加；

[0029] 所述的静置的温度优选为4～8℃；

[0030] 步骤（2）中所述的抽滤的条件优选为减压抽滤；所述的抽滤中使用的滤膜优选为300目；

[0031] 步骤（3）中所述的转肽反应优选包括如下步骤：用二甲基亚砜溶解苏氨酸或其衍生物，以及desB30人胰岛素含水粉末，再加入1,4-丁二醇和胰蛋白酶水溶液或是只加入胰蛋白酶水溶液，获得转肽的反应体系；然后温和搅拌进行反应；desB30人胰岛素与苏氨酸酯或其衍生物的摩尔比为1：15～150，desB30人胰岛素与胰蛋白酶按质量比为10～80：1；

[0032] 所述的苏氨酸酯优选为o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯；

[0033] 所述的衍生物指的是o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐类衍生物，如o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯盐酸盐；

[0034] 所述的反应体系中溶剂的比例优选为二甲基亚砜：1,4-丁二醇：水按体积比15%～50%：0～65%：20%～50%；其中水的含量中包含了desB30人胰岛素含水粉末中包含的水分，通过水分测定仪或者干燥失重的方式测定；

[0035] 所述的搅拌反应的时间优选为1～8小时，温度优选为25±1℃。

[0036] 步骤（4）中所述的脱酯为采用三氟乙酸试剂进行脱酯；

[0037] 步骤（4）中所述的脱酯的具体步骤为：将胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥；采用丙酮溶解和抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。

[0038] 本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

[0039] （1）在保证重组人胰岛素高质量的前提下，降低重组人胰岛素的成本、提高收率。本发明采用了酶切得到的desB30人胰岛素含水粉末，再转肽脱脂得到重组人胰岛素。克服现有技术中先冻干再转肽的复杂老工艺，同时提高了反应的过程中重组人胰岛素前体的浓度，降低了胰蛋白酶和苏氨酸酯的用量，减少了转肽的成本，提高了设备的使用效率。

[0040] （2）在有机溶剂与水的混溶液酶切中到desB30人胰岛素，酶切率超过95%，并且24小时内无出现其他杂质。通过转肽反应生成重组人胰岛素酯，其转肽效率超过85%。

附图说明

[0041] 图1是HPLC检测实施例1中的重组人胰岛素前体被酶切的效果图；其中，图a为重组人胰岛素的前体的HPLC检测图，图b为重组人胰岛素的前体酶切后的HPLC检测图。

[0042] 图2是HPLC检测实施例1的转肽效果图；其中，图a、图b、图c、图d和图e分别为0、2、4、6和8小时的转肽取样HPLC检测图谱图。

[0043] 图3是实施例1的重组人胰岛素酯质谱图。

[0044] 图4是实施例1的重组人胰岛素质谱图。

[0045] 图5是实施例1的重组人胰岛素酯脱酯后与重组人胰岛素标准品对比图；其中，图a和图b分别为重组人胰岛素标准品和脱酯后样品的HPLC检测图谱。

具体实施方式

[0046] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0047] 实施例1

[0048] （1）desB30人胰岛素含水粉末的制备：毕赤酵母分泌表达的重组人胰岛素前体，大孔吸附树脂纯化后（参考文献：高剑坤，财绍皙，范开等，含短C肽人胰岛素原类似物desB30在毕赤酵母中的表达与纯化，生物化学与生物物理进展，2008,35（1）：63-68）的样品溶液，稀释2倍后进行反相纯化，采用异丙醇进行梯度洗脱，得到含有异丙醇（浓度为体积百分比24%）的重组人胰岛素前体水溶液（HPLC检测图谱如图1a所示），用5M氨水调pH值为8.5。
按胰蛋白酶与重组人胰岛素前体质量比1：300的比例加入胰蛋白酶，于25℃酶切3小时，得到酶切的溶液，经HPLC检测重组酶切率为97.55%（HPLC检测图谱如图1b所示）。按重组人胰岛素前体与氯化锌摩尔比1：1加入氯化锌，然后用3M的磷酸溶液调节pH值为5.8，
4～8℃放置过夜，使用300目的滤膜抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末，采用水分测定仪测水分和HPLC检测其含量。

[0049] （2）以desB30人胰岛素为17mM的反应浓度进行转肽反应，得到重组人胰岛素酯：用二甲基亚砜溶解步骤（1）得到的desB30人胰岛素含水粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐，再加入1,4-丁二醇，最后加入胰蛋白酶水溶液，得到转肽液。其中desB30人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：15，desB30人胰岛素与胰蛋白酶的质量比为20:1，水（desB30人胰岛素含水粉末中的水分和胰蛋白酶水溶液中的水的总和）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为20%：40%：40%。整个转肽溶液在25±1℃下温和搅拌反应，在0、2、4、6、8小时分别取样，0、2、4、6、8小时的转肽效率分别是0%、76.03%、88.02%、91.82%、90.66%。HPLC检测的图谱分别如图2中的a～e所示。

[0050] 反应8小时后得到含重组人胰岛素酯的溶液，用pH3.0的磷酸水溶液将其稀释5倍。重组人胰岛素酯经反相纯化得到高纯度浓缩的样品，经质谱测定分子量为5925，与理论分子量一致（质谱检测结果见图3）。

[0051] （3）脱酯：将胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥。采用丙酮溶解和真空抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。经质谱测定其分子量为5708与理论分子量一致（质谱检测结果见图4），将实施例1生产制备的重组人胰岛素和重组人胰岛素标准品（中国食品药品检定研究院购买）相同条件下HPLC检测，比较出峰时间完全吻合（如图5所示），说明本实施例中获得的重组人胰岛素与重组人胰岛素标准品具有相同的结构。

[0052] 实施例2

[0053] （1）desB30人胰岛素含水粉末的制备：将实施例1中的重组人胰岛素前体水溶液稀释至异丙醇的浓度为体积百分比10%，用5M氨水调pH值为9。按胰蛋白酶与重组人胰岛素前体1：400的质量比加入胰蛋白酶，于25℃酶切5小时。经检测重组人胰岛素前体酶切率为95.31%。按人胰岛素前体与氯化锌1：1.5的摩尔比加入氯化锌，用3M磷酸溶液调节pH值为5.8，4～8℃放置过夜，使用300目的滤膜抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末，并测水分和含量。

[0054] （2）以desB30人胰岛素为13.4mM的反应浓度进行转肽反应，得到重组人胰岛素酯：用二甲基亚砜溶解desB30人胰岛素含水粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐，再加入1,4-丁二醇，最后加入胰蛋白酶水溶液。其中desB30人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：100，desB30人胰岛素与胰蛋白酶的质量比为10：1，水（desB30人胰岛素含水粉末中的水分和胰蛋白酶水溶液中的水总和）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比50%：40%：10%。整个转肽溶液在25±1℃下温和搅拌反应，在2、4、6小时分别取样，HPLC检测分析样品。2、4、6小时的转肽效率分别是87.12%、89.51%、87.68%。

[0055] （3）脱酯：反应6小时后得到含重组人胰岛素酯的溶液，用pH3.0的磷酸水溶液将其稀释5倍。重组人胰岛素酯经反相纯化得到高纯度浓缩的样品，胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥。采用丙酮溶解和真空抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。

[0056] 实施例3

[0057] （1）desB30人胰岛素含水粉末的制备：实施例1中的重组人胰岛素前体反相纯化时用乙醇进行洗脱，将洗脱液稀释至乙醇浓度为体积百分比30%，用5M氨水调节pH值为8.5，按胰蛋白酶与重组人胰岛素前体1：300的质量比加入胰蛋白酶，于25℃酶切6小时。经检测重组人胰岛素前体酶切率为96.07%。按人胰岛素前体与氯化锌1：0.5的摩尔比加入氯化锌，用3M磷酸调节pH5.80，4～8℃放置过夜，8000g离心得到desB30人胰岛素含水粉末。测定其水分和含量。

[0058] （2）以desB30人胰岛素为12.1mM的反应浓度进行转肽反应，得到重组人胰岛素酯：用二甲基亚砜溶解desB30人胰岛素含水粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐溶解，再加入胰蛋白酶水溶液。其中desB30人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：120，desB30人胰岛素与胰蛋白酶的质量比为20:1，水（desB30人胰岛素含水粉末中的水分和胰蛋白酶水溶液中的水的总和）和二甲基亚砜的体积比50%、50%。整个转肽溶液在25±1℃下温和搅拌反应，在2、4、6、8小时分别取样，HPLC检测分析样品。2、4、6、8小时的转肽效率分别是83.58%、84.11%、87.76%、86.60%。

[0059] （3）脱酯：反应8小时得到含重组人胰岛素酯的溶液，用pH3.0的磷酸水溶液将其稀释5倍。重组人胰岛素酯经反相纯化得到高纯度浓缩的样品。胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥。采用丙酮溶解和真空抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。

[0060] 实施例4

[0061] （1）desB30人胰岛素含水粉末的制备：将实施例1中重组人胰岛素前体水溶液稀释至异丙醇浓度为20%，用5M氨水调节pH值为8.0，按胰蛋白酶与重组人胰岛素前体1：500的的质量比加入胰蛋白酶，于20℃酶切8小时，经检测重组人胰岛素前体酶切率为94.75%。用3M磷酸溶液调节pH值为5.6，4～8℃放置过夜，使用300目的滤膜抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末，测定水分和含量。

[0062] （2）以desB30人胰岛素为33mM的反应浓度进行转肽反应，得到重组人胰岛素酯：用二甲基亚砜溶解desB30人胰岛素含水粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐溶解，再加入1,4-丁二醇，最后加入胰蛋白酶水溶液。其中desB30人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：150，desB30人胰岛素与胰蛋白酶的质量比为
80:1，水（desB30人胰岛素含水粉末中的水分和胰蛋白酶水溶液中的水的总和）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为30%：15%：55%。整个转肽溶液在25±1℃下温和搅拌反应，在2、
4、6、8小时分别取样，HPLC检测分析样品。2、4、6、8小时的转肽效率分别是75.04%、84.05%、
89.42%、87.46%。

[0063] （3）脱酯：反应8小时得到含重组人胰岛素酯的溶液，用pH3.0的磷酸水溶液将其稀释5倍。重组人胰岛素酯经反相纯化得到高纯度浓缩的样品。胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥。采用丙酮溶解和真空抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。

[0064] 实施例5

[0065] （1）desB30人胰岛素含水粉末的制备：将实施例1中的重组人胰岛素前体水溶液稀释至异丙醇浓度为体积百分比5%，用5M氨水调节pH值为7.5。按胰蛋白酶与重组人胰岛素前体1：200的质量比加入胰蛋白酶，于20℃酶切6小时。经检测重组人胰岛素前体酶切率为96.49%。按人胰岛素前体与氯化锌1：1.2的摩尔比加入氯化锌，用3M磷酸溶液调节pH值为5.8，4～8℃放置过夜，抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末，并测水分和含量。

[0066] （2）以desB30人胰岛素为25mM的反应浓度进行转肽反应，得到重组人胰岛素酯：用二甲基亚砜溶解desB30人胰岛素含水粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐溶解，再加入1,4-丁二醇，最后加入胰蛋白酶水溶液。其中desB30人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：150，desB30人胰岛素与胰蛋白酶的质量比为
40:1，水（desB30人胰岛素含水粉末中的水分和胰蛋白酶水溶液中的水的总和）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为40%：30%：30%。整个转肽溶液在20℃下温和搅拌反应，在2、4、
6、8小时分别取样，HPLC检测分析样品。2、4、6、8小时的转肽效率分别是81.39%、82.56%、
87.22%、85.97%。

[0067] （3）脱酯：反应8小时得到含重组人胰岛素酯的溶液，用pH3.0的磷酸水溶液将其稀释8倍。重组人胰岛素酯经反相纯化得到高纯度浓缩的样品。胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥。采用丙酮溶解和真空抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。

[0068] 实施例6

[0069] （1）desB30人胰岛素含水粉末的制备：将实施例1中的重组人胰岛素前体水溶液加入异丙醇至异丙醇终浓度为体积百分比30%，用5M氨水调节pH值为7。按胰蛋白酶与重组人胰岛素前体1：50的质量比加入胰蛋白酶，于30℃酶切4.0小时。经检测重组人胰岛素前体酶切率为97.22%。按人胰岛素前体与氯化锌1：1.5的摩尔比加入氯化锌，用3M磷酸溶液调节pH5.8，4～8℃放置过夜，抽滤得到desB30人胰岛素含水粉末，并测水分和含量。

[0070] （2）以desB30人胰岛素为12.1mM的反应浓度进行转肽反应，得到重组人胰岛素酯：用二甲基亚砜溶解desB30人胰岛素含水粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐溶解，再加入1,4-丁二醇，最后加入胰蛋白酶水溶液。其中desB30人胰岛素与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：30，desB30人胰岛素与胰蛋白酶的质量比为30:1，水（desB30人胰岛素含水粉末中的水分和胰蛋白酶水溶液中的水）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比为20%：15%：65%。整个转肽溶液在25℃下温和搅拌反应，在2、4、6、8小时分别取样，HPLC检测分析样品。2、4、6、8小时的转肽效率分别是79.60%、82.97%、85.70%、85.69%。

[0071] （3）脱酯：反应8小时得到含重组人胰岛素酯的溶液，，用pH3.0的磷酸水溶液将其稀释5倍。重组人胰岛素酯经反相纯化得到高纯度浓缩的样品。胰岛素酯等电点沉淀后，冷冻干燥。采用丙酮溶解和真空抽离丙酮后，按1g胰岛素酯：5ml三氟乙酸的量将胰岛素酯溶解后，真空抽离多余的三氟乙酸，即得重组人胰岛素。

[0072] 对比例1一步转肽方法

[0073] 实施例1中的重组人胰岛素前体水溶液溶液，冷冻干燥后获得重组人胰岛素前体的冻干粉末，测定其含量。

[0074] 以重组人胰岛素前体为6.7mM的反应浓度进行转肽。用二甲基亚砜溶解重组人胰岛素前体冻干粉末和o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐溶解，再加入1,4-丁二醇，最后加入胰蛋白酶水溶液。其中重组人胰岛素前体与o-叔丁基醚-l-苏氨酸叔丁酯醋酸盐的摩尔比为1：35，重组人胰岛素前体与胰蛋白酶的质量比为10:1，水（胰蛋白酶水溶液中的水）、二甲基亚砜和1,4-丁二醇的体积比15%、15%、70%。整个转肽溶液在25℃下温和搅拌反应，在2、4、6小时分别取样，HPLC检测分析样品。2、4、6小时的转肽效率分别是25.00%、43.13%、68.60%。

[0075] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。