本发明涉及一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，包括：锈斑蟳基因组DNA的提取并稀释备用；设计5’锚定引物及PCR扩增；扩增产物的克隆及测序；序列分析及微卫星特异引物设计；使用引物对锈斑蟳不同个体的基因组DNA进行PCR扩增；使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。本发明操作简单，安全，阳性率高，结果真实可靠，可快速获得锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。主要应用于锈斑蟳遗传变异分析及种群遗传多样性研究。
1.一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，包括：（1）提取锈斑蟳基因组DNA并稀释备用；
（4）微卫星分子标记序列分析及微卫星特异引物设计；其中，微卫星分子标记及其对应的特异引物序列如下所示：Cfe-1标记：如SEQ ID NO:1所示；
F：ATGCTTGCTATTATTTTCTACTG；
R：TTATACACCAATCTATATTAATTTC；
R：AAAACCCTGAGAAAGGATTGCA；
R：GACTTAAACTCCCTTTGCTACCTG；
（5）使用引物对锈斑蟳不同个体的基因组DNA进行PCR扩增；
（6）使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；
（7）根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。
2.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（1）中的提取锈斑蟳基因组DNA包括以下步骤：剪取锈斑蟳肌肉组织100-150mg，置于
500μL组织提取液中剪碎，加入终浓度为20mg/mL的蛋白酶K和终浓度为100μg/mL的RNase A，55℃消化2-3个小时；用体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇混合液抽提两次；
然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保存在-20℃备用。
3.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（2）中的设计5’锚定引物包括以下步骤：设计含有兼并碱基及重复碱基的引物，其中重复碱基部分为2个碱基6次重复、3或4个碱基4次重复，用于与基因组DNA中的重复碱基结合；
采 用 的 引 物 有 PCT6：5’-KKVRVRV(CT)6-3’；PGT6：5’-KKRVRVR(GT)4-3’；PCAC4：
所述的PCR扩增包括以下步骤：每个5’锚定引物以锈斑蟳基因组DNA为模板进行PCR
扩增，反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、5’锚定引物终浓度为0.8μmol/L、Mg终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。
4.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（3）中的克隆及测序包括以下步骤：首先是将回收的PCR产物连接到pMD19-T载体+中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，接种到LB Amp培养基中生长，再利用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-1000bp的阳性克隆利用ABI3730自动测序仪进行测序。
5.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（4）中的微卫星分子标记应用于锈斑蟳遗传变异分析及种群遗传多样性研究。
6.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（5）中的PCR扩增的反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、上下游引物终浓
度均为0.4μmol/L、Mg 终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶
0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于
7.根据权利要求1所述的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，其特征在于：所述步骤（6）中的凝胶电泳检测具体为：将PCR产物95℃变性后，上样3μL于6%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；经染色、显色后获得了锈斑蟳的PCR产物电泳图像。
一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法
技术领域
[0001] 本发明属于锈斑蟳微卫星分子标记领域，特别涉及一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法。
背景技术
[0002] 微卫星DNA(Microsatellite DNA)几乎存在于所有真核生物基因组中，由1-6个核苷酸组成的简单序列重复(Simple Sequence Repeats，SSR)，是近十几年发展起来的一种新型分子标记技术。微卫星具有数量多、随机分布、多态性高、重复性强、呈共显性遗传及操作简单等优点，被广泛地应用于群体遗传多样性分析、种质资源保护与管理、遗传连锁图谱构建及QTL定位等领域中。
[0003] 国内外学者已在大多数的重要水产养殖动物中开发了微卫星标记。如：GUO等开发了大黄鱼的6个多态微卫星标记；李绍戊等开发了团头鲂的19个微卫星标记；马洪雨等报道了圆斑星鲽的40个多态微卫星标记和条斑星鲽的31个多态微卫星标记；Wang等开发了太平洋牡蛎的17个EST来源的多态微卫星标记；ELFSTROM等开发了扇贝的16个微卫星标记；Yap等筛选到梭子蟹的8个多态微卫星标记；An等筛选了中华绒螯蟹的9个微卫星标记。这些多态微卫星标记已经被广泛地应用到群体遗传结构分析、亲缘关系鉴定、遗传连锁图谱构建等研究中。
[0004] 锈 斑 蟳(Charybdis feriatus) 属 节 肢 动 物 门 (Arthropoda)、甲 壳 纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)、梭子蟹科(Portunidae)、蟳属(Charybdis)，主要分布于太平洋、印度洋的热带、亚热带和温带沿岸，在我国主要分布于东南沿海各省，是我国重要的海洋渔业资源。为了鉴定和保护在我国广泛分布的锈斑蟳资源，有必要对其种群遗传结构和遗传多样性进行研究。微卫星标记是开展该方面研究的理想标记，但目前未有锈斑蟳微卫星标记可用，这种状况限制了锈斑蟳相关遗传学研究的开展。因此，非常有必要开发锈斑蟳微卫星分子标记。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是提供一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，该方法操作简单、快速、准确、灵敏等优点，一周内可完成一个过程，大大提高了筛选微卫星标记的效率。
[0006] 本发明的一种锈斑蟳微卫星分子标记的筛选方法，包括：
[0007] （1）提取锈斑蟳基因组DNA并稀释备用；
[0008] （2）设计5’锚定引物及PCR扩增；
[0009] （3）克隆扩增产物及测序；
[0010] （4）微卫星分子标记序列分析及微卫星特异引物设计；其中，微卫星分子标记及其对应的特异引物序列如下所示：
[0011] Cfe-1标记：如SEQ ID NO:1所示；
[0012] Cfe-1标记的特异引物序列：
[0013] F：ATGCTTGCTATTATTTTCTACTG；
[0014] R：GAGCAAATTAAGATTGACTGA；
[0015] Cfe-2标记：如SEQ ID NO:4所示；
[0016] Cfe-2标记的特异引物序列：
[0017] F：GAGTGGTAATGGGAGCAAATG；
[0018] R：TCCACATGCTCGTAAAACAAA；
[0019] Cfe-3标记：如SEQ ID NO:7所示；
[0020] Cfe-3标记的特异引物序列：
[0021] F：GGGATGTAAGACAATGTGAAC；
[0022] R：TTATACACCAATCTATATTAATTTC；
[0023] Cfe-4标记：如SEQ ID NO:10所示；
[0024] Cfe-4标记的特异引物序列：
[0025] F：ACCAGCCGTAATGCAGAACAC；
[0026] R：AAAACCCTGAGAAAGGATTGCA；
[0027] Cfe-5标记：如SEQ ID NO:13所示；
[0028] Cfe-5标记的特异引物序列：
[0029] F：CTTCCCCTTGGATGACGCTC；
[0030] R：GACTTAAACTCCCTTTGCTACCTG；
[0031] （5）使用引物对锈斑蟳不同个体的基因组DNA进行PCR扩增；
[0032] （6）使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测PCR扩增产物；
[0033] （7）根据扩增产物的不同迁移距离确定每个个体的基因型，从而获得锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。
[0034] 所述步骤（1）中的提取锈斑蟳基因组DNA包括以下步骤：剪取锈斑蟳肌肉组织100-150mg，置于500μL组织提取液中剪碎，加入终浓度为20mg/mL的蛋白酶K和终浓度为
100μg/mL的RNase A，55℃消化2-3个小时；用体积比为25：24：1的酚、氯仿和异戊醇混合液抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于TE中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保存在-20℃备用。
[0035] 所述步骤（2）中的设计5’锚定引物包括以下步骤：设计含有兼并碱基及重复碱基的引物，其中兼并碱基部分具有锚定作用，防止引物与模板的结合发生滑动，重复碱基部分为2个碱基6次重复、3或4个碱基4次重复，用于与基因组DNA中的重复碱基结合；
[0036] 采用的引物有PCT6：5’-KKVRVRV(CT)6-3’；PGT6：5’-KKRVRVR(GT)4-3’；PCAC4：5’-KKBDDBD(CAC)4-3’；
[0037] 所述的PCR扩增包括以下步骤：每个5’锚定引物以锈斑蟳基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、5’锚定引物终浓度为0.8μmol/L、2+
Mg 终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；用
1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。
[0038] 所述步骤（3）中的克隆及测序包括以下步骤：首先是将回收的PCR产物连接到+pMD19-T载体中，然后转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，接种到LB Amp培养基中生长，再利用载体通用引物和PCR扩增法鉴定阳性克隆，挑取插入片段大小在250-1000bp的阳性克隆利用ABI3730自动测序仪进行测序。
[0039] 所述步骤（4）中的微卫星分子标记序列分析及微卫星特异引物设计包括以下步骤：首先利用生物学软件DNAMAN4.0对所获得的所有序列进行比对分析，去掉相同的序列；然后利用生物学软件SSRHUNTER1.3查找含有微卫星核心重复的序列；再利用BLAST方法搜索这些微卫星序列在GenBank数据库中是否存在相同的序列，并去掉那些相同的序列；最后利用生物学软件Primer Premier5.0对含有完整侧翼区的微卫星序列进行引物设计。
[0040] 所述步骤（4）中的微卫星分子标记应用于锈斑蟳遗传变异分析及种群遗传多样性研究。
[0041] 所述步骤（5）中的PCR扩增的反应体系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、上下2+
游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg 终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：
94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸7分钟。
[0042] 所述步骤（6）中的凝胶电泳检测具体为：将PCR产物95℃变性后，上样3μL于6%的聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳；经染色、显色后获得了锈斑蟳的PCR产物电泳图像。
[0043] 本发明包括锈斑蟳三种微卫星富集文库（CT）n、(GT)n、(CAC)n的构建，阳性克隆的鉴定及测序，序列分析及微卫星引物的设计，最终获得5个扩增条带清晰的多态性的微卫星标记，将这5个多态性标记用于锈斑蟳不同个体的遗传学分析，获得锈斑蟳的遗传变异的多态性图谱。
[0044] 有益效果
[0045] （1）本发明的方法操作简单、快速、准确、灵敏等优点，一周内可完成一个过程，大大提高了筛选微卫星标记的效率；
[0046] （2）本发明简单、快捷的制备锈斑蟳的微卫星标记，一次可获得几百、甚至上千条微卫星序列，并且所获得的大多数的微卫星序列均可设计引物，本发明主要应用于锈斑蟳遗传变异分析及种群遗传多样性研究。
附图说明
[0047] 图1为筛选的引物Cfe-1对锈斑蟳30个个体的检测图谱，其中M是分子量标准，1-30为锈斑蟳个体。
具体实施方式
[0048] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
[0049] 实施例1
[0050] 1、锈斑蟳基因组DNA的提取
[0051] 剪取锈斑蟳肌肉组织(100-150mg)，置于500μL组织提取液(10mmol/L Tris-Cl,pH8.0；100mmol/L EDTA,pH8.0;100mmol/L NaC；0.5%SDS)的中剪碎，加入蛋白酶K（终浓度为20mg/ml）和RNase A(终浓度为100μg/mL)，充分混匀，55℃消化2-3个小时至澄清；用酚、氯仿和异戊醇混合液(体积比为25:24:1)抽提两次；然后用2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，经70%乙醇洗涤和自然干燥后，溶解于50μL TE(10mmol/L Tris-HCl,pH8.0;10mmol/L EDTA,pH8.0)中；最后将DNA浓度稀释为100ng/μL，并保存在-20℃备用。
[0052] 2、设计5’锚定引物及PCR扩增
[0053] 设计含有兼并碱基及重复碱基的引物，其中兼并碱基部分具有锚定作用，防止引物与模板的结合发生滑动，重复碱基部分为2个碱基6次重复、3或4个碱基4次重复，用于与基因组DNA中的重复碱基结合；采用的引物有PCT6：5’-KKVRVRV(CT)6-3’，PGT6：5’-KKRVRVR(GT)4-3’，PCAC4：5’-KKBDDBD(CAC)4-3’，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。
[0054] PCR扩增是每个5’锚定引物以锈斑蟳基因组DNA为模板进行PCR扩增，反应体2+
系为25μL，包括基因组DNA模板1μL、5’锚定引物终浓度为0.8μmol/L、Mg 终浓度为
1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶0.75U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度退火50秒、72℃延伸50秒，30个循环；最后于72℃延伸7分钟；用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测预扩增产物，并回收大小在250-800bp之间的扩增产物。
[0055] 3、T载体连接
[0056] 将上述回收的PCR扩增产物连接到T载体中，连接体系为10μL,包括solution I5.0μL、pMD19-T载体(TaKaRa公司产品)1.0μL及PCR扩增产物4.0μL，4℃过夜。
[0057] 4、克隆、测序
[0058] 将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α中，使用载体通用引物(M13-47：5’–CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC–3’;M13-48：5’–AGCGGATAACAATTTCACACAGGA–3’)对克隆进行PCR鉴定。PCR反应体系为25μL，包括菌液1μL、上下游引物终浓度均为0.4μmol/
2+
L、Mg 终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为25μL；PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、55℃退火50秒、72℃延伸50秒，25个循环；最后于72℃延伸7分钟。最后，挑选插入片断长度在250-1000bp之间的阳性克隆，用ABI3730测序仪进行测序。
[0059] 5、微卫星引物设计
[0060] 首先使用软件SSRHUNTER1.3查找含有微卫星核心重复的序列，查找标准为：2-5个碱基重复单元、重复次数≥4次。然后利用生物学软件Primer Premier5.0对含有完整侧翼序列的微卫星序列进行引物设计。引物应符合以下标准：(1)引物长度在18-25bp之间；(2)GC含量在40-60%之间；(3)退火温度在48-60℃之间；(4)PCR产物的预期长度在130-350bp之间。引物信息详见表1。
[0061] 6、微卫星标记的PCR扩增
[0062] 利用上述微卫星引物对锈斑蟳群体进行PCR扩增，其反应体系为25μL，包括基因2+
组DNA模板1μL、上、下游引物终浓度均为0.4μmol/L、Mg 终浓度为1.5mmol/L、dNTP终浓度为0.2mmol/L、Taq DNA聚合酶1U、1×PCR buffer，最后补充灭菌双蒸水至总体积为
25μL。PCR反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性30秒、引物特异的退火温度(表1)退火50秒、72℃延伸50秒，35个循环；最后于72℃延伸7分钟，4℃保存备用。
[0063] 7、PCR产物的电泳检测
[0064] 向PCR产物中加入约1/2体积的变性剂(98.0%甲酰胺，10mmol/L EDTA，0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯氰)，于95℃变性5分钟，快速冷却；然后上样约3μl于6%的变性聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳。分子量标准为pBR322/MspI,电泳液为1×TBE，恒压35-40V/cm，电泳约1-1.5小时。
[0065] 电泳完成后进行染色和显色，其操作过程为：首先用70%乙醇固定10分钟，蒸馏水洗5分钟；然后用1.5‰硝酸银染色10分钟，蒸馏水洗8秒钟；最后用显色液(2%的NaOH+4‰的甲醛)显色至带型清晰，再用蒸馏水将凝胶冲洗干净，便获得了锈斑蟳遗传变异的多态性图谱。
[0066] 表1本发明所筛选的锈斑蟳的5个微卫星标记
[0067]
