本发明公开了一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，包括种球预处理和消毒灭菌、鳞片接种、脱分化培养、再分化形成脱毒幼苗以及幼苗的驯化及移栽，其中，所述种球预处理和消毒包括将选用的种球置于4℃下低温保存30天；所述脱分化过程采用蓝光照射；所述脱分化培养中所用的培养基，其中生长素类物质和细胞分裂素类物质浓度比为1:1；所述再分化过程中，愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml。本发明解决了郁金香在培育过程中易受病毒、害虫等侵扰，导致其品质不断退化，甚至死亡等问题，同时培育周期大大缩短。
1.一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，具体步骤如下：
选用外表无损伤的种球，用保鲜膜包裹郁金香种球，置于4℃中预冷处理30天，将经过低温保存的种球自然升温至室温，剥去种球外层表皮，用无菌解剖刀切去黄化老死的部分，然后用洗洁精洗净表面污物，自来水冲洗20分钟，充分洗净残留的洗洁精，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒10分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次4分钟；
用无菌解剖刀切除种球尖端开口部分，再纵切种球，取内层鳞片为材料，用灼烧灭菌后的刀片将鳞片切割成按大小均为1mm²的小鳞片，按凸面向上进行接种，将小鳞片移入到灭菌后的培养基中；
将接有小鳞片的培养基繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8-12天后，形成愈伤组织；
将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织转移到再分化培养基中培养，再分化培养在人工气候箱中进行，具体培养条件：温度设定为25℃，相对湿度设定为80%，光照强度设置为
1700lux，光照12h/d；在再分化培养基中培养2周后，待愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml，继续在相同的条件下继续培养直至形成胚状体、幼苗；
待郁金香幼苗形成后，将幼苗移栽在灭菌处理后的营养土中，从生态气候箱中移到无菌光照培养架上，再逐渐移到实验外环境中，待其能正常生长之后，将其移栽到土壤中正常培养；
所述的脱分化培养所用的培养基为MT培养基，其配方及配制方法为： NH4NO3 为780 mg/L，KNO3为1000 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MnO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.3 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，萘乙酰胺0.4mg/L，吲哚丁酸0.6mg/L和2,4-D1.0mg/L，四氢吡喃苄基腺嘌呤0.7mg/L，6-苄基腺嘌呤0.7mg/L，KT-30为0.6mg/L，蔗糖25g/L，琼脂条10g/L，pH为6.6；
所述的再分化过程所用的培养基配方为：NH4NO3 为1700mg/L，KNO3为1900 mg/L，CaCl2·2H2O为440 mg/L，MgSO4·7H2O为400 mg/L，KH2PO4为170 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MnO4·2H2O为
0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.025 mg/L，CoCl2·6H2O为0.025 mg/L，FeSO4·7H2O为27.8 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇100 mg/L，烟酸0.5 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，吲哚丁酸0.25 mg/L，2,4,5-T 为0.2mg/L，6-苄基腺嘌呤0.7mg/L，蔗糖10g/L，丙酸1ml，琼脂条10g/L，pH为6.6。
一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种郁金香组织培养的方法，具体涉及一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法。
[0002] 背景介绍
[0003] 郁金香原产地中海南北沿岸及中亚细亚和伊朗、土耳其、东至中国的东北地区等地，其为百合科郁金香球根花卉。目前全世界约有2000多种郁金香品种，被大量生产的大约只有150种左右。由于郁金香的花色优美、高雅脱俗、清新隽永，令人百看而不厌，深受人们的厚爱，被视为园林观赏花卉的首选。传统苗圃工艺常采用分球繁殖法进行繁殖，但通过此种方法获得郁金香幼苗周期较长，同时由于郁金香球茎在生长过程中易被病毒、害虫侵食，培育得到的郁金香幼苗大多受到病毒、病害等因素的干扰，导致其品质不断退化，甚至死亡等现象，如何培育出品质不会退化、不受病毒侵害的郁金香育苗变得尤为重要，目前人们利用组织培养技术虽然能够获得郁金香脱毒幼苗，但周期相对较长，并且实验成功率较低。因此需要寻求一种高效高郁金香脱毒幼苗的培育方法。
发明内容
[0004] 针对上述现有技术存在的问题，本发明的提供了一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，可很好的免受病毒、病害因素的干扰，且培养周期短，成功率高。
[0005] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明采取的技术方案为：一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，其特征在于，包括种球预处理和消毒灭菌、鳞片接种、脱分化培养、再分化形成脱毒幼苗以及幼苗的驯化及移栽，其中，所述种球预处理和消毒包括将选用的种球置于4℃下低温保存30天；所述脱分化过程采用蓝光照射；所述脱分化培养中所用的培养基，其中生长素类物质和细胞分裂素类物质浓度比为1:1；所述再分化过程中，愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml。
[0006] 所述的一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，具体步骤如下：
[0007] 1）种球预处理和消毒灭菌
[0008] 选用外表无损伤的种球，用保鲜膜包裹郁金香种球，置于4℃中预冷处理30天，将经过低温保存的种球自然升温至室温，剥去种球外层表皮，用无菌解剖刀切去黄化老死的部分，然后用洗洁精洗净表面污物，自来水冲洗20分钟，充分洗净残留的洗洁精，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒10分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次4分钟；
[0009] 2）鳞片接种
[0010] 用无菌解剖刀切除种球尖端开口部分，再纵切种球，取内层鳞片为材料，用灼烧灭菌后的刀片将鳞片切割成按大小均为1mm²的小块，按凸面向上进行接种，将小碎片移入到灭菌后的培养基中；
[0011] 3）脱分化培养
[0012] 将接有小鳞片的培养基繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8-12天后，形成愈伤组织；
[0013] 4）再分化形成脱毒幼苗
[0014] 将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织转移到再分化培养基中培养，再分化培养在人工气候箱中进行，具体培养条件：温度设定为25℃，相对湿度设定为80%，光照强度设置为1700lux，光照12h/d；在再分化培养基中培养2周后，待愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml，继续在相同的条件下继续培养直至形成胚状体、幼苗。
[0015] 5）幼苗的驯化及移栽
[0016] 待郁金香幼苗形成后，将幼苗移栽在灭菌处理后的营养土中，从生态气候箱中移到无菌光照培养架上，再逐渐移到实验外环境中，待其能正常生长后，移栽到土壤中正常培养。
[0017] 进一步地，所述的脱分化培养所用的培养基为MT培养基，其配方及配制方法为： NH4NO3 为780 mg/L，KNO3为1000 mg/L，CaCl2·2H2O为350 mg/L，MgSO4·7H2O为370 mg/L，KH2PO4为175 mg/L，KI为0.83 mg/L，H3BO3为6.2 mg/L，MnSO4·4H2O为22.3 mg/L，ZnSO4·7H2O为8.6 mg/L，Na2MnO4·2H2O为0.25 mg/L，CuSO4·5H2O为0.023 mg/L，CoCl2·6H2O为0.023 mg/L，FeSO4·7H2O为28.1 mg/L，Na2-EDTA·2H2O为37.3 mg/L，肌醇200 mg/L，烟酸0.5 mg/L，盐酸吡哆醇0.3 mg/L，盐酸硫胺素0.1 mg/L，维生素B6为0.5 mg/L，维生素B1为0.1 mg/L，甘氨酸2.0 mg/L，生长素类物质1.0-2.5mg/L，细胞分裂素类物质1.0-2.5mg/L，蔗糖25g/L，琼脂条10g/L，pH为6.6。
[0018] 进一步地，所述生长素类物质为吲哚乙酸、吲哚丙酸、吲哚丁酸，萘乙酸、萘乙酸钠、萘氧乙酸、萘乙酰胺、2,4-D、2,4,5-T、4-碘苯氧乙酸或2,4-D丁酯中的至少三种以上的组合。其中，所述的2,4-D即2,4-二氯苯氧乙酸，所述的2,4,5-T即2,4,5三氯苯酚代乙酸，2,4-D丁酯为2，4-二氯苯氧乙酸丁酯。
[0019] 进一步地，MT培养基中所述生长素类物质为萘乙酸0.5mg/L，6-苄氨基嘌呤0.5mg/L和2,4-D 1.0mg/L的混合。
[0020] 进一步地，所述细胞分裂素类物质为玉米素、还有玉米素核苷、二氢玉米素、异戊烯基腺嘌呤、激动素、6-苄基腺嘌呤、四氢吡喃苄基腺嘌呤、二苯脲或KT-30中的至少三种以上的组合。其中KT-30的化学名为1-(2-氯-4-吡啶基)-3’-苯基脲。
[0021] 进一步地，MT培养基中所述细胞分裂素类物质为：四氢吡喃苄基腺嘌呤0.7mg/L，6-苄基腺嘌0.7mg/L和KT-30为0.6mg/L的混合物。
[0022] 进一步地，所述的再分化过程所用的培养基配方为(mg/L)：NH4NO3 1700，KNO31900，CaCl2·2H2O 440，MgSO4·7H2O 400，KH2PO4 170，KI 0.83，H3BO3 6.2，MnSO4·4H2O 22.3，ZnSO4·7H2O 8.6，Na2MnO4·2H2O 0.25，CuSO4·5H2O 0.025，CoCl2·6H2O 0.025，FeSO4·7H2O
27.8，Na2-EDTA·2H2O 37.3，肌醇100，烟酸0.5，维生素B6 0.5，维生素B1 0.1，甘氨酸2.0，吲哚丁酸0.25，2,4,5-T 为0.2mg/L，6-苄基腺嘌呤0.7mg/L，蔗糖10g/L，丙酸1ml，琼脂条
10g/L，pH为6.6。
[0023] 本发明所述的一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，与现有技术相比其有益效果为：
[0024] 1、通过选用外表无损伤的种球，用保鲜膜包裹郁金香种球，用无菌解剖刀切去黄化老死的部分，然后用洗洁精洗净表面污物，以及利用0.1%升汞和70%-75%酒精联合使用对种球进行灭菌消毒处理，能够有效减少脱分化培养过程中受微生物污染的几率，提高实验成功率；
[0025] 2、种球经过低温处理，并且脱分化是采用蓝光照射，大大缩短了愈伤组织形成时间，并提高了愈伤组织成功率；
[0026] 3、设计了一种郁金香诱导脱分化培养基，通过改变生长素种类以及细胞分裂素的种类组合和浓度配比，将脱分化培养基中的生长素类物质和细胞分裂素类物质比例调为1:1，可以有效避免愈伤组织褐化、生根等现象，有效地提高了愈伤组织形成的成功率；
[0027] 4、在诱导愈伤组织再分化形成脱毒郁金香小苗时，先控制再分化培养基中吲哚丁酸或2,4,5-T 0.25-0.5mg/L，6-苄基腺嘌呤0.5-1.0mg/L，到培养2周后，待愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分化培养基表面加入1.5mg/L吲哚丁酸或2,4,5-T 1-2ml，有大大提高愈伤组织再分化形成脱毒小苗的成功率，平均成功率能达到90%；
[0028] 5、通过改变诱导培养郁金香种球和愈伤组织再分化形成脱毒小苗的培养条件，能够有效获得愈伤组织和脱毒小苗，能够明显缩短郁金香组织培养培育周期，同时获得性状优良、无病毒害侵扰的郁金香幼苗。
具体实施方式
[0029] 以下结合具体实施方式，对本发明进行详细说明。
[0030] 实施例1
[0031] 一种由郁金香鳞片获得脱毒幼苗的方法，具体步骤如下：
[0032] 1）种球预处理和消毒灭菌
[0033] 选用外表无损伤的种球，用保鲜膜包裹郁金香种球，置于4℃中预冷处理30天，将经过低温保存的种球自然升温至室温，剥去种球外层表皮，用无菌解剖刀切去黄化老死的部分，然后用洗洁精洗净表面污物，自来水冲洗20分钟，充分洗净残留的洗洁精，然后首先经过重量比为0.1%的升汞中消毒10分钟，再浸泡在体积比为75%的酒精中灭菌13秒，取出后用无菌水反复冲洗3次，每次4分钟；
[0034] 2）鳞片接种
[0035] 用无菌解剖刀切除种球尖端开口部分，再纵切种球，取内层鳞片为材料，用灼烧灭菌后的刀片将鳞片切割成按大小均为1mm²的小块，按凸面向上进行接种，将小碎片移入到灭菌后的培养基中；
[0036] 3）脱分化培养
[0037] 将接有小鳞片的培养基繁殖在人工气候箱中进行脱分化培养，具体培养条件：温度设定为27℃，相对湿度设定为80%，采用蓝光进行照射，光照强度设置为300lux，光照12h/d，处理8-12天后，形成愈伤组织；
[0038] 4）再分化形成脱毒幼苗
[0039] 将步骤3）脱分化培育出的愈伤组织转移到再分化培养基中培养，再分化培养在人工气候箱中进行，具体培养条件：温度设定为25℃，相对湿度设定为80%，光照强度设置为1700lux，光照12h/d；在再分化培养基中培养2周后，待愈伤组织开始形成嫩芽后，向再分
