一种大环内酯化合物在植物霜霉病防治中的应用

摘要

本发明涉及以下式（1）表示的Hypothemycin在植物的植株以及采后果实的霜霉病防治中的应用。通过实验证实Hypothemycin可以显著抑制荔枝霜疫霉、烟草疫霉菌的生长，对瓜果腐霉和甜瓜疫霉也表现出了一定的抑制活性，另外Hypothemycin对采后荔枝果实霜疫霉病感染有明显的抑制作用，对采后荔枝腐烂有明显的抑制效果。

权利要求

1.以下式（1）表示的化合物在植物的植株以及采后果实的霜霉病防治中的应用：式（1），

所述的霜霉病致病菌是荔枝霜疫霉Peronophythora litchii，烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae，甜瓜 疫霉Phytophthora melonis或瓜 果腐霉 Pythium aphanidermatum。

说明书

一种大环内酯化合物在植物霜霉病防治中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种大环内酯化合物Hypothemycin的新用途，具体来说涉及其在植物的植株以及采后果实的霜霉病防治方面的新用途。

背景技术

[0002] 植物霜霉病通常泛指由卵菌纲霜霉目的腐霉菌、霜霉菌、疫霉菌和霜疫霉菌等病原菌引起的植物病害，其重要特征之一就是在病害严重或湿度合适时产生明显可见的霜状霉（即病原菌的孢子囊和子囊梗）。其中在国内比较广泛流行的包括有瓜果腐霉、甜瓜疫霉和荔枝霜疫霉等。

[0003] 瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum）是一种重要的植物病原真菌，世界广布种，常致使各类农作物发生腐烂、猝倒，也经常造成果蔬采后腐败变质，给农业生产和食品工业造成巨大损失。它可为害油菜(油菜猝倒病)、大豆(大豆猝倒病)、小白菜(白菜猝倒病)、花椰菜(花菜猝倒病)、菠菜(菠菜猝倒病)、空心菜(蕹菜猝倒病)、黄瓜(黄瓜绵腐病)、毛豆(菜用大豆猝倒病)、甜菜(甜菜丛根病)、烟草(烟草猝倒病)、棉花(棉苗猝倒病)、青花菜(青花菜幼苗猝倒病)、球茎茴香(茴香猝倒病)、落葵(落葵苗腐病)、苦瓜(苦瓜猝倒病)、西葫芦(西葫芦绵腐病)等植物的幼苗及果实，引起幼苗猝倒和果实腐烂。在潮湿条件下病部表面长出发达的白色棉絮状霉层。

[0004] 甜瓜疫霉（Phytophthora melonis Katsura），又称掘氏疫霉P．drechsleri Tucker，其寄主广泛，包括甜瓜、苦瓜、甜菜、马铃薯、番茄、西瓜、黄瓜、葫芦、南瓜等葫芦科及茄科作物的叶片、茎和果实。其中果实染病多始于接触地面处，初生暗绿色水渍状圆形斑，之后病部凹陷迅速扩展为暗褐色大斑，湿度大时长出白色短棉毛状霉，干燥条件下产生白霜状霉。

[0005] 荔枝霜疫霉(Peronophythora litchi Chen ex Koet a1．)是荔枝霜疫霉病(又称霜霉病)的主要病原菌，是广西、广东、福建等省区荔枝的主要病害之一。此病主要危害接近成熟荔枝果实，亦可危害青果、果柄、结果的小枝。发病初期在果皮表面产生褐色或灰黑色不规则病斑，无明显边缘。在温度较高、湿度较大时，病斑速度扩展，使果壳大部分或全部变黑，果肉腐烂、渗出酒酸味的汁液，造成烂果及落果。该病是造成荔枝果实采后腐烂的最重要病害之一。

[0006] 防治霜霉病主要措施包括选育抗病品种、加强栽培管理、做好病害流行的预测和发病初期及时喷药进行化学防治等措施。目前防治霜霉病的化学药剂有铜剂、有机硫剂、百菌清、乙磷铝和甲霜灵等。

[0007] 由于传统的化学合成药剂容易使病原菌产生抗药性，长期使用造成药效减弱，且在环境中不易分解，残留药剂会流失到周围环境中去，对农林业生态系统及人类健康造成危害。而天然产物对防治对象多有较高选择性，对人、畜和有益生物相对安全，环境污染较小，是近年植物病害防治研究的重点之一。

[0008] Hypothemycin是来自真菌的次生代谢产物的一种β-雷琐酸大环内酯衍生物，其结构由以下式（1）表示：

[0009]

[0010] Hypothemycin的结构于1980年首次被报道（文献1：Nair M S R.Tetrahedron Letters，1980，21:2011-2012），并发现其其对玉米黑粉病菌（Ustilago maydis，冬孢菌纲，黑粉菌目，黑粉菌属，黑粉菌科）和葱腐葡萄孢（Botrytis allii，盘菌纲,蜡钉菌目,葡萄孢盘菌属,核盘菌科）具有一定的抑制活性（文献2：Nair M S R.Tetrahedron，1981,37：2445）。后来的研究和报道主要集中在抗肿瘤活性方面（文献3：Tanaka H.Jpn J Cancer Res，1999，90：1139；文献4：Schirmer A.Proc Natl Acad Sci，2006，103：4234）和抗疟活性（文献5：Isaka M.J Org Chem，2002，67：1561）。目前尚未见用于植物（特别是采后果实）霜霉病防治方面的报道。

发明内容

[0011] 本发明的目的在于开发出Hypothemycin在植物的植株以及采后果实的霜霉病防治方面的用途。

[0012] 我们通过对植物霜霉病常见致病菌——荔枝霜疫霉、瓜果腐霉、甜瓜疫霉和烟草疫霉菌的体外抑制活性实验发现式(1)表示的Hypothemycin对荔枝霜疫霉、瓜果腐霉、甜瓜疫霉和烟草疫霉有明显的抑制活性，从而实现了本发明的目的。

[0013] 本发明的式(1)表示的Hypothemycin可用于植物的植株以及采后果实的霜霉病防治，尤其是对荔枝霜疫霉、烟草疫霉、甜瓜疫霉或瓜果腐霉致霜霉病的防治。

[0014] 本发明式（1）化合物可以单独制成药物作为抗霜霉病菌剂使用，也可以与其它抗霜霉病菌剂合用，以增强抗菌效果或降低其毒副作用、降低成本。本发明式（1）化合物的药物组合可以是固体形式，如粉剂、颗粒剂、脂质体等，其固体载体可以是无毒、生物可降解的、亲水性或疏水性物质，也可以是液体形式，如溶液、乳浊液、混悬液等，其液体载体可以是水、亲水性或疏水性有机溶剂及其各种比例在水中的混合物。

[0015] 本发明的式(1)表示的Hypothemycin的制备方法包括以下步骤：

[0016] (1)将拟青霉Paecilomyces sp.SC0924CGMCC No.2900在大米固体培养基上，黑暗中于24～28℃静置培养10～30天，得到固体发酵培养物，所述的大米固体培养基由质量比1:1的大米和水组成，所述的拟青霉Paecilomyces sp.SC0924CGMCC No.2900已于2009年2月12日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，已公开于专利申请200910037639.6中；

[0017] (2)将得到的固体发酵培养物用乙醇浸提3次，每次24h，将乙醇水溶液减压浓缩除去乙醇后，用氯仿萃取3次，萃取物浓缩得到氯仿提取物；

[0018] (3)将氯仿提取物进行硅胶柱层析，以体积比100:0～80:20的氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，然后用正相硅胶柱层析和重结晶对合并后的流份进行分离纯化，得到产物，经结构分析确定为上述式（1）表示的Hypothemycin。

[0019] 通过体外抑制活性实验证实Hypothemycin可以显著抑制荔枝霜疫霉和烟草疫霉菌的生长，抑菌圈宽度分别为20mm和18mm，Hypothemycin对瓜果腐霉和甜瓜疫霉也表现出了一定的抑制活性，抑菌圈宽度分别为5mm和8mm。通过Hypothemycin对采后荔枝果实活体抑菌试验，证实Hypothemycin对采后荔枝果实霜疫霉病感染有明显的抑制作用。通过Hypothemycin对采后未接种病原菌的荔枝果实活体抑菌试验，证实Hypothemycin对采后荔枝腐烂有明显的抑制效果。

具体实施方式

[0020] 以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。

[0021] 实施例1：本发明式（1）表示的化合物的制备

[0022] 将拟青霉Paecilomyces sp.SC0924CGMCC No.2900菌种接种在11.50L大米固体培养基（质量比1:1的大米和水）上，黑暗中于26℃静置培养22天得到固体发酵培养物。将得到的固体发酵培养物用1.5倍体积的95%乙醇浸提3次，每次24h，将乙醇水溶液减压浓缩除去乙醇后，用等体积氯仿萃取3次，萃取物浓缩得到氯仿提取物97.50g。

[0023] 将氯仿提取物进行硅胶柱层析，以体积比100:0～80:20的氯仿-甲醇混合溶剂进行梯度洗脱，用薄层层析检测合并相似的流份，收集薄层板上石油醚-丙酮体积比1:1展开时比移值0.5～0.8的流份，合并后经正相硅胶柱层析，以体积比90:10～50:50的石油醚-丙酮梯度洗脱，合并石油醚-丙酮体积比60:40～55:45洗脱部分用甲醇重结晶得到无色结晶7.50g。通过光谱分析和比对文献，确定所得无色结晶为式(1)表示的Hypothemycin。

[0024] 它的正离子ESIMS m/z379[M+H]+，401[M+Na]+；负离子ESIMS m/z377[M–H]，– 1 13413[M+Cl] ；H NMR（溶剂：氘代氯仿）和 C NMR（溶剂：氘代吡啶）数据见表1。

[0025]

[0026] 实施例2：实施例1得到的Hypothemycin的对植物霜霉病常见致病菌——荔枝霜疫霉、瓜果腐霉、甜瓜疫霉和烟草疫霉菌的体外抑制活性实验

[0027] 实验用瓜果腐霉Pythium aphanidermatum购自中国农业微生物菌种保藏管理中心，荔枝霜疫霉Peronophythora litchii、甜瓜疫霉Phytophthora melonis和烟草疫霉菌Phytophthora nicotianae由华南农业大学资环学院潘汝谦博士提供。

[0028] 以滤纸片琼脂扩散法测定化合物Hypothemycin的抗霜霉病菌活性：将活化好的荔枝霜疫霉、瓜果腐霉、甜瓜疫霉和烟草疫霉菌等4种植物霜霉病致病菌分别接种到装有PDA固体培养基的培养皿中，用T型涂布器涂均匀备用；待测试样品Hypothemycin以丙酮溶解，配成20mg/mL，实验时实验取20μL滴加到滤纸片（直径为6mm）上，于超净工作台上晾干，使每滤纸片最终含有样品400μg，然后将滤纸片贴放于上述培养皿中，25℃，黑暗条件下培养72h后测量抑菌宽度（抑菌宽度为滤纸片边缘至菌落边缘的垂直距离），实验设三次重复，以加入等体积丙酮的滤纸片作阴性对照。

[0029] 结果显示Hypothemycin可以显著抑制荔枝霜疫霉和烟草疫霉菌的生长，抑菌圈宽度分别为20mm和18mm。Hypothemycin对瓜果腐霉和甜瓜疫霉也表现出了一定的抑制活性，抑菌圈宽度分别为5mm和8mm。

[0030] 实施例3：实施例1得到的Hypothemycin对采后荔枝贮藏中霜疫霉的抑制活性实验

[0031] 供试样品：实施例1得到的Hypothemycin以少量乙醇溶解,用去离子水稀释为100、200、300μg/mL，乙醇最终浓度为体积分数2.5%。

[0032] 测试菌液：荔枝霜疫霉在PDA培养基中培养3天，加入去离子水冲洗表面孢子，于显微镜下计数并稀释成每mL约含106个孢子的菌液备用。

[0033] 供试荔枝：荔枝品种“淮枝”（Litchi chinesis Sonn.cv.Huaizhi）采自广东省从化市，采后即时运回实验室，4h内开始处理。选取大小一致，无病虫害、成熟度约为8.5成（果皮大部分红色，龟裂沟尚有部分黄色，内果皮白色或微红）果实，用体积分数75%乙醇浸泡3分钟，取出用纯净水冲洗2次，晾干后分组处理。其中：B1（对照）组：将荔枝浸泡于体积分数0.25%乙醇的干燥器中，减压（75kPa）处理3分钟，取出晾干后，在果皮赤道位置用刀片划出1个“+”小口，马上接种菌液10μL。B2、B3和B4组：将荔枝浸泡于100、200和300μg/mL的Hypothemycin溶液中，减压（75kPa）处理3分钟，取出晾干后，在果皮赤道位置用刀片划出1个“+”小口，马上接种菌液10μL。每个处理荔枝不少于72个，晾干后分装放入塑料盒中（每盒6个），26°C贮藏3天和5天，观察并记录其感病指数，感病指数计算方法为：0为无明显感染；1为轻微感染；2为感染面积为果实的≤1/4；3为感染面积为果实的1/4-1/2；4为感染面积≥1/2，感病指数=∑（感病等级×相应果实数量）/（4×果实总数量）×100%。

[0034] 实验结果如表2所示：

[0035] 表2Hypothemycin对采后荔枝果实贮藏中对霜疫霉的抑制活性

[0036]

[0037] 实施例4：实施例1得到的Hypothemycin对未接种病原菌荔枝腐烂的抑制试验[0038] 供试样品：实施例1得到的Hypothemycin以少量乙醇溶解,用去离子水稀释为100、200、300μg/mL，乙醇最终浓度为体积分数2.5%。

[0039] 供试荔枝：荔枝品种“淮枝”（Litchi chinesis Sonn.cv.Huaizhi）采自广东省从化市，采后即时运回实验室，4h内开始处理。选取大小一致，无病虫害、成熟度约为8.5成（果皮大部分红色，龟裂沟尚有部分黄色，内果皮白色或微红）果实。其中：A1（对照）组：将荔枝浸泡于0.25%乙醇的干燥器中，减压（75kPa）处理3分钟，取出晾干。A2、A3和A4组：将荔枝浸泡于100、200和300μg/mL的Hypothemycin溶液中，减压（75kPa）处理3分钟，取出晾干。每个处理荔枝为36个，晾干后分装放入塑料盒中（每盒6个），26°C贮藏3天和5天，观察并记录其感病指数，感病指数计算方法同实施例3。

[0040] 实验结果如表3所示：

[0041] 表3Hypothemycin对未接种病原菌的采后荔枝腐烂的抑制效果

[0042]