猪IFNɑ1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法转让专利
申请号 : CN201310274978.2
文献号 : CN103319608B
文献日 : 2014-08-27
发明人 : 马永 , 钱林 , 徐春林 , 陈晨 , 王耀方
申请人 : 江苏众红生物工程创药研究院有限公司 , 常州京森生物医药研究所有限公司
摘要 :
本发明提供了一种依据家蚕反应系统优化的猪IFNα1-Fc编码基因及其表达的融合蛋白和利用家蚕生物反应器表达猪IFNα1-Fc融合蛋白的方法，属于生物基因工程领域。猪干扰素α1作为一种非特异性广谱抗病毒生物制剂在兽药领域具有广阔的药用前景，但是与大多基因工程兽药一样，猪干扰素α1也存在着产量不足、价格昂贵、质量参差不齐、作用时间较短等问题。本发明利用家蚕表达体系对优化后的猪IFNα1-Fc融合蛋白基因进行表达，得到了表达效率较高活性较强的目的蛋白。此外，本发明的猪IFNα1-Fc融合蛋白延长了猪干扰素α1的作用时间，增强了整体免疫调节作用，且便于后期纯化，从而使采用基因工程方法大规模生产猪IFNα1-Fc融合蛋白制剂成为可能，也为开发含有该融合蛋白的新型饲料创造了条件。
权利要求 :
1.一种猪IFNα1-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
2.如权利要求1所述的融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白还包括在猪α1干扰素蛋白序列的成熟肽部分之前添加了gp64信号肽序列。
3.一种编码权利要求2中所述的融合蛋白的基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。
4.一种质粒，所述质粒具有权利要求3的基因。
5.如权利要求4所述的质粒，所述质粒为Bacmid。
6.一种病毒，所述病毒具有权利要求4或5中的质粒。
7.如权利要求6所述的病毒，所述病毒为BmNPV杆状病毒。
8.一种猪IFNα1-Fc融合蛋白的表达方法，其特征在于，包含如下步骤：(1)将权利要求7中的杆状病毒感染家蚕BmN细胞或穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫；
(2)感染的家蚕BmN细胞或者穿刺接种的家蚕幼虫表达产生猪IFNα1-Fc融合蛋白。
9.一种含有如权利要求1所述的融合蛋白的药品或饲料。
说明书 :
猪IFNɑ1-Fc融合蛋白及其编码基因和表达方法
技术领域
[0001] 本发明涉及基因工程和生物工程技术，尤其是涉及一种猪IFNɑ1-Fc融合蛋白及其编码基因和利用家蚕生物反应器表达猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的方法。
背景技术
[0002] 干扰素(Interferon，IFN)是一组具有多种功能的活性蛋白质（主要是糖蛋白），是一种由单核细胞和淋巴细胞产生的细胞因子。它们在同种细胞上具有广谱的抗病毒、影响细胞生长，以及分化、调节免疫功能等多种生物活性。根据IFN的来源即动物种类、细胞类型、诱生剂的性质和诱生条件不同，可分为α、β、γ三种。其中的IFN-α抗病毒活性最强，并同时具有抗肿瘤、抗菌、抗原虫、治疗自身免疫性疾病等效应，因此被广泛的用于病毒性肝炎、癌症及多发性硬化症等多种疾病的临床治疗。但由于干扰素分子量小、吸收快、半衰期短、容易被酶水解等特点，在临床中需要频繁注射给药才能达到治疗的效果。
[0003] 目前猪干扰素的批量生产主要有诱导血液淋巴细胞产生IFN法和大肠杆菌异源表达法。前一种方法以动物细胞为原料，生产工艺复杂、生产成本高，产品有携带外源病毒和其他病原微生物的危险。相比之下，大肠杆菌异源表达法具有产量大、纯度高、适合规模化生产、产品质量容易控制等优点，但是其生产工艺相对较繁琐。并且，由于大肠杆菌体系内缺乏蛋白翻译后加工系统，表达产物多以无活性的包涵体形式产生。而包涵体的复性过程复杂、复性率低，从而导致蛋白比活性也较低。另外，大肠杆菌表达体系的产品纯度不高，含有其他杂蛋白，分离纯化较困难。
发明内容
[0004] 针对IFNɑ1半衰期段及缺乏适宜的异源表达体系的问题，首先，发明人将IgG的Fc片段与IFNɑ1连接构成融合蛋白，利用IgG的Fc片段可以和新生的Fc受体(FcRn)结合而避免被溶酶体降解的性质，使IFNɑ1-Fc融合蛋白达到长效作用的目的；其次，发明人采用了杆状病毒表达系统表达IFNɑ1-Fc融合蛋白，经过翻译后修饰，使目的蛋白的生化性质及生理活性方面与天然蛋白基本相似且表达效率明显增高。
[0005] 本发明一个目的是提供一种猪IFNɑ1-Fc融合蛋白，其氨基酸序列包含有猪ɑ1干扰素蛋白序列的成熟肽部分，同时，在猪ɑ1干扰素蛋白序列C端的终止密码子之前添加有Fc标签蛋白序列。
[0006] 本发明的上述所述猪IFNɑ1-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。
[0007] 本发明还提供了一种猪IFNɑ1-Fc第一优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO：1所示。
[0008] 本发明还提供了一种猪IFNɑ1-Fc第二优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO：2所示。
[0009] 本发明还提供了一种猪IFNɑ1-Fc第三优化基因，其碱基序列如SEQ ID NO：3所示。
[0010] 本发明还提供了一种质粒，所述质粒含有上述所述的猪IFNɑ1-Fc第一、第二或第三优化基因，所述质粒优选为Bacmid。
[0011] 本发明还提供了一种病毒，所述病毒具有上述所述的质粒，所述病毒优选为杆状病毒，最优选为BmNPV。
[0012] 本发明还提供了一种猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的表达方法，包含如下步骤：
[0013] (1)在合适的条件下将上述所述的病毒转染家蚕BmN细胞或穿刺接种家蚕幼虫；
[0014] (2)家蚕BmN细胞或家蚕幼虫表达猪IFNɑ1-Fc融合蛋白。
[0015] 优选的，所述表达方法步骤如下：
[0016] (1)将猪IFNɑ1-Fc第二优化基因或第三优化基因克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统转移表达载体pFastBac Dual中；
[0017] (2)通过位点的特异性转座，将转移表达载体上的所述猪IFNɑ1-Fc第二基因或者第三基因整合入Bacmid杆状病毒质粒完成病毒基因组的重组；
[0018] (3)将步骤(2)中整合了猪IFNɑ1-Fc第二优化基因或第三优化基因的杆状病毒质粒转染家蚕BmN细胞，获得重组杆状病毒并完成重组杆状病毒的扩增，并用杆状病毒穿刺接种1-5龄的家蚕幼虫；所述家蚕幼虫优选为4或5龄的家蚕幼虫；
[0019] (4)经重组病毒感染的家蚕BmN细胞和经接种的家蚕幼虫可表达猪IFNɑ1-Fc融合蛋白。
[0020] 本发明利用上述表达系统来生产猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的优点在于：1.本发明的表达方法的表达效率高，因而可大大降低猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的生产成本并使通过基因工程方法大规模生产猪IFNɑ1-Fc融合蛋白成为可能。2.这一表达系统为真核表达系统，其表达的外源蛋白质可进行翻译后修饰，使目的蛋白在生化性质和生物活性与天然产品类似，从而为所表达的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白具有正确的蛋白结构和生物学活性提供了保证。3.与天然猪IFNɑ1相比，本发明的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白增加了Fc蛋白片段，从而延长了猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的半衰期，增加了其在体内发挥效应的时间和整体免疫调节作用，同时，本发明的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白也具有很高的生物活性。此外，Fc片段可以起到蛋白标签的作用，便于后期目的蛋白纯化及猪IFNɑ1-Fc融合蛋白注射剂的制备。4.家蚕体内有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定，而且家蚕是可以无菌大规模饲养的经济昆虫，可以低成本地大规模饲养，而蚕蛹也是中药中的一味常用中药，所以，本发明的通过家蚕表达的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白不仅可以经过进一步纯化后制备注射用制剂，而且也可以不经过纯化而经过病毒灭活后直接添加至畜禽(如鸡、猪)的饲料中去。
附图说明
[0021] 图1：总实验设计流程图。
[0022] 图2-a、图2-b：猪IFNɑ1-Fc原始基因序列与猪IFNɑ1-Fc第一基因序列优化前后在家蚕表达宿主中CAI指数。
[0023] 其中，图2-a表示优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数为0.85；图2-b表示优化后的猪IFNɑ1-Fc第一基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数为0.88。
[0024] 图3-a、图3-b：猪IFNɑ1-Fc原始基因序列与猪IFNɑ1-Fc第一基因密码子在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图。
[0025] 其中，图3-a表示优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化前的序列低频密码子出现百分比为1%；图3-b表示优化后的猪IFNɑ1-Fc第一基因密码子在家蚕表达宿主中最优密码子频率分布区域图，优化后的序列低频密码子出现百分比为0。
[0026] 图4-a、图4-b：猪IFNɑ1-Fc原始基因序列与猪IFNɑ1-Fc第一基因密码子在家蚕表达宿主中GC含量分布区域图。
[0027] 其中，图4-a表示优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列在家蚕表达宿主中GC含量为54.40%；图4-b表示优化后的猪IFNɑ1-Fc第一基因密码子在家蚕表达宿主中GC含量为52.12%。
[0028] 图5-a、图5-b：猪IFNɑ1-Fc原始基因序列与猪IFNɑ1-Fc第一基因在家蚕表达宿主中mRNA的二级结构示意图。
[0029] 其中，图5-a表示优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列mRNA的二级结构示意图；图5-b表示猪IFNɑ1-Fc第一基因进行了优化，去掉发卡结构、剪切位点、内部核糖体结合位点之后mRNA的二级结构示意图。
[0030] 图6：重组pFastBac-(IFNɑ1-Fc)转移载体的构建示意图。
[0031] 图7：人工合成的pVL1393-(IFNɑ1-Fc)质粒为模板的猪IFNɑ1-Fc第二优化基因的PCR扩增图。其中，泳道1为经PCR扩增的猪IFNɑ1-Fc第二优化基因，在1200和1400bp中间出现目的条带；泳道2为200bp DNA ladder。
[0032] 图8：pFastBac-(IFNɑ1-Fc)的BamH I和Hind III的双酶切鉴定图。其中泳道1为pFastBac-(IFNɑ1-Fc)经BamH I和Hind III双酶切后的条带，5000bp处的为pFastBac Dual条带，1300bp处的为猪IFNɑ1-Fc第二优化基因条带；泳道2为阳性对照的原始pFastBac Dual质粒；泳道3为阳性对照的猪IFNɑ1-Fc第二优化基因的PCR条带；泳道4为200bp DNA ladder。
[0033] 图9：Bacmid-(IFNɑ1-Fc)重组质粒利用M13引物的PCR鉴定图。其中泳道1为已成功转座的重组Bacmid-(IFNɑ1-Fc)，在4000bp处出现目的条带；泳道2为未转座的重组Bacmid，在300bp出现条带；泳道3为200bp DNA ladder。
[0034] 图10-a、图10-b：在100× 的显微 镜下BmN 细胞 感染重 组杆 状病 毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)前后细胞形态比较。图10-a为未感染病毒的BmN细胞，细胞呈圆梭状贴壁生长；图10-b为感染BmNPV-(IFNɑ1-Fc)病毒72h后的BmN细胞，细胞变圆，细胞核膨大，细胞失去贴壁性能而悬浮于培养基中。
[0035] 图11：家蚕BmN细胞和家蚕幼虫表达重组猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的PCR鉴定。其中泳道1为以表达重组猪IFNɑ1-Fc融合蛋白家蚕BmN细胞上清中重组杆状病毒的基因组为模板的PCR产物；泳道2为以表达重组猪IFNɑ1-Fc融合蛋白家蚕幼虫蚕血基因组为模板的PCR产物；泳道3为200bp DNA ladder。
[0036] 图12：家蚕BmN细胞和家蚕幼虫表达的重组猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的western blotting鉴定。使用的一抗为鼠抗IFNɑ1抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠的IgG。其中1为10-230kD范围的预染Protein ladder；2为感染BmNPV-(IFNɑ1)病毒72h后的BmN细胞；3为家蚕幼虫感染BmNPV-(IFNɑ1)病毒72h后的家蚕血液。
[0037] 图13-a、图13-b：猪IFNα1-Fc和IFNα1融合蛋白western blot稳定性检测实验。图13-a为IFNα1-Fc和IFNα1在蚕血中的稳定性试验，图13-b为IFNα1-Fc和IFNα1在猪血清中的稳定性试验。使用的一抗为鼠抗IFNɑ1抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠的IgG。其中M为10-230kD范围的预染Protein ladder；1为0h取样点样品；2为4h取样点样品；
3为8h取样点样品；4为24h取样点样品；5为48h取样点样品；6为72h取样点样品。
具体实施例
3为8h取样点样品；4为24h取样点样品；5为48h取样点样品；6为72h取样点样品。
具体实施例
[0038] 实验材料：
[0039] 1.菌株与载体：大肠杆菌E.coli DH5a、DH10Bac，转移载体pVL1393和pFastBac Dual购自Invitrogen公司。家蚕BmN细胞由购自美国标准生物品收藏中心。家蚕品种为青松×皓月，由中国农业科学院蚕业研究所提供（此品种家蚕为常用家蚕品种，市场中也多有其他公司销售）。
[0040] 2.酶与试剂：DNA聚合酶、限制性内切酶、T4连接酶为NEB公司产品。
[0041] 3.生化试剂：IPTG、X-Gal为Sigma公司产品。过硫酸铵、TEMED、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、低熔点琼脂糖为Promega公司产品。庆大霉素、氨苄青霉素、四环素购自上海生物工程有限公司。Lipofectamine2000购自Invitrogen公司。鼠抗IFNɑ1一抗购自Thermo Scientific公司、羊抗鼠的IgG二抗购自Sigma公司。胎牛血清购自Gibco公司。细胞培养基TC-100购自Applichem公司；鲁米诺/增强剂溶液和稳定型过氧化物溶液购自Thermo Scientific公司。
[0042] 4.培养基：大肠杆菌培养基为LB（1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、1%NaCl，pH7.0）；家蚕细胞培养基为含10%胎牛血清的TC-100。
[0043] 实施例一、猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的cDNA基因设计
[0044] 根据GenBank已公开的Sus scrofa interferon alpha1的cDNA序列(GenBank序列登录号：EU364896.1)，在该序列的3’端的终止密码子之前添加Fc标签，所述Fc片段的基因由Sus scrofaIgG heavy chain(GenBank登录号：NM_213828.1)中铰链区、CH2区和CH3区的cDNA序列组成，所得序列记为猪IFNɑ1-Fc原始基因序列。再根据家蚕表达系统的特性对该基因序列进行了整体优化，优化后的基因序列记为猪IFNɑ1-Fc第一优化基因序列，如SEQ ID NO：1所示。
[0045] 优化后的猪IFNɑ1-Fc第一优化基因序列更适合于家蚕表达系统，主要体现在下面几方面：
[0046] 1.基因序列的密码子适应指数CAI(Codon Adaptation Index)
[0047] 由图2-a可知，优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列的cDNA基因序列在家蚕表达宿主中CAI为0.85。由图2-b可知，经过密码子优化后，使得猪IFNɑ1-Fc第一优化基因的cDNA基因序列在家蚕表达宿主中CAI指数达到0.88。通常CAI=1时被认为该基因在该表达系统中是最理想的高效表达状态，CAI指数越低表明该基因在该宿主中表达水平越差。本发明通过密码子优化提高了CAI指数，从而提高本发明猪IFNɑ1-Fc第一优化基因在家蚕表达宿主中的表达水平。
[0048] 2.最优密码子频率分布区域图FOP(Frequency of Optimal Codons)[0049] 由图3-a可知，基于家蚕宿主的表达载体，优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列的低频密码子（遗传密码有64种，但是绝大多数生物倾向于利用这些密码子中的一部分。那些被最频繁利用的称为最佳密码子(optimal codons)，那些不被经常利用的称为稀有密码子、低频密码子或利用率低的密码子(rare or low-usage codons)）出现百分比为1%；未进行优化的基因采用串联低频密码子，这些密码子可能降低翻译效率，甚至能够解散翻译装配物。由图3-b可知，经过密码子优化之后的猪IFNɑ1-Fc第一优化基因在家蚕表达系统中出现稀有密码子的频率为0。
[0050] 3.GC含量调整(GC Content Adjustment)
[0051] GC含量理想分布区域为30%-70%，在这个区域外的出现任何峰都会不同程度地影响转录和翻译效率。由图4-a可知：优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列的GC碱基平均含量54.40%，优化中减少了基因序列中的GC含量以进一步延长mRNA的半衰期，由图4-b可知：最终得到优化后的猪IFNɑ1-Fc第一优化基因的GC碱基平均含量为52.12%。
[0052] 4.猪IFNɑ1-Fc融合蛋白在家蚕表达宿主中mRNA的二级结构示意图[0053] 图5-a为优化前的猪IFNɑ1-Fc原始基因序列的mRNA的二级结构示意图；在序列的优化过程中去掉了序列中的发卡结构、剪切位点、内部核糖体结合位点、转录终止序列等，优化之后的猪IFNɑ1-Fc第一基因的mRNA的二级结构示意图如图5-b。
[0054] 人工合成优化得到的猪IFNɑ1-Fc第一优化基因之后，将该基因亚克隆至转移载体pVL1393中，所得质粒记为pVL1393-(IFNɑ1-Fc)质粒。
[0055] 实施例二、重组转移载体pFastBac-(IFNɑ1-Fc)的构建
[0056] 1.PCR扩增猪IFNɑ1-Fc第二优化基因产物
[0057] 以人工合成的pVL1393-(IFNɑ1-Fc)质粒为模板，进行PCR扩增去掉IFNɑ1自身所带的23个氨基酸信号肽，添加适合昆虫表达系统的系统gp64信号肽，所得基因序列记为猪IFNɑ1-Fc第二优化基因，该基因序列如SEQ ID NO：2所示。具体如下：
[0058] 使用引物如下：
[0059] 正向引物1：5’-
[0060] CGCGGATCCATGGTAAGCGCTATTGTTTTATATGTGCTTTTGGCGGCGGCGGCGCATTCTGCCTTTGCGTGTGACCTGCCTCAGACCCA-3’，
[0061] 反向引物1：5’-CCCAAGCTTTCATTTTCCTTGGGTCTTGC-3’。
[0062] 上游引物含BamH I酶切位点及gp64信号肽序列，下游引物包含Hind III的酶切位点。PCR反应体系如下：10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP混合物4μL，10μM正反向引物各加1μL，模板1μL，DNA聚合酶0.25μL，加灭菌双蒸水补足体积至50μL。PCR扩增条件为：94℃热变性4min；94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后于4℃保温。
[0063] 2.PCR产物的纯化
[0064] 将PCR扩增得到产物进行1%琼脂糖凝胶电泳，发现扩增出得到约1300bp左右的DNA片段(图7)。在紫外下用灭菌的手术刀切取含相应DNA片段的凝胶，然后用TIANGEN公司的凝胶回收试剂盒进行纯化。方法如下：切取凝胶片段并称重，将其放入灭菌的1.5mL小离心管中，加入3倍(v/w)体积的溶胶液，50℃放置10min使胶充分溶解。将胶溶液冷却至室温后放入吸附柱，加入含无水乙醇的漂洗液洗2次。将漂洗液除尽之后加入30μL的洗脱缓冲液洗脱DNA。
[0065] 3.酶切与连接反应
[0066] 酶切反应：纯化后的DNA用BamH I和Hind III双酶切，酶切体系如下：10×缓冲液5μL，PCR产物10μL，BamH I1.5μL，Hind III1.5μL，补足灭菌双蒸水至总体积50μL。将反应体系混合均匀之后置于37℃酶切3h。将pFastBac Dual质粒作同样的酶切反应。反应结束用1%的琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的片段并进行纯化。
[0067] 连接反应：将双酶切后的PCR产物和pFastBac Dual质粒采用T4连接酶连接，连接体系如下：10×缓冲液2μL，PCR产物10μL，pFastBac Dual质粒3μL，T4连接酶1μL，补足灭菌双蒸水至总体积20μL。将反应体系混合均匀之后于16℃连接过夜。
[0068] 4.大肠杆菌的转化
[0069] 用75mM CaCl2制备大肠杆菌DH5a感受态细胞。取步骤3中制备的连接反应产物5μL，加入到100μL的感受态细胞中，冰浴30min后42℃水浴热激90s。将热激后产物迅速置于冰上冷却3min，再加入到已温育至37℃的900mL LB培养基中，37℃，220rpm震荡复苏1h。取100μL复苏后的菌液涂布于含100μg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB固体培养基平板上，37℃倒置培养过夜。
[0070] 5.重组子的鉴定
[0071] 从转化的LB平板中挑取单个菌落，接种于5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养过夜。使用TIANGEN公司的质粒小提试剂盒，采用碱裂法裂解细胞后通过离心吸附柱在高盐状态下特异性的结合反应溶液中的DNA。将所得质粒经BamH I和Hind在37℃酶切3h，用1%的琼脂糖凝胶电泳分析目的片段，发现重组子在5000bp处出现pFastBac Dual的条带，在1300bp处出现猪IFNɑ1-Fc第二优化基因条带(图8)。将双酶切鉴定正确的重组质粒测序，将测序结果正确的重组质粒命名为pFastBac-(IFNɑ1-Fc)。
[0072] 本发明中也可人工合成猪IFNɑ1-Fc第二优化基因，并将该基因直接亚克隆至pFastBacDual载体中；或将人工合成猪的IFNɑ1-Fc第一优化基因直接亚克隆至pFastBac Dual载体中。并基于此进一步进行下述实验。
[0073] 或者，作为优化方案，本发明中也可进一步针对猪IFNɑ1-Fc第二优化基因的gp64信号肽部分进行密码子优化得到猪IFNɑ1-Fc第三优化基因，如SEQ ID NO：3所示。人工合成猪IFNɑ1-Fc第三优化基因，并将该基因直接亚克隆至pFastBac Dual载体中，基于此进一步进行下述实验。
[0074] 实施例三、杆状病毒BmN-(IFNɑ1-Fc)的构建
[0075] 1.转移质粒Bacmid-(IFNɑ1-Fc)的构建
[0076] 将5μL pFastBac-(IFNɑ1-Fc)质粒加入到100μL的DH10Bac感受态细胞中，冰浴30min后42℃水浴热激90s。将热激后产物迅速置于冰上冷却3min，再加入到已温育至37℃的900mL LB培养基中，37℃，220rpm震荡复苏1h。取100μL复苏后的菌液涂布于含50μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素，100μg/mL X-gal和40μg/mL IPTG的LB固体平板上于37℃培养箱倒置培养。48h后从LB固体平板中挑取单个白色菌落加入含50μg/mL卡那霉素，7μg/mL庆大霉素，10μg/mL四环素的LB液体培养基中过夜扩大培养。提取Bacmid基因组DNA后使用M13通用引物进行PCR验证。所用引物如下：
[0077] 正向引物2:5'-CCCAGTCACGACGTTGTAAAACG-3'
[0078] 反向引物2:5'-AGCGGATAACAATTTCACACAGG-3'
[0079] PCR反应体系为：10×PCR缓冲液5μL，2.5mM dNTP混合物4μL，10μM正反向引物各加1μL，DNA聚合酶0.25μL，Bacmid基因组DNA1μL，加灭菌双蒸水补足体积至50μL。PCR扩增条件为：94℃热变性4min；94℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸5min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后于4℃保温。将PCR产物用1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，从Bacmid DNA中扩增出与理论分子量相一致的目的条带(4000bp),说明已按要求正确构建了Bacmid，所得质粒命名为Bacmid-(IFNɑ1-Fc)质粒。未正确构建Bacmid DNA的PCR扩增仅在300bp出现一条带(如图9所示)。
[0080] 2.杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)的构建
[0081] 按照Applichem公司的产品说明配置1×TC-100昆虫培养基，用2M NaOH调节pH至6.2，使用0.22μM的微孔滤膜过滤除菌后的培养基补加10%的胎牛血清，26℃下培养家蚕BmN细胞。
[0082] 将 正 确 Bacmid-(IFNɑ1-Fc)利 用 Invitrogen 公 司 的 Lipofectamine2000转染试剂转染家蚕BmN细胞。分别向300μL无血清的TC-100培养基中加入5μg Bacmid-(IFNɑ1-Fc)质粒和18μL的Lipofectamine2000，室温孵育5min。将两者轻轻混匀后室温静置20min后滴加到4mL的无血清TC-100培养基中混匀，转染家蚕BmN细胞。于26℃恒温培养5h之后更换含10%胎牛血清的TC-100培养基，在26℃继续恒温培养4-5d。
收集病毒感染后BmN细胞培养液，离心取上清即获重组杆状病毒，记为BmNPV-(IFNɑ1-Fc)病毒，该重组杆状病毒为P1代重组杆状病毒。
收集病毒感染后BmN细胞培养液，离心取上清即获重组杆状病毒，记为BmNPV-(IFNɑ1-Fc)病毒，该重组杆状病毒为P1代重组杆状病毒。
[0083] 将P1代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)感染正常生长的单层家蚕BmN细胞，26℃培养5d后收集培养基上清液，获得P2代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)。取P2代病毒感染单层家蚕BmN细胞，26℃恒温培养，感染72h后BmN细胞出现典型的细胞病变，收取病毒感染的BmN细胞培养基上清，获得P3代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)，4℃避光保存备用。
[0084] 实施例四、猪IFNɑ1-Fc融合蛋白在家蚕BmN细胞中的表达
[0085] 将P3代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)感染正常生长的单层家蚕BmN细胞，在26℃培养箱恒温培养。未感染病毒之前正常的BmN细胞，细胞呈圆梭状贴壁生长(如图10-a所示)；而BmN细胞感染P3代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)之后，细胞逐渐停止生长，细胞变圆，细胞核膨大，72h后BmN细胞失去贴壁性能而悬浮于培养基中(如图10-b所示)。经病毒感染的BmN细胞的培养液中表达了大量本发明的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白，其氨基酸序列如SEQ IDNO：4所示，收集并离心培养基上清，即获得P4代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)。
[0086] 实施例五、猪IFNɑ1-Fc融合蛋白在家蚕幼虫中的表达
[0087] 本实验所用的家蚕高表达品种为青松皓月，按吕鸿声主编的《中国养蚕学》(上海科学技术出版社，1991)的常规方法进行饲养。桑叶饲养家蚕到五龄，将蚕体表面用75%的6
乙醇消毒，用微量注射器分别吸取P4代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)，按每头1.0×10
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即5μL接种液中含2.0×10 的pfu/mL的BmNPV-(IFNɑ1-Fc)重组病毒的量在蚕体腹节倒数第2和第3节间膜处穿刺接种重组病毒，26℃按常规桑叶饲养家蚕。4-5d后收集发病家蚕幼虫的蚕血淋巴，-20℃冰箱冻存备用。
乙醇消毒，用微量注射器分别吸取P4代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)，按每头1.0×10
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即5μL接种液中含2.0×10 的pfu/mL的BmNPV-(IFNɑ1-Fc)重组病毒的量在蚕体腹节倒数第2和第3节间膜处穿刺接种重组病毒，26℃按常规桑叶饲养家蚕。4-5d后收集发病家蚕幼虫的蚕血淋巴，-20℃冰箱冻存备用。
[0088] 实施例六、表达猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的鉴定
[0089] 利用TIANGEN公司的病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒分别提取实施四例中P4代重组杆状病毒BmNPV-(IFNɑ1-Fc)的基因组DNA及实施例五中的家蚕幼虫蚕血淋巴的基因组DNA，分别以其为模板进行PCR基因扩增鉴定。PCR所用引物为实施例二中所述的正向引物1和反向引物1。
[0090] PCR条件如下：94℃热变性4min；94℃变性45s，52℃退火30s，72℃延伸1min，进行30个循环；最后72℃延伸10min后于4℃保温。取10μL反应产物1%的琼脂糖凝胶电泳进行分析，发现以家蚕BmN细胞和家蚕幼虫蚕血淋巴为模板PCR的产物条带出现在1200bp和1400bp中间，与预期大小相符(如图11所示)。证明在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫已含有可表达本发明的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的第二优化基因。
[0091] 向实施例四中含猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的重组BmN细胞培养基上清及实施例五中的家蚕幼虫蚕血淋巴中加入2×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热5min，室温高速离心3min。取上清于5%的浓缩胶和12%的分离胶中进行SDS-PAGE电泳。电泳是在浓缩胶的电压为80V，到达分离胶之后提升电压到120V，在溴酚蓝迁移到分离胶底部时停止电泳。使用
100mA，1h的方法进行半干法转膜蛋白质样品从PAGE凝胶转移至PVDF膜上固定；使用5%脱脂奶粉/TBST37℃封闭1h；使用1:1000稀释的鼠抗IFNɑ1一抗抗体37℃孵育1h后，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗37℃孵育1h；加入鲁米诺和稳定型过氧化物溶液显色后放入凝胶成像系统进行荧光发光检测来验证猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的表达情况。发现在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫中表达的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白在45kD左右处都出现抗IFNɑ1抗体的特异性目的条带(如图12所示)，证明在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫已正确表达了猪IFNɑ1-Fc融合蛋白。经测定BmN细胞中表达的总蛋白浓度约为3.86mg/mL；蚕血总蛋白浓度为12.73mg/mL。蚕血中目标蛋白(猪IFNɑ1-Fc融合蛋白)占总蛋白的百分比为3.34%，即目标蛋白(猪IFNɑ1-Fc融合蛋白)浓度为0.43mg/mL。
100mA，1h的方法进行半干法转膜蛋白质样品从PAGE凝胶转移至PVDF膜上固定；使用5%脱脂奶粉/TBST37℃封闭1h；使用1:1000稀释的鼠抗IFNɑ1一抗抗体37℃孵育1h后，加入1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗37℃孵育1h；加入鲁米诺和稳定型过氧化物溶液显色后放入凝胶成像系统进行荧光发光检测来验证猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的表达情况。发现在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫中表达的猪IFNɑ1-Fc融合蛋白在45kD左右处都出现抗IFNɑ1抗体的特异性目的条带(如图12所示)，证明在家蚕BmN细胞和家蚕幼虫已正确表达了猪IFNɑ1-Fc融合蛋白。经测定BmN细胞中表达的总蛋白浓度约为3.86mg/mL；蚕血总蛋白浓度为12.73mg/mL。蚕血中目标蛋白(猪IFNɑ1-Fc融合蛋白)占总蛋白的百分比为3.34%，即目标蛋白(猪IFNɑ1-Fc融合蛋白)浓度为0.43mg/mL。
[0092] 实施例七、猪IFNɑ1-Fc融合蛋白生物学活性测定
[0093] 猪水泡性口炎病毒(VSV，其TCID50为5×107/100μL，广东省农科院兽医研究所提供)可感染猪肾细胞(PK-15，广东省农科院兽医研究所提供)，本发明利用猪α干扰素的抗病毒机制检测在猪肾细胞在猪α干扰素存在条件下对猪水泡性口炎病毒的防御作用，通过检测PK-15细胞的病变情况得到猪α干扰素对PK-15细胞的保护效应曲线，从而测定猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的生物学活性。
[0094] 1.阳性对照品溶液制备：取猪干扰素阳性对照品(猪基因工程重组细胞因4
子:IFN-LLS-2，购自香港曼普动物营养品有限公司。测定其效价为5×10U/mL)，按说明书复溶后，用含有6%胎牛血清的MEM细胞培养液(Gibico产品)按10倍一级逐级稀释。
子:IFN-LLS-2，购自香港曼普动物营养品有限公司。测定其效价为5×10U/mL)，按说明书复溶后，用含有6%胎牛血清的MEM细胞培养液(Gibico产品)按10倍一级逐级稀释。
[0095] 2.猪IFNɑ1-Fc融合蛋白样品溶液制备：将实施例四含猪IFNα1-Fc融合蛋白的BmN细胞的培养液上清和实施例五中含猪IFNα1-Fc融合蛋白的家蚕蚕血淋巴，用细-1胞培养液(含有6%胎牛血清的MEM培养液)做10倍梯度稀释，分别得到9×10 mg/mL、-2 -3 -4 -5 -6
9×10 mg/mL、9×10 mg/mL、9×10 mg/mL、9×10 mg/mL、9×10 mg/mL的猪IFNα1-Fc融合蛋白溶液。
9×10 mg/mL、9×10 mg/mL、9×10 mg/mL、9×10 mg/mL、9×10 mg/mL的猪IFNα1-Fc融合蛋白溶液。
[0096] 3.在96孔板上每孔加入不同浓度的猪IFNα1-Fc融合蛋白溶液50μL，再加入新6 6
鲜传代的PK-15细胞悬液(细胞浓度约为1.8×10-2.2×10 个/mL)50μL，在37℃、5％CO2条件下孵育约24h后，PK-15细胞贴壁生长至单层。吸去含重组猪干扰素的细胞培养液，每孔加入100μL含100个TCID50的VSV病毒稀释液(用含2%胎牛血清的MEM培养液)。同时设立病毒对照孔（只加同样剂量的病毒，不加干扰素）和细胞对照孔(只加细胞培养液，不加干扰素)。37℃、5％CO2条件下培养24h后，待病毒对照孔的细胞病变90％－100％时观察结果。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位(记为“U”)。
鲜传代的PK-15细胞悬液(细胞浓度约为1.8×10-2.2×10 个/mL)50μL，在37℃、5％CO2条件下孵育约24h后，PK-15细胞贴壁生长至单层。吸去含重组猪干扰素的细胞培养液，每孔加入100μL含100个TCID50的VSV病毒稀释液(用含2%胎牛血清的MEM培养液)。同时设立病毒对照孔（只加同样剂量的病毒，不加干扰素）和细胞对照孔(只加细胞培养液，不加干扰素)。37℃、5％CO2条件下培养24h后，待病毒对照孔的细胞病变90％－100％时观察结果。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位(记为“U”)。
[0097] 实验结果显示，阴性对照病毒组中的细胞均发生明显病变，空白细胞对照组中细胞生长正常。以引起半数孔的细胞病变的干扰素的量为一个单位(记为“U”)，通过显微镜观察阳性对照存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，确定阳性对照干扰4
素的效价为3.2×10U/mL。显微镜观察猪IFNα1-Fc融合蛋白存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，计算得到在BmN细胞中表达的猪IFNα1-Fc融合蛋白的效价
4 6
为2×10U/mL，在家蚕幼虫中表达的猪IFNα1-Fc融合蛋白的效价为6.7×10U/mL，表明本发明中制备的猪IFNα1-Fc融合蛋白具有显著的抗病毒活性。
素的效价为3.2×10U/mL。显微镜观察猪IFNα1-Fc融合蛋白存在条件下PK-15细胞生长未受VSV病毒影响的细胞数，计算得到在BmN细胞中表达的猪IFNα1-Fc融合蛋白的效价
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为2×10U/mL，在家蚕幼虫中表达的猪IFNα1-Fc融合蛋白的效价为6.7×10U/mL，表明本发明中制备的猪IFNα1-Fc融合蛋白具有显著的抗病毒活性。
[0098] 实施例八、重组猪干扰素α1的制备（详细可参见申请人的在先申请：201310025176.8）
[0099] 具体步骤如下：
[0100] 1.构建可表达重组猪干扰素α1的重组大肠杆菌。
[0101] 根据GenBank已公开的猪干扰素α1（Sus scrofa interferon，alpha1）的cDNA序列(GenBank登录号：NM_214393.1)，按照大肠杆菌表达系统对该基因进行密码子优化后得到重组猪干扰素α1基因，如SEQ ID No：5所示。将优化后的重组猪干扰素α1全基因合成的片段，构建到pUC57质粒中，得到pUC57-prIFNα1质粒。
[0102] 以pUC57-prIFNα1质粒为模板，上、下游引物分别引入NdeI和XhoI酶切位点，进行PCR扩增，所用引物序列如下：
[0103] 上游引物：
[0104] P1：GGAATTCCATATGTGTGACCTGCCGCAAACGC
[0105] 下游引物：
[0106] P2：CCGCTCGAGTCATTCCTTTTTGCGCAGACGATC
[0107] 反应总体积50μL，其中浓度为10μM引物各加2.5μL，浓度为10mM的dNTP加1μL，所用DNA聚合酶Phusion High-Fidelity DNA polymerase，2U/μL，加0.5μL。反应条件为98℃5s、55℃20s、72℃30s，25个循环。PCR产物用DNA凝胶回收试剂盒纯化后，用NdeI和XhoI双酶切，用T4连接酶连接到pET21b质粒中，并将质粒转化到DH5α感受态细胞中扩增。将扩增的表达质粒pET21b-prIFNα1转化到大肠杆菌BL21（DE3）表达菌株中。
[0108] 2.重组猪干扰素α1包涵体的表达
[0109] 将含有pET21b-prIFNα1的大肠杆菌BL21（DE3）于37℃氨苄青霉素平板中过夜培养。次日挑1-4个含有pET21b-prIFNα1质粒的重组菌落，接入含有100μg/mL氨苄青霉素的LB培养液，37℃培养过夜。取50μL过夜培养物接入5mL含100μg/mL氨苄青霉素的LB诱导培养液，37℃振荡培养。待OD600=1.0时，用1mM的IPTG进行诱导。4h后收集菌液，高速离心，用预冷的PBS清洗沉淀。
[0110] 3.重组猪干扰素α1包涵体的复性及纯化
[0111] 将步骤2中经预冷的PBS清洗沉淀用预冷的PBS重悬，于4℃以12000rpm，离心15min；重复一次。弃上清，按每克（菌体湿重）加入裂解缓冲液Buffer A5mL，使菌体悬起。
每克（菌体湿重）菌体加入5μL100mmol/L PMSF，5μL100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min。沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复一次。包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素α1变性溶液。采用透析复性法复性包涵体：用变性缓冲液Buffer C将重组猪干扰素α1变性溶液浓度稀释到0.2mg/mL，注入截留分子量10kD的透析卡中，
4℃透析复性，每隔6h换一次复性缓冲液Buffer D。复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液过0.45μm滤膜，即得到低浓度的重组猪干扰素α1复性溶液。用截留分子量10kD的超滤管脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组猪干扰素α1粉末。各缓冲液配制如下表所示。重组猪干扰素α1粉末4℃冰箱存放待用。
每克（菌体湿重）菌体加入5μL100mmol/L PMSF，5μL100mg/mL溶菌酶，冰上搅动20min。用探针型超声波仪破碎菌体，样品置于冰上，超声120次，每次5s间隔5s，循环三次，每次循环至冷却样品之间等待2min，等待样品冷却。4℃，12000rpm，离心15min。沉淀用洗涤缓冲液Buffer B洗涤，4℃，12000rpm，离心15min，沉淀包涵体，重复一次。包涵体沉淀用变性缓冲液Buffer C溶解，室温下搅拌30min。充分混匀后室温12000rpm，离心15min，弃沉淀，取上清，即得到重组猪干扰素α1变性溶液。采用透析复性法复性包涵体：用变性缓冲液Buffer C将重组猪干扰素α1变性溶液浓度稀释到0.2mg/mL，注入截留分子量10kD的透析卡中，
4℃透析复性，每隔6h换一次复性缓冲液Buffer D。复性至24h时，将复性后重组蛋白溶液过0.45μm滤膜，即得到低浓度的重组猪干扰素α1复性溶液。用截留分子量10kD的超滤管脱盐、浓缩，于真空冷冻干燥机低温真空干燥，即获得重组猪干扰素α1粉末。各缓冲液配制如下表所示。重组猪干扰素α1粉末4℃冰箱存放待用。
[0112] 各缓冲液成分
[0113]
[0114] 实施例九、猪IFNα1-Fc融合蛋白稳定性实验
[0115] 将取相同浓度的实施例五中的IFNα1-Fc和实施例八中的IFNα1加入到2mL蚕血和猪血清中，混合均匀后于37℃培养箱进行培养。分别在0h，4h，8h，24h，48h，72h时从含有IFNα1-Fc和IFNα1混合液蚕血和猪血清的反应体系中取样，加入5×SDS凝胶加样缓冲液，100℃加热5min，室温高速离心5min于4℃冰箱放置备用。取样结束后，将所有样品上清在同一块5%的浓缩胶和12%的分离胶上进行SDS-PAGE电泳。电泳是在浓缩胶的电压为80V，到达分离胶之后提升电压到120V，在溴酚蓝迁移到分离胶底部时停止电泳。使用100mA，1h的方法进行半干法转膜蛋白质样品从PAGE凝胶转移至PVDF膜上固定；使用5%脱脂奶粉/TBST37℃封闭1h；使用1:1000稀释的鼠抗IFNɑ1一抗抗体37℃孵育1h后，加入
1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗37℃孵育1h；最后加入鲁米诺和稳定型过氧化物溶液显色后放入凝胶成像系统进行荧光发光检测。
1:10000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG二抗37℃孵育1h；最后加入鲁米诺和稳定型过氧化物溶液显色后放入凝胶成像系统进行荧光发光检测。
[0116] 如图13-a、图13-b所示，在20kD处的片段为IFNα1的特异性条带，在45kD处为IFNα1-Fc的特异性条带。在蚕血和猪血清中的鼠抗IFNɑ1抗体的western blot结果显示，发现不带Fc标签的IFNα1重组蛋白的western blot信号随时间增加衰减趋势非常明显，在48h时仅具有微弱的western blot信号，在72h后无法检测到任何western blot信号。而带有Fc标签的IFNα1-Fc融合蛋白则较为稳定，随着时间的增加其western blot信号衰减较为平缓，在72h时仍具有较明显的western blot信号。对比IFNα1-Fc和IFNα1在蚕血和猪血清中的稳定性发现，在猪IFNɑ1-Fc融合蛋白增加了Fc片段后，显著延长猪IFNɑ1-Fc融合蛋白的半衰期。