一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株

摘要

一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明菌株分类命名为畸雌腐霉（Pythiumirregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M2012421。该菌株由通过对江苏省无锡市惠山树林中的土壤进行分离筛选，得到了性状稳定，产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，可通过液态发酵生产二十碳五烯酸EPA，EPA产量可以5.5g/L以上，同时EPA占总油脂的30%以上。

权利要求

1.一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，其分类命名为畸雌腐霉（Pythium irregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012421。

2.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其18S rDNA序列为 SEQ ID NO：1。

3.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其特征在于能代谢产生二十碳五烯酸。

4.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其特征在于可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉或马铃薯淀粉。

5.根据权利要求1所述的畸雌腐霉菌株，其特征在于可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。

说明书

一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株

技术领域

[0001] 一株产二十碳五烯酸（EPA）的畸雌腐霉菌株，属于生物工程技术领域。本发明涉及一种高产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，该菌株生长速度快、产量高，对于二十碳五烯酸的工业化生产有着重要意义。

背景技术

[0002] 二十碳五烯酸(5,8,11,14,17-Eicosapentaenoic acid EPA)是一种具有5个非共扼双键的20个碳原子直链不饱和脂肪酸（PUFA），因分子中的第一个双键起始于甲基端的第三个碳原子，属Ω-3系列不饱和脂肪酸。采用n、Ω，速记命名法命名为20: 5n-3，采用IUPAC系统命名法命名为5, 8, 11, 14, 17一顺一二十碳五烯酸，分子式为C20H30O2，相对分子量为302.6。常温下，呈淡黄色油状液体，易溶于乙醚、正己烷、石油醚等非极性溶剂中。参与的化学反应与羧基和双键相关，如与氧反应、与卤素反应、酯化作用、氢化物形成等。Ω-3 多元不饱和脂肪酸在自然界分配很不均衡，陆地动植物和人体中含量极微，因此人体所需的Ω-3 多元不饱和脂肪酸必须从食物中摄取。EPA等多不饱和脂肪酸的一突出重要性在于，它是人体器官和组织生物膜的绝对必需成分，对于机体调节、动力学、相转移、膜的渗透性以及控制与膜相关的过程起到了关键作用，如果膜上磷脂分子中缺少相当数量的不饱和脂肪酸，细胞的生理功能就会失常。其在医学上可以治疗心血管疾病、癌症、精神分裂症以及老年痴呆症等。基于二十碳五烯酸的这些重要作用，生产EPA就有着极其重要的意义。在目前的工业上，EPA的生产主要来源于鱼油中。然而，在鱼油中含有胆固醇等对人体不健康的物质，此外鱼捕获量和种类会受捕获季节、地点及海洋中食物链变化影响，导致所含的多元不饱和脂肪酸量与质不稳定。并且由鱼油精炼的脂肪酸常带有一种令人难以忍受的鱼腥味，降低消费者的接受程度。所以，就需要其他富含EPA的微生物资源来代替鱼油。这些生产EPA的微生物主要是真核的微生物、真菌和藻类，在原核微生物中基本上是不产不饱和脂肪酸的。然而，Yasawa等人分离得到了88株产EPA的菌株，其中产EPA最高的菌株属于交替假单胞菌属。对于海洋藻类，无论是微藻还是肉眼可见的藻类，都有很高的EPA含量，其中大部分属于金藻纲。

[0003] 目前，可以产EPA的真菌主要来自被孢霉属和腐霉属。在被孢霉属中Mortierella alpina 被认为是可以作为大批商业化生产EPA的潜力菌株（Shimizu, S., Kawashima, H., Akimoto, K., Shinmen, Y. and Yamada, H. Fungal mycelia as novel source of eicosapentaenoic acid. Biochem. Biophys. Res. Commun.1988 150：335-341.）。但是，同样作为产EPA的潜力菌种，畸雌腐霉（Pythium irregulare）近些年来在国内外被研究的较多。例如，Edgar E. Stinson等人，利用该菌经优化培养条件后，EPA的产量可以达到76.5mg/L (Edgar E. Stinson, Raymond Kwoczak and Michael J. Kurantz.Effect of cultural conditions on production of eicosapentaenoic acid by Pythium irregulare[J].Journal of Industrial Microbiology,1991 (8): 171-178)；并且该菌可以利用许多工业上的副产品来作为自身的碳源或氮源，例如该菌利用生物柴油副产物粗甘油来代替葡萄糖进行发酵，EPA产量可以达到105mg/L(孔秀梅，吴蕾.利用生物柴油副产物粗甘油发酵生产EPA[J]，食品科技，2012 37(7):180-184)。专利CN101434908A介绍了一种产二十碳五烯酸油脂的腐霉(Pythium sp.)HUST-RBB12 菌种，EPA产量约为2.1g/L。综上所述，当前EPA的相关生产菌株产量都很低，筛选EPA的高产菌株具有重要的工业应用价值。

[0004] 本发明从江苏省无锡市惠山树林的土壤中筛选得到了性状稳定、发酵周期短、二十碳五烯酸产量可达5.5g/L以上的畸雌腐霉菌株Pythium irregulare JN168，同时该菌的EPA含量占总油脂的30%以上，具有很好的工业应用前景。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，得到了性状稳定，产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，可通过固态或液态发酵生产二十碳五烯酸。

[0006] 本发明的技术方案：一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，命名为畸雌腐霉（Pythium irregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2012421。

[0007] 所述的畸雌腐霉菌株，其18S rDNA序列为 SEQ ID NO：1。

[0008] 该菌株代谢产物中二十碳五烯酸（EPA）的含量较高。

[0009] 该菌株可利用的碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉或马铃薯淀粉。

[0010] 该菌株可利用的氮源为无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。

[0011] 于江苏省无锡市惠山树林，选取落叶覆盖较密的土地，去除表层土，用取样铲垂直铲取10厘米深处土壤装入取样盒。称取1g左右土样于50mL离心管中加入9mL去离子水-1 -2 -3 -4溶解，取1mL溶解液加入到装有9mL去离子水的离心管中，依次类推制成10 ，10 ，10 ，10-2 -3 -4
各种梯度的菌悬液，取10 ，10 ，10 三个梯度进行平板涂布，放置在25℃的生化培养箱中倒置培养。分离用培养基为：蔗糖20g、MgSO4·7H2O 10mg、ZnCl2 1mg、FeSO4·7H2O 0.02mg、MoO3 0.02mg、CuSO4·5H2O 0.02mg、盐酸硫胺素100μg、琼脂23g、蒸馏水1000mL、万古霉素
75mg、五氯硝基苯100mg、青霉素 5000单位、匹马霉素5mg，pH自然。待单菌落长出后，挑取单菌落用苏丹黑B染色，脂肪颗粒被染成蓝紫色，挑选脂肪颗粒多且染色较深的菌株进行摇瓶复筛。收获摇瓶培养的菌丝体抽滤，冷冻干燥至恒重，研磨菌丝体，用索式提取法提取油脂，对提得的油脂进行GS-MS联用分析脂肪酸组成。反复采用以上的方法，经过多次筛选得到二十碳五烯酸高产菌株Pythium irregulare JN168。

[0012] 本发明涉及到的菌种有如下特征

[0013] 1.畸雌腐霉Pythium irregulare JN168培养条件

[0014] 该菌种的培养常规条件是好气培养。用于培养菌种的糖质原料可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉或马铃薯淀粉。培养用的氮源可以是无机铵盐、无机硝酸盐、酵母粉、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉。该菌株的生长温度范围为5℃-35℃，最适生长温度为25℃，二十碳五烯酸最佳积累温度为12℃，菌株在pH为2-9范围内能生长且代谢产二十碳五烯酸，二十碳五烯酸最佳积累pH为6.5。在菌种的培养过程中添加醋酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸镁、磷酸二氢钾等无机盐以及亚麻油对二十碳五烯酸的产量有促进作用。

[0015] 2.Pythium irregulare JN168的形态描述

[0016] 平板培养形态：Pythium irregulare JN168培养1天后，平板上出现质地较薄的白色菌落，菌落呈圆形。4天后，可看到大量棉花糖状的白色气生菌丝。用苏丹黑B染色后，在显微镜下可见菌丝体内蓝紫色脂肪颗粒。

[0017] 3.Pythium irregulare JN168的发酵特征

[0018] 可采用常规的液态发酵方法，利用上述菌种生产二十碳五烯酸。培养基可用含不同碳源、氮源、无机离子等普通培养基。

[0019] 培养基中也可添加适量的对所使用的微生物生长特别需要的营养物，一般情况，这些营养物存在于上述的天然营养源中。

[0020] 该菌株液态发酵过程中，24小时后开始产生二十碳五烯酸，96小时后二十碳五烯酸产量达到最大。

[0021] 该菌株液态发酵产二十碳五烯酸的最佳碳源为葡萄糖，最佳氮源为酵母粉。用该培养基在25℃下二十碳五烯酸的产量可达5.5g/L以上。

[0022] 4.Pythium irregulare JN168的18S、5.8S分子生物学特征见序列表SEQ ID NO：1。

[0023] 本发明的有益效果：该菌株由通过对江苏省无锡市惠山树林中的土壤进行分离筛选，得到了性状稳定，产二十碳五烯酸的畸雌腐霉菌株，可通过液态发酵生产二十碳五烯酸EPA，EPA产量可以5.5g/L以上，同时EPA占总油脂的30%以上。

[0024] 生物材料样品保藏

[0025] 一株产二十碳五烯酸的畸雌腐霉（Pythium irregulare）JN168，已保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：中国 武汉 武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2012421，保藏日期为2012年10月22日。

具体实施方式

[0026] 实施例1

[0027] 畸雌腐霉脂肪酸组成分析

[0028] 发酵菌株为畸雌腐霉Pythium irregulare JN168，采用液态发酵，采用标准PDA培养基。发酵温度25℃，4天后发酵结束。抽滤收集菌丝体，冷冻干燥至恒重，用研钵将菌丝体磨碎。取0.1g左右烘干的菌丝体，加入到有盖的试管中。向其中加入0.4mol/L的氢氧化钾-甲醇溶液5mL，在50℃水浴中保持1h，再向其中加入5mL 14%三氟化硼-甲醇溶液，在50℃水浴中保持1h，加入5mL正己烷抽提，最后加入2mL饱和氯化钠溶液水洗，移取上层溶液采用GC-MS联用检测。

[0029] 色谱条件：Finnigan Trace MS（美国）气相色谱-质谱仪。采用DB-MAX毛细管柱（30m×0.25mm×0.25µm）。起始柱温180℃，保持1min，以5℃/min升高到230℃，保持8min。进样口温度260℃，载气为氦气，流速为0.8mL/min，分流比为10︰1。

[0030] 质谱检测条件：EI+（70Ev），发射电流200µA，离子源温度350℃，接口温度260℃。由表1可以看出该菌种EPA(C20:5)的含量占总脂肪酸的31.5%，远高于当前已经报道的其它菌株。

[0031] 表1脂肪酸组成

[0032]

[0033] 实施例2

[0034] 最佳碳源的确定

[0035] 将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察积累二十碳五烯酸的最佳碳源，分别使用果糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、D-半乳糖、甘油、玉米粉、或马铃薯淀粉替代基本发酵培养基中的葡萄糖进行液态发酵，测量干重和二十碳五烯酸的产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表2可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳碳源为葡萄糖。

[0036] 表2 不同碳源下的二十碳五烯酸生产情况

[0037]

[0038] 实施例3

[0039] 最佳氮源的确定

[0040] 将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察积累二十碳五烯酸的最佳氮源，分别使用硝酸铵、硫酸铵、酵母膏、蛋白胨、花生饼粉或豆饼粉替代基本发酵培养基中的酵母粉进行液态发酵，测量干重和二十碳五烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表3可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳氮源为酵母粉。

[0041] 表3 不同氮源下的二十碳五烯酸生产情况

[0042]

[0043] 实施例4

[0044] 最佳温度的确定

[0045] 将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察二十碳五烯酸积累的最佳温度，分别将发酵温度调整到15℃、20℃、25℃、30℃、
35℃，测量干重和二十碳五烯酸产量。基本发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉
5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表4可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳温度为
25℃。

[0046] 表4 不同温度下的二十碳五烯酸生产情况

[0047]

[0048] 实施例5

[0049] 最佳pH的确定

[0050] 将保存在斜面上的畸雌腐霉Pythium irregulare JN168菌株接种到平板上，然后在25℃的培养箱中培养。平板培养基成分为：葡萄糖20g/L、酵母粉5g/L、琼脂20%。3天后，刮取平板上的菌丝于无菌水中，震荡打碎菌丝，并以10%接种量接种到种子培养基中，25℃摇床培养48小时，再以10%接种量接种到发酵培养基中，25℃摇床培养96小时。使用单因素考察积累二十碳五烯酸的最佳pH，分别将发酵pH调整到4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、
7.0、7.5测量干重和二十碳五烯酸产量。发酵培养基组成（w/v）：葡萄糖60g/L，酵母粉5g/L，pH 6.0，121℃灭菌20min。从表5可以看出菌株发酵产二十碳五烯酸的最佳pH为6.0。

[0051] 表5 不同pH值下的二十碳五烯酸生产情况

[0052]