一株肠膜明串珠菌菌株转让专利
申请号 : CN201310077194.0
文献号 : CN103320339B
文献日 : 2015-03-11
发明人 : 罗诗 , 胡文锋 , 马锞 , 徐匆 , 张长勇 , 罗华建 , 黄应维 , 胡珊 , 范妍 , 李艳芳
申请人 : 东莞市农业科学研究中心 , 华南农业大学
摘要 :
本发明涉及生物技术领域，公开了一株肠膜明串珠菌（LeuconostocMesenteroides）菌株，所述菌株已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏号是CCTCCM2012479。所述菌株对荔枝霜疫霉菌和/或炭疽病菌均具有良好的抑制作用，而且该菌株还能够明显降低荔枝或者龙眼的多酚氧化酶（PPO）和/或过氧化物酶（POD）的活性，保持果皮超氧化物歧化酶（SOD）活性。因此，该菌株在荔枝和龙眼等水果的保鲜方面具有重要的应用价值。
权利要求 :
1.一株肠膜明串珠菌 （Leuconostoc Mesenteroides）菌株，所述菌株于2012年11月
26日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCC M 2012479；所述肠膜明串珠菌能够明显降低荔枝或龙眼的多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，保持荔枝或龙眼果皮超氧化物歧化酶活性。
2.根据权利要求1所述菌株，其特征在于，所述菌株的菌落形态为：圆形，奶油白色，凸起生长，湿润。
3.一种权利要求1或2所述菌株的培养方法，其特征在于，是将所述菌株的甘油管冷冻保藏菌种按2%接种量到MRS液体培养基中，活化培养得到种子液；将种子液按5%的接种量接到MRS液体培养基中，培养发酵得发酵液，将发酵液经离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤后，离心即得。
4.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述MRS液体培养基成分：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖
20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温-80 1mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
5.根据权利要求3所述的培养方法，其特征在于，所述将发酵液经离心收集菌体是经
8000r/min、4℃离心。
说明书 :
一株肠膜明串珠菌菌株
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一株肠膜明串珠菌菌株。
背景技术
[0002] 新鲜果蔬从采收到到被消费者食用前，由于自身呼吸作用及病原生物侵染，每年都有大量果蔬从采收后在运输、贮藏过程中腐烂损失。国家农产品保鲜工程技术研究中心调查研究发现，我国目前每年年产的果蔬从田间到餐桌损失率高达25～30%，年损失近800亿人民币。因此进一步开展果蔬保鲜技术开发研究，以保证果蔬产品附加值的实现和资源的充分利用刻不容缓。
[0003] 与此同时，随着生活水平的提高，人们对水果等食品的要求越来越高，在对于水果的色、香、味要求基础上，人们越来越多地开始关注的是食品的安全与环保。
[0004] 目前国际通用的水果保鲜方法大致有两种。一种是乙烯吸收剂，通常是用透气袋来吸收乙烯，使水果不会进一步成熟，无药无害，但保鲜时间和效果不稳定。另一种是打蜡，很多水果自身会产生果蜡，可防病虫、微生物侵害，但储存、运输时果蜡容易被蹭掉部分，效果不能保证，而且不可避免地导致消费者食用到果蜡。适量的二氧化硫对荔枝、龙眼等水果有很好的保鲜效果，但过量使用导致残留超标，不但果品品质受影响，食用者也会出现头晕、恶心、呕吐和腹泻等症状，甚至会损伤肝肾功能。有报道称控制果蔬采后病害的最有效手段是冷藏结合化学杀菌剂处理。但由于化学杀菌剂残留危害人类健康，而且植物病原菌对化学杀菌剂容易产生抗药性，应用越来越受到限制。
[0005] 以人们喜爱的岭南佳果荔枝为例，荔枝果实营养丰富，其色、香、味具佳，具有“果王”的美称，极具开发价值，具有很好的经济效益，是我国在国际市场上最具竞争力的水果之一，我国是目前世界上栽培荔枝最多的国家。但荔枝很难保存，针对荔枝的保鲜，素有“一日色变，二日香变，三日味变，四日色香味尽去”的总结。荔枝的果实采摘季节处于短暂且炎热的夏季，采后自身呼吸作用旺盛，水分蒸发率高，在自身酶及外界病原菌侵袭的双重作用下极易褐变腐烂，不易贮藏，不耐贮运，严重限制了荔枝的远销与出口，制约了地域市场的开拓。据统计，荔枝每年因腐烂变质而造成的损失约占总产量的20％以上。
[0006] 目前，国内外荔枝果实的贮藏保鲜技术主要有物理贮藏和化学保鲜两种。荔枝果实的化学保鲜过程中常用防腐药物主要是苯来特、特克多、施保克、灭菌威、多菌灵等，如申请号为CN200610123793.1、CN03140439.1、CN201010127794.X等专利；此外还包括熏硫或亚硫酸盐处理等化学处理方式，例如申请号为CN96122329.4、CN97105377.4以及CN00130815.7等专利。虽然化学药剂能比较有效起到防腐、保鲜的作用，但其所产生的残留污染不仅影响风味，而且最重要的是残留对人体健康有潜在威胁。
[0007] 化学保鲜剂屡屡触动备受食品安全问题煎熬的消费者神经。加之喷酸荔枝、石灰芒果等报道见诸报端和网络，不断地引发消费者的不安。寻找安全无毒的生物保鲜技术，用于取代化学保鲜法，已经成为关注的热点。微生物种类丰富、代谢途径多样，并能产生对自然界病害菌有拮抗作用的活性物质。因此，利用微生物及其制剂来进行水果保鲜，能达到无毒、无害、无残留、无污染的要求，安全有效地消除化学药剂的残留，符合食品安全的发展趋势。
发明内容
[0008] 本发明所要解决的技术问题是克服现有果蔬生物保鲜技术的不足，提供一株肠膜明串珠菌菌株，为果蔬的生物保鲜技术领域提供有效的新菌株。
[0009] 本发明的另一个目的是所述菌株的培养方法。
[0010] 本发明的目的通过下述技术方案来实现：
[0011] 提供了一株肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)菌株，所述菌株已在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏号是CCTCCM2012479。所述中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武昌珞珈山。所述菌株命名为：肠膜明串珠菌dgnkzx002Leuconostoc Mesenteroides dgnkzx002。
[0012] 本发明人从东莞农业科学研究中心果园所产的无病虫害、无机械损伤的健康优质的龙眼果实中采集到所述菌株。
[0013] 具体地，将果实果皮撕成适当的小块，用手将果肉挤烂使果汁全部挤出（整个过程都是无菌操作）放于事先准备好的无菌烧瓶中，置于37℃厌氧培养箱内进行自然发酵培养。-1 -2 -3
发酵培养2天后，移取发酵液采用系列浓度梯度稀释法进行稀释，稀释成10 、10 、10 、-4 -5 -6 -4 -6
10 、10 、10 ，重复三次。取10 、10 两个梯度的稀释液，吸取0.2～0.3mL加到已凝固的MRS培养基上，然后用涂布棒迅速将发酵液均匀涂开。而后将平板倒置于37℃厌氧培养箱中培养。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。
发酵培养2天后，移取发酵液采用系列浓度梯度稀释法进行稀释，稀释成10 、10 、10 、-4 -5 -6 -4 -6
10 、10 、10 ，重复三次。取10 、10 两个梯度的稀释液，吸取0.2～0.3mL加到已凝固的MRS培养基上，然后用涂布棒迅速将发酵液均匀涂开。而后将平板倒置于37℃厌氧培养箱中培养。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化并进行革兰氏染色镜检。
[0014] 所述MRS培养基的组成成分为：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温-801mL，碳酸钙15g，琼脂18g，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0015] 本发明同时提供了所述菌株的培养方法：是将肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)dgnkzx002的甘油管冷冻保藏菌种按2%接种量到20mLMRS液体培养基中，活化培养得到种子液；将种子液按照5%的接种量接到1000mLMRS液体培养基中，培养发酵，发酵液经8000r/min、4℃离心收集菌体，用无菌生理盐水洗涤后，离心即得。
[0016] 所述MRS液体培养基成分：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0017] 所述肠膜明串珠菌菌株的生物形态学特征：在MRS培养基纯化平板上菌落形态为：圆形，奶油白色，凸起生长，湿润；显微镜观察菌体形态为：革兰式阳性球杆菌。
[0018] 所述肠膜明串珠菌对荔枝霜疫霉菌、炭疽病菌具有良好的抑制作用，而且该菌株还能够明显降低荔枝或龙眼的多酚氧化酶和/或过氧化物酶的活性，保持果皮超氧化物歧化酶（SOD）活性。因此，该菌株在荔枝或龙眼等水果的保鲜方面具有重要的应用价值。
[0019] 本发明提供一种优选地应用技术方案，将肠膜明串珠菌制备成一种保鲜菌剂，以肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)菌株的菌体悬液为有效的活性成分；所述保鲜菌剂包括以下重量百分含量的各组分：
[0020] 壳聚糖 0.5%～1.5%；
[0021] 柠檬酸 2%～3%；
[0022] 乳酸钠 1%～5%；
[0023] 曲酸 0.5%～1%；
[0024] 氯化钠 0.85%～0.9%；
[0025] 水 余量；
[0026] 在上述各组分组成的100%体系中加入所述肠膜明串珠菌(Leuconostoc8 9
Mesenteroides)菌株的菌体悬液，使其在体系中的最终浓度为10 ～10CFU/mL。
Mesenteroides)菌株的菌体悬液，使其在体系中的最终浓度为10 ～10CFU/mL。
[0027] 更为优选地，所述保鲜菌剂包括以下重量百分含量的各组分：
[0028] 壳聚糖 1%；
[0029] 柠檬酸 2%；
[0030] 乳酸钠 1%；
[0031] 曲酸 0.5%；
[0032] 氯化钠 0.85%；
[0033] 水 余量；
[0034] 肠膜明串珠菌的保鲜菌剂的应用，上述保鲜菌剂应用于水果能获得很好地保鲜效果，尤其是应用于岭南佳果荔枝或龙眼，能获得最好的保鲜效果。
[0035] 本发明通过长期大量的实验总结，所述保鲜菌剂对荔枝和龙眼均能获得很好地保鲜效果。在糯米糍荔枝、井岗红糯荔枝等品种荔枝以及东丰二号等品种龙眼的保鲜试验中，效果最为突出。
[0036] 优选地，所述肠膜明串珠菌的保鲜菌剂的应用具体为应用于抑制炭疽病菌和/或荔枝霜疫霉菌。
[0037] 优选地，所述肠膜明串珠菌的保鲜菌剂的应用具体为应用于抑制荔枝的多酚氧化酶和/或过氧化物酶。
[0038] 优选地，所述肠膜明串珠菌的保鲜菌剂的应用具体为应用于保持果皮超氧化物歧化酶（SOD）活性。
[0039] 所述菌株应用于果蔬保鲜具有很好的效果，尤其是应用于荔枝或者龙眼的保鲜。对常见的炭疽病和荔枝霜疫霉病等水果采后病害具有显著、稳定的抑菌效果。同时对荔枝多酚氧化酶和过氧化物酶也具有良好地抑制作用；对果皮超氧化物歧化酶（SOD）活性具有显著的保持作用。
[0040] 本发明具有以下有益效果：
[0041] 本发明提供了一株新的肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)dgnkzx002菌株，为果蔬的生物保鲜技术领域提供一个新的微生物成员，经试验证明，所述菌株对果蔬的保鲜具有显著的应用效果。尤其是对荔枝霜疫霉菌、荔枝炭疽病菌具有良好的抑制作用，而且该菌还能够明显降低水果的多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，保持果皮超氧化物歧化酶（SOD）活性。
[0042] 本发明基于新的肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)dgnkzx002菌株，为果蔬的生物保鲜技术领域提供一种新的保鲜菌剂。所述保鲜菌剂尤其是对荔枝霜疫霉菌、炭疽病菌具有良好的抑制作用，而且该菌还能够明显降低水果的多酚氧化酶和过氧化物酶的活性，保持果皮超氧化物歧化酶（SOD）活性。
[0043] 本发明在获得的肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)dgnkzx002菌株的基础上，将壳聚糖、柠檬酸、乳酸钠、曲酸、氯化钠与所述菌株的菌体悬液相配伍，获得了优良的果蔬保鲜效果。在选择菌剂辅料时，本发明人经过大量实验结合对各种辅料的性质研究，总结得到本发明技术方案：壳聚糖是一种安全无毒的多糖类物质，其不能被微生物所利用，因此能够抑制一些病原菌的生长，用壳聚糖作为本发明所述菌体悬液的载体的重要成分之一，可以在果皮表面形成一层具有保水、气调作用的保鲜膜，而本发明所用的保鲜用菌是兼性厌氧菌，能够在壳聚糖形成的低氧环境中长时间地保持活性，从而形成一个良好的保鲜体系；柠檬酸可以提供适宜的酸性环境，有助于壳聚糖的溶解，也有利于保持花色素苷的含量，最终有利于果皮颜色的保持；曲酸是经某些真菌好氧发酵产生的一种有机酸，广泛存在与发酵制品中，具有抗氧化和抑菌作用，能够抑制荔枝的褐变；本发明提供的菌剂体系中，能够发挥乳酸钠的保鲜和保水性能，经过不断分析研究和大量实验总结，在本发明提供的合适的配伍构成的体系下，菌株可以很好地成活并发挥活性作用，重要的是本发明菌体悬液体系共同产生了显著的应用技术效果。
[0044] 本发明在获得的肠膜明串珠菌(Leuconostoc Mesenteroides)dgnkzx002菌株的基础上，进一步总结得到各组分的合理配伍比例，在适宜的用量范围内，本发明的保鲜菌剂具有很好的保鲜效果，应用于荔枝或龙眼保鲜，贮藏25天后仍能保持鲜亮的外观和良好的风味，好果率可达86.7%；除此之外，本发明保鲜菌剂安全无毒、具有良好的保水性能、易溶于水便于食用前清洗等优点。
[0045] 本发明应用所述菌株制备菌剂并成功实现应用，克服了通常微生物菌的活性应用局限于实验室的缺陷，具有很好的实际应用前景。所述菌剂制备方法简单，应用方便，为微生物菌在果蔬保鲜方面的应用提供有力的技术启示和指导，具有重要的应用价值和实际推广应用可行性。
附图说明
[0046] 图1.肠膜明串珠菌dgnkzx002菌株菌落形态（MRS培养基，37℃，2天）。
[0047] 图2.肠膜明串珠菌dgnkzx002革兰氏染色镜检结果。
[0048] 图3炭疽病菌抑制对照。
[0049] 图4.肠膜明串珠菌dgnkzx002对炭疽病菌抑制效果图。
[0050] 图5.荔枝霜疫霉菌抑制对照。
[0051] 图6.肠膜明串珠菌dgnkzx002对荔枝霜疫霉菌抑制效果图。
[0052] 图7.肠膜明串珠菌dgnkzx002对POD活性影响效果图。
[0053] 图8.肠膜明串珠菌dgnkzx002对PPO活性影响效果图。
[0054] 图9.对照例和实施例2的井岗红糯荔枝褐变级数随贮藏时间变化的对比图。
[0055] 图10.对照例和实施例3的糯米糍荔枝好果率随贮藏时间变化的对比曲线图。
[0056] 图11.肠膜明串珠菌dgnkzx002处理后的龙眼好果率。
[0057] 图12.肠膜明串珠菌dgnkzx002对龙眼果皮PPO活性影响效果。
[0058] 图13.肠膜明串珠菌dgnkzx002对龙眼果皮POD活性影响效果。
[0059] 图14.肠膜明串珠菌dgnkzx002对龙眼果皮SOD活性影响效果。
[0060] 图15.本发明保鲜剂处理后龙眼果实的好果率（商品率，%）。
[0061] 图16.本发明保鲜剂处理后龙眼果实的失重率（%）。
[0062] 图17.本发明保鲜剂处理后龙眼果实的可溶性固形物（TSS）含量。
[0063] 图18.本发明保鲜剂处理后龙眼果实的维生素C含量。
[0064] 图19.本发明保鲜剂处理后龙眼果实的还原糖含量。
[0065] 图20.本发明保鲜剂处理后龙眼果实的总糖含量。
[0066] 图21.本发明保鲜剂处理后对龙眼果皮PPO活性影响效果。
[0067] 图22.本发明保鲜剂处理后对龙眼果皮POD活性影响效果。
[0068] 图23.本发明保鲜剂处理后对龙眼果皮SOD活性影响效果。
具体实施方式
[0069] 下面结合附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明内。
[0070] 实施例1
[0071] 本发明人于2011年9月11日从东莞农业科学研究中心果园所产的龙眼果实中采集健康、无病虫害、无机械损伤的龙眼果实，将150g果实剥皮、破碎放于事先准备好的无菌烧瓶中自然发酵，将果肉破碎后与果皮和果核一起在在37℃厌氧培养箱内进行发酵培养2天。发酵2天后，移取发酵液采用系列浓度梯度稀释法进行稀释，用无菌水将发酵液稀释成-1 -2 -3 -4 -5 -6 -4 -610 、10 、10 、10 、10 、10 共6个梯度的稀释液，重复三次。取10 、10 两个梯度的稀释液，吸取0.2～0.3mL加到已凝固的MRS培养基上，然后用涂布棒迅速将发酵液均匀涂开。
而后将平板倒置于37℃厌氧培养箱中培养。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落在MRS培养基纯化平板中进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化。
而后将平板倒置于37℃厌氧培养箱中培养。待菌落长出，挑取菌落形态差异明显的单菌落在MRS培养基纯化平板中进入平板划线分离，划线分离3次进行纯化。
[0072] 在MRS培养基纯化平板上菌落形态为：圆形，奶油白色，凸起生长，湿润，见附图1所示。
[0073] 所述MRS培养基的组成成分为：所述MRS培养基的组成成分为：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温-801mL，碳酸钙15g，琼脂18g，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0074] 将所述菌株在中国典型培养物保藏中心（CCTCC）保藏，保藏日期是2012年11月26日，保藏号是CCTCCM2012479。所述中国典型培养物保藏中心的地址为湖北省武汉市武昌珞珈山。所述菌株命名为：肠膜明串珠菌dgnkzx002Leuconostoc Mesenteroides dgnkzx002。
[0075] 革兰氏染色实验
[0076] S1.涂片：取一片干净无油载玻片，在其中央滴一滴无菌水，然后用接种环以无菌操作方法取少许培养好菌株，放在载玻片的水滴中涂匀，注意菌量不宜过多，否则，不易看清单个菌体。
[0077] S2.固定：将涂好的玻片在酒精灯火焰上快速通过3～4次，使水份蒸发，此时细菌菌体紧贴在玻片上。
[0078] S3.初染：加草酸铵结晶紫染色剂1滴，染色1分钟。
[0079] S4.媒染：倾去染液并用洗瓶装水轻轻冲洗，加碘液染色1分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。
[0080] S5.脱色：将载玻片略倾斜，滴加95%酒精脱色20～30秒（洗至流下的酒精中无紫色时为止），然后水洗。
[0081] S6.复染：在玻片上滴加番红染液约2分钟，水洗，然后用吸水纸吸干。染色中应防止染液干涸。
[0082] S7.镜检：干燥后用油镜进行镜检，镜检显示为一株革兰氏阳性球杆菌。菌体形态结果见附图2。
[0083] 抑菌试验：
[0084] 由于炭疽病和荔枝霜疫霉病是采后荔枝和龙眼最常见的病害，因此本实施例选用炭疽病菌、荔枝霜疫霉菌作为病原指示菌。
[0085] S1.制备孢子悬浮液：
[0086] 将50%甘油管冷冻保藏的肠膜明串珠菌dgnkzx002Leuconostoc Mesenteroides dgnkzx002的甘油管冷冻保藏的菌种按2%接种量到20mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置活化培养20小时；将活化好的种子液按5%接种量接到1000mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置培养20小时；发酵完成后，发酵液经8000r/min、4℃离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体。最后用适量生理盐水将菌体悬起制成细胞悬浮液。
[0087] MRS液体培养基成分：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0088] S2.对于炭疽病菌采用改良的琼脂扩散法：首先在无菌平板上倒一层琼脂含量1.5%（质量百分比含量）的PDA培养基（PDA培养基为常规配方，具体组成成份为：200g土豆去皮切成小块，加水煮软用纱布过滤后，在滤液中加入20g蔗糖和15g琼脂，最后加水补至1000mL，自然pH，121℃灭菌15min），吸取制备好的孢子悬浮液1ml，加入到熔化并冷却到
50℃左右的6mlPDA培养基（琼脂质量百分比含量为0.9%）中混匀，倾覆在已凝固的PDA平板上。待上层培养基冷却凝固后，在平板上打若干直径为6mm孔，分别将无细胞上清发酵液、含细胞发酵液以及用生理盐水制备的菌体细胞悬浮液加到不同的孔内进行抑菌试验，每处理设3个重复，以无菌水为对照，将平板置于28℃恒温培养箱内培养2～3天后观察抑菌情况及抑菌圈大小。实验结果见附图3和附图4所示，其中附图3为对照，附图4为dgnkzx002的抑菌实验结果。
50℃左右的6mlPDA培养基（琼脂质量百分比含量为0.9%）中混匀，倾覆在已凝固的PDA平板上。待上层培养基冷却凝固后，在平板上打若干直径为6mm孔，分别将无细胞上清发酵液、含细胞发酵液以及用生理盐水制备的菌体细胞悬浮液加到不同的孔内进行抑菌试验，每处理设3个重复，以无菌水为对照，将平板置于28℃恒温培养箱内培养2～3天后观察抑菌情况及抑菌圈大小。实验结果见附图3和附图4所示，其中附图3为对照，附图4为dgnkzx002的抑菌实验结果。
[0089] S3.对于荔枝霜疫霉菌用PDA平板对峙法：先在PDA培养基平板中央移入一直径约2cm的霜疫霉指示菌的琼脂块，由于霜疫霉生长周期较长移种后先让其生长2～3天，然后在距霜疫霉菌落边缘约5mm的地方打孔，分别在不同的孔内注入无细胞上清发酵液、含细胞发酵液以及用生理盐水制备的菌体细胞悬浮液进行抑菌试验，每个处理3次重复以无菌水为对照，将实验平板置于28℃培养箱培养3～5天，逐日观察、测量抑菌圈半径，实验结果见附图5和附图6所示，其中附图5为对照，附图6为dgnkzx002的抑菌实验结果。
[0090] S4.抑制酶活实验
[0091] 由于多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）是荔枝和龙眼褐变过程中最重要的两种酶，因此，实验选用PPO和POD进行酶活抑制试验。
[0092] 粗酶液的制备：
[0093] 取荔枝果皮2g，用5倍量的0.2MpH6.8的磷酸缓冲液加0.4gPVP冰浴研磨，4℃、9500r/min离心15min，收集上清液即为粗酶液，4℃保存备用。
[0094] POD：反应体系包括：2175μLpH6.8的磷酸缓冲液，375μL0.08%（体积比浓度）H2O2溶液，325μL抑制剂（50%甘油管冷冻保藏的dgnkzx002菌种按5%接种量在MRS液体培养基中发酵2天，发酵完成后，发酵液经9500r/min、4℃离心15min收集菌体，用0.9%无菌生6 9
理盐水洗涤2次，4℃放置备用。分别用0.9%生理盐水制备的细胞浓度为10 ～10CFU/
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mLdgnkzx002菌体悬液、无细胞发酵上清液、含细胞浓度为10 ～10CFU/mL发酵液作为抑制剂进行试验，对照组用0.2MpH6.8的磷酸缓冲液代替），750μL0.05M愈创木酚溶液，75μL稀释10倍的上述粗酶液，在470nm处测量吸光值，从上述酶液加入开始计时，每10秒记录一次吸光值，以最初直线斜率计算酶活。一个酶活单位定义为：在测定条件下，吸光值每分钟增大0.001所需的酶量，酶活平行测定三次。dgnkzx002对POD活性影响效果见附图7所示。
理盐水洗涤2次，4℃放置备用。分别用0.9%生理盐水制备的细胞浓度为10 ～10CFU/
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mLdgnkzx002菌体悬液、无细胞发酵上清液、含细胞浓度为10 ～10CFU/mL发酵液作为抑制剂进行试验，对照组用0.2MpH6.8的磷酸缓冲液代替），750μL0.05M愈创木酚溶液，75μL稀释10倍的上述粗酶液，在470nm处测量吸光值，从上述酶液加入开始计时，每10秒记录一次吸光值，以最初直线斜率计算酶活。一个酶活单位定义为：在测定条件下，吸光值每分钟增大0.001所需的酶量，酶活平行测定三次。dgnkzx002对POD活性影响效果见附图7所示。
[0095] PPO酶活性测定方法：反应体系包括：2550μL0.2MpH6.8的磷酸缓冲液（组成为：磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，参照常规方法配制），750μL0.2M邻苯二酚溶液（组成为：上述磷酸盐缓冲液制备的邻苯二酚溶液），325μL抑制剂（50%甘油管冷冻保藏的dgnkzx002菌种按5%接种量在MRS液体培养基中发酵2天，发酵完成后，发酵液经9500r/min、4℃离心
15min收集菌体，用0.9%无菌生理盐水洗涤2次，4℃放置备用。分别用0.9%生理盐水制
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备的细胞浓度为10 ～10CFU/mLdgnkzx002菌体悬液、无细胞发酵上清液、含细胞浓度为
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10 ～10CFU/mL发酵液作为抑制剂进行试验，对照组用前述0.2MpH6.8的磷酸缓冲液代替），75μL上述粗酶液。在398nm处测量吸光值，从上述酶液加入开始计时，每10秒记录一次吸光值，以最初直线斜率计算酶活。一个酶活单位定义为：在测定条件下，吸光值每分钟增大0.001所需的酶量，酶活平行测定3次。dgnkzx002对PPO活性影响效果见附图8所示。
15min收集菌体，用0.9%无菌生理盐水洗涤2次，4℃放置备用。分别用0.9%生理盐水制
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备的细胞浓度为10 ～10CFU/mLdgnkzx002菌体悬液、无细胞发酵上清液、含细胞浓度为
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10 ～10CFU/mL发酵液作为抑制剂进行试验，对照组用前述0.2MpH6.8的磷酸缓冲液代替），75μL上述粗酶液。在398nm处测量吸光值，从上述酶液加入开始计时，每10秒记录一次吸光值，以最初直线斜率计算酶活。一个酶活单位定义为：在测定条件下，吸光值每分钟增大0.001所需的酶量，酶活平行测定3次。dgnkzx002对PPO活性影响效果见附图8所示。
[0096] 肠膜明串珠菌dgnkzx002对荔枝霜疫霉菌和炭疽病菌具有抑制作用，同时对荔枝多酚氧化酶和荔枝过氧化物酶也具有很好的抑制作用的。
[0097] 实施例2
[0098] S1.保鲜菌的培养：
[0099] S11.菌株的活化：将保鲜菌株由甘油管按2%接种量到20mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置活化培养20小时；
[0100] MRS液体培养基成分：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0101] S12.扩大培养：将活化好的种子液按5%的接种量接种到1000mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置培养20小时；
[0102] S13.菌体悬液制备：发酵完成后，发酵液经8500r/min、4℃离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体。最后用适量生理盐水将菌体悬起制成8
细胞悬浮液,菌体浓度2.4×10CFU/mL。
细胞悬浮液,菌体浓度2.4×10CFU/mL。
[0103] S2.以井岗红糯荔枝为试材进行试验。在晴天早上采摘荔枝果实，选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的荔枝果实；迅速运回实验室，用紫外灯照射30min进行杀菌处理；用上述菌液均匀喷涂在荔枝果实表面，常温晾干后以泡沫箱盛装，并在箱内部铺垫报纸，以免荔枝果皮被呼吸作用产生在箱壁上的水珠浸渍引起褐变，在30±2℃、相对湿度85%～90%的高温高湿条件下贮藏，贮藏期间能观察到实验组颜色明显好于对照组。结果如附图9所示。
[0104] 对照例：
[0105] 选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的荔枝果实；用紫外灯照射30min进行杀菌处理；用自来水均匀喷涂在荔枝果实表面，常温晾干后以内衬报纸的泡沫箱盛装，在30±2℃、相对湿度85%～90%的高温高湿条件下贮藏。
[0106] 实施例3：保鲜剂应用实验
[0107] 在确定菌株有保鲜作用的前提下，本发明以肠膜明串珠菌菌株的菌体悬液为有效的活性成分，同时确定了合理相配的生物物质复配出一种安全、高效的生物保鲜剂。所述保鲜菌剂包括以下质量百分含量的各组分：1%壳聚糖、2%柠檬酸、0.85%氯化钠、0.5%曲酸和2%乳酸钠，余量为水；在上述各组分组成的100%体系中加入所述菌株的菌体悬液，使其在
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体系中的菌体浓度为2.9×10CFU/mL，配制得到一种保鲜剂。
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体系中的菌体浓度为2.9×10CFU/mL，配制得到一种保鲜剂。
[0108] S1.保鲜菌的培养：
[0109] S11.菌株的活化：将肠膜明串珠菌dgnkzx002Leuconostoc Mesenteroides dgnkzx002的甘油菌种按2%接种量到20mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置活化培养20小时，得种子液；
[0110] S12.扩大培养：将活化好的种子液按5%接种量接种到1000mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置培养20小时；
[0111] S13.菌体悬液制备：发酵完成后，发酵液经9500r/min、4℃离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体。最后用适量生理盐水将菌体悬起制成细胞悬浮液。
[0112] MRS液体培养基成分：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0113] S2.保鲜菌剂的配制：保鲜菌剂含有如下质量百分比的组分：1%壳聚糖、2%柠檬8
酸、0.85%氯化钠、0.5%曲酸和2%乳酸钠，余量为水，菌体浓度2.9×10CFU/mL。先按配方称取曲酸、氯化钠和柠檬酸混合均匀，加入适量水加热至60～70℃并充分搅拌均匀，使其完全溶解，在溶液中边搅拌边缓慢加入按质量百分比称好的壳聚糖（壳聚糖脱乙酰度≧95%，粘度100～200mPa.s），待壳聚糖充分溶胀，溶液冷却至室温后加入乳酸钠，最后加入菌体
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悬液和剩余水，使保鲜剂中菌体浓度为2.9×10CFU/mL。
酸、0.85%氯化钠、0.5%曲酸和2%乳酸钠，余量为水，菌体浓度2.9×10CFU/mL。先按配方称取曲酸、氯化钠和柠檬酸混合均匀，加入适量水加热至60～70℃并充分搅拌均匀，使其完全溶解，在溶液中边搅拌边缓慢加入按质量百分比称好的壳聚糖（壳聚糖脱乙酰度≧95%，粘度100～200mPa.s），待壳聚糖充分溶胀，溶液冷却至室温后加入乳酸钠，最后加入菌体
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悬液和剩余水，使保鲜剂中菌体浓度为2.9×10CFU/mL。
[0114] S3.以糯米糍荔枝为对象进行试验。在晴天早上采摘荔枝果实，选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的荔枝果实；5℃条件下对荔枝预冷2h，20℃空调房冷风吹干表面水分；用紫外灯照射30min进行杀菌处理；用上述保鲜剂浸泡荔枝果实3min，冷风吹干，以食盒盛装，并在食盒内部铺垫包装纸以免荔枝果皮被水珠浸渍引起褐变，在5℃、相对湿度80%～90%条件下贮藏。在25天的贮藏期后，实验组好果率可达86.7%而对照组只有20%。
[0115] 对照例选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的荔枝果实。5℃条件下对荔枝预冷2h，冷风吹干表面水分。用紫外灯照射30min进行杀菌处理。以食盒盛装，并在食盒内部铺垫包装纸以免荔枝果皮被水珠浸渍引起褐变，在5℃、相对湿度80%～90%条件下贮藏。实验结果见附图10所示。
[0116] 实施例4菌株的应用实验
[0117] S1.保鲜菌的培养：
[0118] S11.菌株的活化：将保鲜菌株由甘油管按2%接种量到20mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置活化培养20小时；
[0119] MRS液体培养基成分：1L蒸馏水、蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，磷酸氢二钾2g，柠檬酸二铵2g，乙酸钠5g，葡萄糖20g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，吐温801mL，pH6.2～6.4，121℃灭菌15min。
[0120] S12.扩大培养：将活化好的种子液按5%的接种量接种到1000mLMRS液体培养基中，并于37℃培养箱中静置培养20小时；
[0121] S13.菌体悬液制备：发酵完成后，发酵液经8500r/min、4℃离心15min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤2次，离心获得所需的活菌体。最后用适量生理盐水将菌体悬起制成8
细胞悬浮液，菌体浓度2.4×10CFU/mL。
细胞悬浮液，菌体浓度2.4×10CFU/mL。
[0122] S2.以龙眼为试材进行试验。在晴天早上采摘龙眼果实，选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的龙眼果实；迅速运回实验室，用紫外灯照射30min进行杀菌处理；用上述菌液均匀喷涂在龙眼枝果实表面，常温晾干后以泡沫箱盛装，并在箱内部铺垫报纸，以免荔枝果皮被呼吸作用产生在箱壁上的水珠浸渍引起褐变，在29～32℃和相对湿度97%～99%的高温高湿条件下贮藏，贮藏期间能观察到实验组颜色明显好于对照组。
[0123] 对照例：
[0124] 选取健康无病虫害、大小均一、无机械损伤、约8成熟的龙眼果实；用紫外灯照射30min进行杀菌处理；用清水和施保克均匀喷涂在荔枝果实表面，常温晾干后以内衬报纸的泡沫箱盛装，在29～32℃和相对湿度97%～99%的高温高湿条件下贮藏。
[0125] 结果如附图11～14所示。附图11显示了各处理好果率，清水处理好果率为13.33%，施保克处理好果率40%，dgnkzx002处理好果率为43.33%。附图12显示了PPO抑制结果，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为dgnkzx002处理。附图13显示了POD抑制结果，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为dgnkzx002处理。附图14显示了SOD保持结果，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为dgnkzx002处理。
[0126] 实施例5应用实验
[0127] 应用本发明保鲜菌剂对龙眼进行保鲜试验，保鲜菌剂的配制参照实施例3。
[0128] 试验材料：龙眼。
[0129] 试验方法：晴天早上采摘龙眼果实，运回实验室备用。分别设置本发明保鲜剂实验组、清水处理组和施保克处理，三组都选择大小均匀、色泽一致、无病虫、无损伤的健康果实进行试验，三个重复，每个重复1公斤。各组分别用本发明保鲜菌剂、清水和施保克浸泡龙眼果实1分钟，晾干。分装到塑料篮子中，在室温为29～32℃和相对湿度97%～99%下贮藏，7天后进行好果率、还原糖含量和维生素C含量的调查。实验结果请见附图15～23所示。附图17中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。附图18中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。附图19中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。附图20中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。附图21中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。附图22中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。附图23中，曲线1为清水处理，曲线2为施保克处理，曲线3为本发明保鲜剂处理。
[0130] 实验结果总结，本发明保鲜剂处理的龙眼果皮多酚氧化酶（PPO）和过氧化物酶（POD）活性都明显小于清水、施保克处理，超氧化物歧化酶（SOD）活性得到了较好的保持。而且，本发明保鲜剂处理能有效延缓果肉总糖、还原糖、维生素C(Vc)、可溶性固形物(TSS)和可滴定酸(TA)含量的降低，保持果实风味，防止腐生菌侵染，提高龙眼果实的商品率（好果率（%））。