本发明公开了一种用于培育转基因植物的培养基。本发明提供的培养基组由愈伤诱导培养基、继代培养基、共培养培养基、筛选培养基和再生培养基组成；本发明的实验证明，本发明提供的转化体系及转化方法，平均每100个二穗短柄草幼胚就能产生约103个阳性转化苗，阳性苗转化率达到103.4％，远远高于传统的和谷类模式植物水稻。水稻阳性苗的最高转化率为47.6％(植物学通报，2008年，25(3)，322-331)。短柄草高效的农杆菌转化体系为温带和谷类植物基因功能研究提供了重要的技术手段。
1.一种用于培育转基因二穗短柄草Bd21的培养基组，由愈伤诱导培养基、继代培养基、共培养培养基、筛选培养基和再生培养基组成；
所述愈伤诱导培养基是在MS基本培养基中添加2，4-D、麦芽糖、L-天冬酰胺、肌醇、水解酪蛋白、脯氨酸和盐酸硫胺素，得到愈伤诱导培养基；其中，所述2，4-D在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为2.5mg/L，所述麦芽糖在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为30mg/L，所述L-天冬酰胺在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为150mg/L，所述肌醇在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为0.2g/L，所述水解酪蛋白在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为0.5g/L，所述脯氨酸在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为700mg/L，所述盐酸硫胺素在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为1.5mg/L；
所述继代培养基是在MS基本培养基中添加2，4-D和6-BA，得到继代培养基；其中，所述2，4-D在所述继代培养基中的终浓度为2.5mg/L，所述6-BA在所述继代培养基中的终浓度为0.01mg/L，所述共培养培养基是在MS基本培养基中添加葡萄糖和乙酰丁香酮，得到共培养培养基；其中，所述葡萄糖在所述共培养培养基中的终浓度为10g/L，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的终浓度为200μM，所述筛选培养基是在MS基本培养基中添加巴龙霉素和特美汀，得到筛选培养基；其中，所述巴龙霉素在所述筛选培养基中的终浓度为25mg/L-50mg/L，所述特美汀在所述筛选培养基中的终浓度为125mg/L-225mg/L；
所述再生培养基是在MS基本培养基中添加细胞激动素，得到再生培养基；其中，所述细胞激动素在所述再生培养基中的终浓度为0.2mg/L。
所述筛选培养基为如下筛选培养基I或筛选培养基II：
所述筛选培养基I中，所述巴龙霉素在所述筛选培养基I中的终浓度为25mg/L，所述特美汀在所述筛选培养基I中的终浓度为225mg/L；
所述筛选培养基II中，所述巴龙霉素在所述筛选培养基II中的终浓度为50mg/L，所述特美汀在所述筛选培养基II中的终浓度为125mg/L。
3.根据权利要求1或2所述的培养基组，其特征在于：
各种所述培养基中均还包括凝固剂，所述凝固剂具体为琼脂，所述琼脂在所述各种培养基中的浓度均为7g/L。
4.一种制备权利要求1-3中任一所述培养基组的方法，包括如下步骤：
1)制备权利要求1-3中任一所述培养基组中的所述愈伤诱导培养基、所述继代培养基、所述共培养培养基、所述筛选培养基和所述再生培养基；
2)将步骤1)得到的所述愈伤诱导培养基、所述继代培养基、所述共培养培养基、所述筛选培养基和所述再生培养基独立包装，得到培养基组。
所述愈伤诱导培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述2，4-D、所述麦芽糖、所述L-天冬酰胺、所述肌醇、所述水解酪蛋白、所述脯氨酸和所述盐酸硫胺素按照所述各自终浓度添加在MS基本培养基中得到；
所述继代培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述2，4-D和所述6-BA按照各自所述终浓度添加在MS基本培养基中得到；
所述共培养培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述葡萄糖和所述乙酰丁香酮按照各自所述终浓度添加在MS基本培养基中得到；
所述筛选培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述巴龙霉素和所述特美汀按照各自所述终浓度添加在MS基本培养基中得到；
所述再生培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述细胞激动素按照所述终浓度添加在MS基本培养基中得到。
在各种所述培养基中均还添加凝固剂，所述凝固剂具体为琼脂，所述琼脂在所述各种培养基中的浓度均为7g/L。
7.权利要求1-3中任一所述的培养基组在培育转基因植物中的应用；所述植物为二穗短柄草Bd21。
8.一种培育转基因短柄草Bd21的方法，包括如下步骤：
1)将二穗短柄草Bd21外植体在权利要求1-3中任一所述的培养基组中的所述愈伤诱导培养基中培养，得到胚性愈伤组织；
2)将步骤1)得到的胚性愈伤组织在权利要求1-3中任一所述的培养基组中的所述继代培养基中培养，得到继代胚性愈伤组织块；
3)将目的基因导入步骤2)得到的继代胚性愈伤组织块后，在共培养培养基中培养，得到共培养愈伤组织块；
4)将步骤3)得到的共培养愈伤组织块依次在所述筛选培养基I和所述筛选培养基II中培养，得到抗性愈伤组织；
5)将步骤4)得到的抗性愈伤组织在再生培养基中培养，即得到转基因二穗短柄草Bd21。
步骤2)中，所述培养为继代培养2-3次；所述每次继代培养为在25℃暗培养2-3周；
所述培养具体为继代培养3次；所述每次继代培养为在25℃暗培养3周；
步骤3)中，所述目的基因导入步骤2)得到的继代胚性愈伤组织块为将所述继代胚性愈伤组织块浸泡在含有所述目的基因的重组农杆菌菌液中，所述浸泡的温度为23℃-28℃；
所述浸泡的时间为8-10min，所述浸泡的温度具体为25℃，所述浸泡的时间具体为10min；
步骤4)中，所述在所述筛选培养基I培养为在25℃培养暗培养2-3周，所述在所述筛选培养基I培养具体为在25℃培养暗培养2周；
所述在所述筛选培养基II培养为在25℃培养暗培养4周；
步骤5)中，所述在再生培养基中培养为25℃光照培养3周-5周，所述在再生培养基中培养的时间具体为3周，所述光照强度为6000Lux，所述光照周期为16小时光照、8小时黑暗。
在所述步骤2)和步骤3)之间还包括将所述继代胚性愈伤组织块在所述继代培养基中预培养的步骤，所述预培养为25℃暗培养3-4天，所述预培养具体为25℃暗培养4天；
步骤3)中，所述含有目的基因的重组农杆菌菌液为悬浮含有所述目的基因的重组农杆菌得到的菌液。
一种用于培育转基因植物的培养基
技术领域
[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种用于培育转基因植物的培养基。
背景技术
[0002] 短 柄 草 学 名 二 穗 短 柄 草(Brachypodium distachyon(L.)P.Beauv)，又名Purple False Brome，起源于地中海和中东地区，属禾亚科(Pooideae)短柄草属(Brachypodieae)，在系统进化中与温带和谷类粮食作物(Temperate cereals)、禾草类植物(Meadow and Forage grasses)处于同一进化分枝。由于短柄草植株矮小(15-20cm)，基因组只有272Mb，自花授粉、生育期短(8-12周)，易栽培，近年来已经迅速发展成为一种新的温带和谷类粮食、禾草类植物的模式植物。2010年2月份国际短柄草启动委员会(The International Brachypodium Initiative)已经完成了二穗短柄草Bd21的全基因组测序分析工作(http://www.brachypodium.org)。作为研究温带和谷类粮食、禾草类植物基因功能的模式植物，高效快速的农杆菌转化系统至关重要。
[0003] 国际上早在2001年就开始对短柄草的农杆菌转化进行研究，但所用基因型不同，而且平均转化效率很低(Draper，J等，2001)。2008年美国USDA Western Regional Research Center的John Vogel，以短柄草株系Bd21-3作为受体，使平均转化效率达到37％，所用诱导愈伤培养基是：LS盐，3％蔗糖，2，4-D 11.25μM，0.2％植物凝胶，然而Bd21-3在遗传背景上与Bd21有很大差异(Vogel，J等，2008)。英国John Innes Centre的Philippe Vain以测序株系Bd21建立了高效的转化体系，该体系以MS培养基为基本培养基，潮霉素为植物筛选标记，操作繁琐，而且不适合国内应用。
发明内容
[0004] 本发明的一个目的是提供一种用于培育转基因短柄草的培养基组。
[0005] 本发明提供的培养基组，由愈伤诱导培养基、继代培养基、共培养培养基、筛选培养基和再生培养基组成；
[0006] 所述愈伤诱导培养基是在MS基本培养基中添加2，4-D、麦芽糖、L-天冬酰胺、肌醇、水解酪蛋白、脯氨酸和盐酸硫胺素，得到愈伤诱导培养基；其中，所述2，4-D在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为2.5mg/L，所述麦芽糖在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为30mg/L，所述L-天冬酰胺在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为150mg/L，所述肌醇在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为0.2g/L，所述水解酪蛋白在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为0.5g/L，所述脯氨酸在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为700mg/L，所述盐酸硫胺素在所述愈伤诱导培养基中的终浓度为1.5mg/L；
[0007] 所述继代培养基是在MS基本培养基中添加2，4-D和6-BA，得到继代培养基；其中，所述2，4-D在所述继代培养基中的终浓度为2.5mg/L，所述6-BA在所述继代培养基中的终浓度为0.01mg/L，
[0008] 所述共培养培养基是在MS基本培养基中添加葡萄糖和乙酰丁香酮，得到共培养培养基；其中，所述葡萄糖在所述共培养培养基中的终浓度为10g/L，所述乙酰丁香酮在所述共培养培养基中的终浓度为200μM，
[0009] 所述筛选培养基是在MS基本培养基中添加巴龙霉素和特美汀，得到筛选培养基；其中，所述巴龙霉素在所述筛选培养基中的终浓度为25mg/L-50mg/L，所述特美汀在所述筛选培养基中的终浓度为125mg/L-225mg/L；
[0010] 所述再生培养基是在MS基本培养基中添加细胞激动素，得到再生培养基；其中，所述细胞激动素在所述再生培养基中的终浓度为0.2mg/L。
[0011] 上述培养基组中，所述筛选培养基为如下筛选培养基I或筛选培养基II：
[0012] 所述筛选培养基I中，所述巴龙霉素在所述筛选培养基I中的终浓度为25mg/L，所述特美汀在所述筛选培养基I中的终浓度为225mg/L；
[0013] 所述筛选培养基II中，所述巴龙霉素在所述筛选培养基II中的终浓度为50mg/L，所述特美汀在所述筛选培养基II中的终浓度为125mg/L。
[0014] 上述培养基组中，各种所述培养基中均还包括凝固剂，所述凝固剂具体为琼脂，所述琼脂在所述各种培养基中的浓度均为7g/L。
[0015] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述培养基组的方法。
[0016] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0017] 1)制备上述培养基组中的所述愈伤诱导培养基、所述继代培养基、所述共培养培养基、所述筛选培养基和所述再生培养基；
[0018] 2)将步骤1)得到的所述愈伤诱导培养基、所述继代培养基、所述共培养培养基、所述筛选培养基和所述再生培养基独立包装，得到培养基组。
[0019] 上述方法中，所述愈伤诱导培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述2，4-D、所述麦芽糖、所述L-天冬酰胺、所述肌醇、所述水解酪蛋白、所述脯氨酸和所述盐酸硫胺素按照所述各自终浓度添加在MS基本培养基中得到；
[0020] 所述继代培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述2，4-D和所述6-BA按照所述各自终浓度添加在MS基本培养基中得到；
[0021] 所述共培养培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述葡萄糖和所述乙酰丁香酮按照所述各自终浓度添加在MS基本培养基中得到；
[0022] 所述筛选培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述巴龙霉素和所述特美汀按照所述各自终浓度添加在MS基本培养基中得到；
[0023] 所述再生培养基按照包括如下步骤的方法制备：将所述细胞激动素按照所述终浓度添加在MS基本培养基中得到。
[0024] 上述方法中，在各种所述培养基中均还添加凝固剂，所述凝固剂具体为琼脂，所述琼脂在所述各种培养基中的浓度均为7g/L。
[0025] 上述的培养基组在培育转基因植物中的应用也是本发明保护的范围；上述应用中，所述植物具体为二穗短柄草。
[0026] 本发明的第三个目的是提供一种培育转基因植物的方法。
[0027] 本发明提供的方法，包括如下步骤：
[0028] 1)将植物外植体在上述的培养基组中的所述愈伤诱导培养基中培养，得到胚性愈伤组织；
[0029] 2)将步骤1)得到的胚性愈伤组织在上述的培养基组中的所述继代培养基中培养，得到继代胚性愈伤组织块；3)将目的基因导入步骤2)得到的继代胚性愈伤组织块后，在共培养培养基中培养，得到共培养愈伤组织块；
[0030] 4)将步骤3)得到的共培养愈伤组织块依次在所述筛选培养基I和所述筛选培养基II中培养，得到抗性愈伤组织；
[0031] 5)将步骤4)得到的抗性愈伤组织在再生培养基中培养，即得到转基因植物。
[0032] 上述方法中，步骤1)中，所述培养为在25℃暗培养3周-4周；所述培养具体为在25℃暗培养4周；
[0033] 步骤2)中，所述培养为继代培养2-3次；所述每次继代培养为在25℃暗培养2-3周；所述培养具体为继代培养3次；所述每次继代培养为在25℃暗培养3周；
[0034] 步骤3)中，所述目的基因导入步骤2)得到的继代胚性愈伤组织块为将所述继代胚性愈伤组织块浸泡在含有目的基因的重组农杆菌菌液中，所述浸泡的温度为23℃-28℃；所述浸泡的时间为8-10min，所述浸泡的温度具体为25℃，所述浸泡的时间具体为10min；
[0035] 所述在共培养培养基中培养为在25℃暗培养3天；
[0036] 步骤4)中，所述在所述筛选培养基I培养为在25℃培养暗培养2-3周，所述在所述筛选培养基I培养具体为在25℃培养暗培养2周；
[0037] 所述在所述筛选培养基II培养为在25℃培养暗培养4周；
[0038] 步骤5)中，所述在再生培养基中培养为25℃光照培养3周-5周，所述在再生培养基中培养的时间具体为3周，所述光照强度为6000Lux，所述光照周期为16小时光照、8小时黑暗。
[0039] 上述方法中，步骤1)中，所述外植体为幼胚，所述植物为二穗短柄草；
[0040] 在所述步骤2)和步骤3)之间还包括将所述继代胚性愈伤组织块在所述继代培养基中预培养的步骤，所述预培养为25℃暗培养3-4天，所述预培养具体为25℃暗培养4天；
[0041] 步骤3)中，所述含有目的基因的重组农杆菌菌液为悬浮含有所述目的基因的重组农杆菌得到的菌液，所述含有所述目的基因的重组农杆菌具体为将pK7G2D导入根癌农杆菌中得到的重组菌。
[0042] 本发明的实验证明，本发明利用提供的培养基及培养方法进行目的基因转化二穗短柄草，检测平均每100个二穗短柄草幼胚就能产生约103个阳性转化苗，阳性苗转化率达到103.4％，远远高于传统的和谷类模式植物水稻。水稻阳性苗的最高转化率为47.6％(植物学通报，2008年，25(3)，322-331)。短柄草高效的农杆菌转化体系为温带和谷类植物基因功能研究提供了重要的技术手段。
附图说明
[0043] 图1为转基因二穗短柄草获得的流程图
具体实施方式
[0044] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0045] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0046] 下述实施例中所用的MS基本培养基由溶剂和溶质组成，溶剂为水，溶质具体配方如下：
[0047] 表1.MS基本培养基的溶质
[0048]大量元素 培养基中浓度(g·L-1)
NH4NO3 1.65
KNO3 1.9
KH2PO4 0.17
MgSO4.7H2O 0.37
CaCl2 0.44
微量元素 培养基中浓度(mg·L-1)
FeSO4.7H2O 27.8
Na2EDTA 37.3
MnSO4.4H2O 22.3
ZnSO4.4H2O 8.6
H3BO3 6.2
KI 0.83
Na2MoO4.2H2O 0.25
CuSO4.5H2O 0.025
CoCl2.6H2O 0.025
有机成分 培养基中浓度(mg·L-1)
[0049]甘氨酸 2.0
盐酸硫胺素 0.4
盐酸吡哆素 0.5
烟酸 0.5
肌醇 100
[0050] 实施例1、培养基的制备
[0051] 1、愈伤诱导培养基
[0052] 将2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、麦芽糖、L-天冬酰胺、肌醇、水解酪蛋白、脯氨酸、盐酸硫胺素、琼脂添加到MS基本培养基中，得到愈伤诱导培养基，其中，2，4-D在愈伤诱导培养基中的终浓度为2.5mg/L，麦芽糖在愈伤诱导培养基中的终浓度为30mg/L，L-天冬酰胺在愈伤诱导培养基中的终浓度为150mg/L，肌醇在愈伤诱导培养基中的终浓度为0.2g/L，水解酪蛋白在愈伤诱导培养基中的终浓度为0.5g/L，脯氨酸在愈伤诱导培养基中的终浓度为700mg/L，盐酸硫胺素在愈伤诱导培养基中的终浓度为1.5mg/L，琼脂在愈伤诱导培养基中的终浓度为7g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH为5.8。
[0053] 2、继代培养基
[0054] 将2，4-D、6-BA(6-苄氨基嘌呤)、琼脂添加到MS基本培养基中，得到继代培养基，其中，2，4-D在继代培养基中的终浓度为2.5mg/L，6-BA在继代培养基中的终浓度为0.01mg/L，琼脂在愈伤诱导培养基中的终浓度为7g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH为
5.8。
[0055] 3、共培养培养基
[0056] 将葡萄糖、乙酰丁香酮、琼脂添加到MS基本培养基中，得到共培养培养基，其中，葡萄糖在共培养培养基中的终浓度为10g/L，乙酰丁香酮在共培养培养基中的终浓度为200μM，琼脂在愈伤诱导培养基中的终浓度为7g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH为
5.2。
[0057] 4、筛选培养基I
[0058] 筛选培养基I：将巴龙霉素、Timetin(特美汀)、琼脂添加到MS基本培养基中，得到筛选培养基I，巴龙霉素在筛选培养基I中的终浓度为25mg/L，Timetin在筛选培养基I中的终浓度为225mg/L，琼脂在愈伤诱导培养基中的终浓度为7g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH值为5.8。
[0059] 筛选培养基II：将巴龙霉素、Timetin(特美汀)、琼脂添加到MS基本培养基中，得到筛选培养基II，巴龙霉素在筛选培养基II中的终浓度为50mg/L，Timetin在筛选培养基II中的终浓度为125mg/L，琼脂在愈伤诱导培养基中的终浓度为7g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH值为5.8。
[0060] 5、再生培养基
[0061] 将KT(细胞激动素，kinetin，化学名称6-糠基氨基嘌呤(或n6-呋喃甲基腺嘌呤)。)、琼脂添加到MS基本培养基中，得到再生培养基，其中，KT在再生培养基中的终浓度为0.2mg/L，琼脂在愈伤诱导培养基中的终浓度为7g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH为5.8。
[0062] 实施例2、转基因二穗短柄草的获得
[0063] 转基因二穗短柄草获得的流程图如图1所示，其中，A为二穗短柄草Bd21、B为二穗短柄草Bd21幼胚、C为愈伤诱导培、D为继代培养、E为外源DNA侵染愈伤组织块、F为发荧光的愈伤组织块、G为愈伤组织再生小苗、H为阳性再生苗。
[0064] 一、外植体获得
[0065] 二穗短柄草(Brachypodium distachyon(L.)P.Beauv)Bd21(王宏归、王保莉、林辰涛、傅永福，二穗短柄草Bd21的形态学观察，西北农业学报，2007年6期，二穗短柄草Bd21的形态学观察，公众可从中国科学院植物研究所获得)。
[0066] Bd21的种植：催芽：将短柄草种子室温下放在吸水纸催芽3-5天(视温度而定)，芽长到1-2cm时移栽到花盆，如果想提高发芽率，将种皮去掉。移栽时不要埋土过深，栽后浇水。培养条件：22度，16小时光照，光照强度达到6000Lux，8小时黑暗。
[0067] 取开花授粉三周左右的Bd21幼穗于70％酒精消毒7min，无菌水冲洗数次；用手(带无菌手套)拨开颖壳，油丝镊挑出Bd21幼胚。
[0068] 二、EHA105/pK7G2D菌悬液的制备
[0069] 1)pK7G2D载体
[0070] 带有卡那霉素抗性，带绿色荧光标记蛋白GFP，其构建方法如下：
[0071] 使用的基础载体有pK7WG2D.1、pK7GWIWG2D(II).0和pENTR4(均为Invitrogen公司的Gateway Destination vector网址：http://gateway.psb.ugent.be/index)。
[0072] pK7G2D载体的具体构建方法：
[0073] 第一步：将pK7GWIWG2D(II).0中的HindIII片断(p35S启动子，700bp)切下，连接到去掉HindIII片断的pK7WG2D.1载体，得到带有ccd毒蛋白，启动子换成p35S的pK7WG2D.1载体，命名为pK7.1；
[0074] 第二步：EcoRI单酶切pENTR4载体，去掉毒蛋白，命名为pENTR4-ccd；
[0075] 第三步：pK7.1与pENTR4-ccd在LR重组酶(Invitrogen，Cat.No.11791-100)作用下发生交换反应，去掉ccd毒蛋白，成为用于转化短柄草的简单插入载体pK7G2D。
[0076] 2)菌株根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105
[0077] 将载体pK7G2D转入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105(Hooykaas PJ，Schilperoort RA.Agrobacterium and plant genetic engineering.Plant Mol Biol.1992May；19(1)：15-38，公众可从中国科学院植物研究所获得。)中，其中携带载体pK7G2D的EHA105命名为EHA105/pK7G2D，在固体培养基MGL培养加利福平(50mg/L)、壮观霉素(100mg/L)筛选，得到转化子即为阳性重组菌，命名为EHA105/pK7G2D。
[0078] 培养农杆菌EHA105/pK7G2D的固体培养基MGL配方：
[0079]
[0080] 待培养基冷却到60度左右，倒平板前加200μM AS(乙酰丁香酮)+75mg/L壮观霉素，50mg/L利福平。
[0081] 3)EHA105/pK7G2D菌悬液的制备
[0082] 悬菌液AAM-CAS按照如下方法制备：
[0083] 将AAM大量(CaCl2.2H2O 1.5g/L，KH2PO4 1.2g/L，MgSO4.7HO2 2.5g/L，KCl 29.5g/L))、AAM有机(甘氨酸7.5mg/L，盐酸硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆素0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，谷氨酰胺876mg/L，天门冬氨酸266mg/L，精氨酸174mg/L)、B5微量(具体见下表2)、水解酪蛋白0.5g/L，蔗糖10g/L，甘露醇10g/L，用1M浓度的氢氧化钠或盐酸调pH为5.2，悬菌前加乙酰丁香酮200μM。
[0084] 表2为B5微量成分
[0085]
[0086] 挑取EHA105/pK7G2D单菌落于10ml MGL培养基(卡那霉素100mg/L，利福平50mg/L)，28℃振荡培养至对数期，再以1∶100的比例转接到同样的新鲜培养基28℃振荡培养，使OD600＝0.5左右，得到活化好的农杆菌；将活化好的农杆菌4000g离心5min，倒掉培养基，用等体积的悬菌液AAM-CAS重悬菌体，得到EHA105/pK7G2D菌悬液。
[0087] 三、转化
[0088] 1、愈伤诱导培养
[0089] 将上述一得到的幼胚(外植体)置于由实施例1获得的愈伤诱导培养基中，25℃暗培养4周，得到胚性愈伤组织。
[0090] 2、继代培养
[0091] 从上述新诱导出的胚性愈伤组织中挑选干爽的胚性愈伤组织块(直径约2-3毫米)转接于新鲜由实施例1获得的继代培养基中25℃暗培养3周，继代3次，得到继代胚性愈伤组织块(直径约2-3毫米)。
[0092] 3、预培养
[0093] 在转化前重新将继代胚性愈伤组织块转接到新鲜的继代培养基25℃暗培养4天，得到预培养愈伤组织块。
[0094] 4、共培养
[0095] 将预培养4天的预培养愈伤组织块(侵染愈伤组织，一个胚性愈伤组织至少可长为3个预培养愈伤组织块)浸入由二得到的EHA105/pK7G2D菌悬液浸染(浸泡)(室温，25℃)10min，再用无菌水吸干菌悬液后转移到共培养培养基，25℃黑暗下共培养3天；得到共培养愈伤组织块。
[0096] 5、筛选培养
[0097] 将上述获得的共培养愈伤组织块直接转到由一得到的筛选培养基I 25℃暗培养2周；再转移至由一得到的筛选培养基II 25℃暗培养2周，荧光解剖镜下观察选取发绿色荧光的愈伤组织块(绿点)。将每一个绿点再在筛选培养基II 25℃继续暗培养2周，统计存活的愈伤组织块即为抗性愈伤组织。
[0098] 如果抗性愈伤生长较慢，可以在新鲜的筛选培养基II筛选培养一代。
[0099] 6、再生培养
[0100] 将上述抗性愈伤组织转接到再生培养基，在25℃光照分化培养(光照强度6000Lux、光照周期16小时光照，8小时黑暗)，培养3周分化出小苗，统计得到的小苗的数量。
[0101] 再将得到的小苗在荧光解剖镜下筛选，发绿色荧光的为阳性再生苗，即为转基因二穗短柄草小苗，将上述阳性再生苗移栽到光照培养室培养(22℃，18小时光照)，得到转基因二穗短柄草植株。
[0102] 四、验证转化效率
[0103] 1、愈伤诱导率
[0104] 统计愈伤诱导得到的胚性愈伤组织结果，如下表1，计算诱导率(胚性愈伤组织/外植体)达到75％。
[0105] 表1短柄草幼胚胚性愈伤诱导率
[0106]
[0107] 2、愈伤瞬时转化效率
[0108] 在上述筛选培养的步骤中，荧光解剖镜下观察发绿色荧光的愈伤组织块(绿点)与预培养愈伤组织块(也称为侵染愈伤组织)的百分比为愈伤瞬时转化效率。
[0109] 结果如表2所示，愈伤瞬时转化效率达到176.9％(大于100％是因为一块侵染愈伤组织上，长出好几个绿点)。
[0110] 表2短柄草愈伤块瞬时转化效率
[0111]培养皿编号 侵染愈伤组织 绿点 平均荧光块
1 32 54
2 28 48
3 25 31
4 24 86
5 28 58
6 25 45
7 26 65
[0112]8 30 38
9 26 29
10 25 33
11 24 38
12 25 49
13 24 31
总计 342 605 605/342＝1.77
[0113] 3、荧光愈伤组织块稳定成活率
[0114] 筛选两次后的每个农杆菌侵染愈伤块上产生的荧光组织块，这些荧光组织块继续培养后，有的不稳定丢失，只有稳定整合才能成为阳性愈伤组织。
[0115] 统计在上述筛选培养基II继续培养的步骤中，存活的愈伤组织块与发绿色荧光的愈伤组织块的百分比为荧光愈伤组织块稳定成活率，结果如表3所示：
[0116] 表3荧光愈伤块稳定成活率
[0117]
[0118] 4、再生率
[0119] 统计存活的愈伤组织块(即为抗性愈伤组织)分化培养产生的所有小苗数量，再将上述小苗中发绿色荧光的阳性再生苗进行计数，计算再生率，再生率为所有小苗数量/存活的愈伤组织块；
[0120] 结果如表4所示：
[0121] 表4再生率
[0122]
[0123] 5、计算转化效率
[0124] 根据上述实验统计结果，从外植体诱导愈伤组织开始计算转化效率，每100个幼胚能够诱导出75块胚性愈伤，一块愈伤经3次继代培养，能够繁殖成3块(按最少的计算)用于农杆菌侵染的预培养愈伤组织块(侵染愈伤组织)，每块愈伤平均产生1.77块发绿色荧光的愈伤组织块，发绿色荧光的愈伤组织块稳定生长率为45.8％，再生率为66.7％，在再生苗中，除去15％无荧光苗，故荧光阳性苗的转化效率计算为：
[0125] 75％x 3x 176.9％x 45.8％x 66.7％x(100％-15％)＝103.4％
[0126] 说明每100个幼胚，经愈伤诱导、转化，最终能够得到122个转基因苗，本发明的培养基和方法转化率高。
[0127] 本发明的247个外植体的最终可得到255个转基因二穗短柄草植株(实际统计结果与计算结果相符)。
[0128] 如果以侵染愈伤块计算转化效率，则：
[0129] 转化效率＝176.9％x 45.8％x 66.7％x(100％-15％)＝45.9％。
