应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒及其应用

摘要

本发明公开了一种应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒及其在制备高渗透压环境食品方面的应用。将酶液与相容性溶质混合均匀，加入到灭菌后的包埋材料溶液中，混合均匀挤出，滴入CaCl2水溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2溶液，得所述共固定化凝胶颗粒。本发明所述共固定化凝胶适用于高渗透压环境的食品酿制，通过在发酵过程中添加共固定化凝胶颗粒，包埋载体与相容性溶质的共同保护作用减弱了高渗透压环境对酶的渗透压胁迫，提高了酶的酶活力及稳定性，进而缩短发酵周期、改善酱油风味、提高蛋白质的转化率和氨基酸出品率。

权利要求

1.一种应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒，其特征在于，通过以下方法制备得到：将酶液与相容性溶质按比例混合均匀，加入到包埋材料溶液中，混合均匀后挤出，滴入CaCl2 水溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2 溶液，得共固定化凝胶颗粒；

所述酶液为蛋白酶或纤维素酶，所述酶液的酶浓度大于500 U/mL；所述相容性溶质为甜菜碱、甘油或海藻糖中的一种或几种的混合物；所述包埋材料溶液为海藻酸钠、壳聚糖或聚乙二醇的水溶液，质量百分比浓度为2.5～4.0%；所述CaCl2 水溶液的质量百分比浓度为2.0~4.0%；

所述酶液用量为相对于包埋材料质量分数的0.5~3%；所述相容性溶质用量为相对于酶液质量分数的0.2~0.9%。

2.根据权利要求1所述的应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒，其特征在于，所述交联时间为2h。

3.根据权利要求1所述的应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒，其特征在于，所述酶液用量为相对于包埋材料质量分数的3%；所述相容性溶质用量为相对于酶液质量分数的0.9%。

4.权利要求1 至3任一项所述的共固定化凝胶颗粒在制备高渗透压环境食品酿造方面的应用。

5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，是在发酵物料上罐发酵0~15天内添加相对于发酵物料的质量分数为0.5~1.0%的共固定化凝胶颗粒后继续发酵，制备得到所述高渗透压环境食品。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述高渗透压环境食品为高盐稀态发酵酱油、低盐固态酱油、泡菜、腐乳、豆豉、豆瓣酱、酱菜或鱼露。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述高渗透压环境食品为高盐稀态发酵酱油；所述高盐稀态酱油的制备方法包括以下步骤：S1.按常规方法制备成曲；

S2.将成曲与重量体积比为18%的盐水按1：2.3~2.5的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵，按照常规方法进行淋油操作；在上罐1~15天内添加共固定化凝胶颗粒；

添加共固定化凝胶颗粒后每天淋油一次，连续淋油操作7~15天左右，以后自然发酵直至达到发酵出油标准；

S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油；

步骤S2所述共固定化凝胶颗粒按照所述酱醅或酱醪质量的0.5~1%添加。

说明书

应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于食品生物技术领域，更具体地，涉及一种应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒及其应用。

背景技术

[0002] 高盐稀态发酵和低盐固态发酵是目前我国酱油发酵的主要工艺。其中高盐稀态工艺酿制酱油品质高，风味佳，成为高品质酱油的主要发酵工艺。但由于该工艺发酵使用高浓度盐水（18% 氯化钠，约18° Bé），且随着发酵时间延长，水分挥发后，盐浓度也将进一步提高。因此发酵过程中分解蛋白质、纤维素、淀粉等原料的相关酶及多种微生物受高渗透压胁迫而活性偏低，导致高盐稀态发酵工艺存在着诸如发酵周期长、设备利用率低、原料利用率和氨基态氮出品率不高等缺点。目前缩短发酵周期，提高蛋白质利用率和氨基态氮出品率是酿造行业迫切需要突破的关键技术瓶颈。

[0003] 多年来，人们致力于解决高盐稀态酱油发酵工艺不足，获得不少有益成果，部分成果已应用于发酵工艺当中。如添加高浓度外源酶；以及加入固定化酶，提高酶的耐盐性，增强酶的使用效果。

[0004] 但上述诸方法在使用中仍有不足之处，如添加高浓度外源酶溶液虽可以在一定范围内提高氨基酸，还原糖等酱油风味物质的含量，但在高渗透压环境下的外源酶酶活会快速降低，未能充分发挥酶的作用。向发酵酱醪中添加固定化酶，由于高渗透作用的影响，固定化酶的使用不能达到满意的效果。因此需要增强发酵用酶的耐高渗透压的能力，提高酶的作用效果，进而有效降低生产成本。

[0005] 相容性溶质(Compatible solutes)，也称渗透压保护剂，是一种极性易溶的、生理pH值条件下不带电荷的小分子有机物质，它能与细胞内体系相容，而不影响细胞的主要功能和蛋白质分子的正常折叠，具有稳定生物大分子结构功能的作用。目前研究较多的相容性溶质是甘氨酸甜菜碱、甘油以及海藻糖等。

[0006] 相容性溶质对发酵用酶的保护作用机理是：相容性溶质能够稳定大分子如蛋白质或酶的构象，溶剂排阻学说证实，水分子能够优先与蛋白分子结合，相容性溶质被排阻在外形成一层保护膜由于表面张力作用力的存在维持了酶构象的稳定，提高了酶的耐盐性能。

[0007] 多年前我们已研究了高盐环境中相容性溶质对酶及乳酸菌的保护作用，以及添加相容性溶质对高盐稀态酱油发酵的影响，证明游离的相容性溶质可以强化酶在酱油酿造中的作用效果。改善酶活性低的状态，提高酱油发酵的蛋白质转化率并缩短发酵周期。有关研究成果已公开发表，并申报了专利（发明名称：相容性溶质在高盐稀态酱油发酵中的应用；专利号：201110248389）。

[0008] 固定化技术（Immobilization technicas）是近年来飞速发展的生物工程技术。生物固定化技术是把微生物细胞（microbial cell）或酶（enzyme）吸附或包埋在一定的载体上，取代传统发酵或反应器中游离的细胞或酶，大大提高单位体积含菌量和酶水平，且固定化的微生物细胞或酶具有更稳定的催化活性和抗逆能力，因而能改善基质转化率、加快代谢速率，从而提高发酵产率和缩短发酵周期。

[0009] 共固定化技术（Co-immobilization）是在固定化酶和固定化细胞技术基础上发展起来的，它是将不同种属的微生物细胞取代单一的微生物进行固定，或者不同性质的酶替代单一的酶，以及酶与微生物细胞同时固定于同一载体内形成共固定化系统的一种技术，综合了混合发酵和固定化技术的优点。

[0010] 共固定化常用包埋材料包括天然高分子载体和有机高分子合成载体。其中天然高分子载体一般对生物无害，传质性能较佳；有机高分子合成载体抵抗外界环境能力强，机械强度大，循环使用性能好，但传质性能差，细胞或酶固定化后易失活。

[0011] 共固定化将是打破高盐稀态酱油酿造技术瓶颈的很有潜力的方法之一。2012年华南农业大学和广东珠江桥生物科技股份有限公司申请了一项发明名称为：应用于高盐稀态发酵食品的共固定化凝胶颗粒及其应用（专利号：201210412418）的专利；该专利是将耐盐产香微生物和相容性溶质共固定化制备得到共固定化凝胶颗粒，在高盐稀态发酵食品发酵过程中添加共固定化凝胶颗粒，可减弱或缓解高渗透压环境对发酵微生物的高渗胁迫作用，提高微生物活性，加快代谢过程，从而达到缩短发酵周期，改善酱油风味，提高蛋白质利用率和氨基态氮出品率的目的。但是，耐盐产香微生物和相容性溶质共固定化技术还存在以下限制，第一，产香微生物胞外酶如蛋白酶、纤维素酶分泌量少，对提高酱油蛋白质转化率和氨基酸利用率作用效果有限。第二，产香微生物的作用归根结底是酶的作用，为了提高酱油发酵中蛋白质的转化率和氨基酸生成率，使用蛋白酶和纤维素酶更有针对性。第三，缺少相容性溶质的复配优化的相关研究。

[0012] 另外目前还没有将相容性溶质与酶的共固定化技术应用在高盐环境调味品酿造过程中。

发明内容

[0013] 本发明的目的是针对现有传统高渗透压环境食品制备技术的不足，提供一种应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒，具有稳定、安全和良好溶解性，基于所述共固定化凝胶颗粒，可获得适合传统高渗透压环境食品发酵的共固定化体系，提供适合高渗透压环境食品尤其是酱油这种食用调味料色、香、味整体要求的共固定化技术方案。

[0014] 本发明的另一个目的是提供所述共固定化凝胶颗粒在制备高渗透压环境食品方面的应用，尤其是在制备高盐稀态发酵酱油方面的应用。

[0015] 本发明的目的通过以下技术方案予以实现：

[0016] 一种应用于高渗透压环境食品的共固定化凝胶颗粒，是通过以下方法制备得到：将酶液与相容性溶质按比例混合均匀，加入到包埋材料溶液中，混合均匀后挤出，滴入CaCl2 水溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2 溶液，得共固定化凝胶颗粒；

[0017] 所述酶液为食品酿造过程中常用的一种或几种酶的混合物；优选为蛋白酶、纤维素酶、淀粉酶、半纤维素酶中的一种或多种。使用多种时，多种酶液之间的混合比例不做严格限定。优选地，在使用时，所述酶液的酶浓度大于500 U/mL。

[0018] 本发明使用相容性溶质的原则是无毒无害，对酱油风味无影响的多糖或氨基酸类相容性溶质，不仅能够保护酶，而且能增加酱油中营养成分的含量，再者添加剂量较少，因此对酱油风味无大的影响，优选地，所述相容性溶质为甜菜碱、甘油或海藻糖中的一种或几种的混合物；使用几种时，几种相容性溶质之间的混合比例不做严格限定，根据本技术领域制备所述高渗透压环境食品要求选用。

[0019] 本发明使用的包埋材料，是国家标准中规定可以在食品加工中添加的安全、无毒的载体材料，优选地，所述包埋材料溶液为海藻酸钠、壳聚糖或聚乙二醇的水溶液，质量百分比浓度为2.5~4.0%。

[0020] 酶液、相容性溶质和包埋材料之间的用量比可根据应用对象进行选择，优选地，所述酶液用量为相对于包埋材料质量分数的0.5~3.0%；所述相容性溶质用量为相对于酶液质量分数的0.2~0.9%。更优选地，对于高盐稀态酱油酿造，所述酶液用量为相对于包埋材料质量分数的3.0%；所述相容性溶质用量为相对于酶液质量分数的0.9%。

[0021] 所述CaCl2作为固定化液，其浓度没有严格限定，适量即可。优选地，所述CaCl2水溶液的质量百分比浓度为2.0%~4.0%。

[0022] 所述挤出可以将混合均匀的酶液、相容性溶质和包埋材料混合溶液用蠕动泵通过橡胶管吸入后挤出。

[0023] 优选地，所述交联时间为2h。

[0024] 如上所述酶液和相容性溶质共固定化凝胶颗粒在制备高渗透压环境食品酿造方面的应用。优选地，所述应用是在发酵物料上罐发酵0~15天内添加相对于发酵物料的质量分数为0.5~1%的共固定化凝胶颗粒后继续发酵，制备得到所述高渗透压环境食品。优选地，所述高渗透压环境食品为高盐稀态发酵酱油、低盐固态酱油、泡菜、腐乳、豆豉、豆瓣酱、酱菜或鱼露等。本发明尤其适用于高盐、高糖等高渗环境的酿制食品方面的技术领域。

[0025] 更优选地，所述应用为酶液和相容性溶质共固定化凝胶颗粒在制备高盐稀态发酵酱油中的应用；所述高盐稀态酱油的制备方法包括以下步骤：

[0026] S1.按常规方法制备成曲；

[0027] S2.将成曲与重量体积比（w/v）为18%的盐水按1：2.3~2.5的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵，按照常规方法进行淋油操作；在上罐0~15天内添加共固定化凝胶颗粒；添加共固定化凝胶颗粒后每天淋油一次，连续淋油操作7~15天左右，以后自然发酵直至达到发酵出油标准；

[0028] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油；

[0029] 步骤S2所述共固定化凝胶颗粒按照所述酱醅或酱醪质量的0.5~1%添加。

[0030] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0031] （1）本发明提供了一种新的共固定化技术和体系，适宜应用于高渗透压环境食品酿造方面。本发明创造性地分析了多种酶液的共固定技术方案，总结出多种酶液与固定化技术与高渗透压环境食品酿造结合机理，总结了出适宜的技术方案，更加显著地缓解高渗透压环境对发酵用酶的抑制作用。

[0032] （2）本发明进一步提供优选的技术方案，找到相容性溶质与多种发酵用酶液共固定化的合适技术方案，有效缓解高渗胁迫对多种酶液的抑制作用，且不影响发酵用酶的相关代谢反应，改善降解效率，很好地保证相容性溶质调节机制改善发酵用酶适应高渗环境的能力，显著提高其利用率。

[0033] （3）本发明应用于制备高渗透压环境食品的酿造时，通过在高盐稀态酱油发酵过程中添加共固定化凝胶颗粒，显著减弱或缓解高渗透压环境对发酵用酶的高渗胁迫作用，提高发酵用酶的催化活性，加快代谢过程，从而达到缩短发酵周期，并提高蛋白质利用率和氨基态氮出品率，对改善酱油风味做出贡献。

[0034] （4）基于本发明共固定技术方案，本发明优选海藻酸钠作为包埋材料，确定包埋材料浓度和用量，确定合理的包埋工艺，将相容性溶质与耐盐产香微生物或相容性溶质与酶成功包埋，提供一种稳定、安全、良好溶解性的共固定化凝胶颗粒，而且价格低廉，便于发酵操作时添加，利于工业化扩大生产中使用。

[0035] （5）本发明使用的相容性溶质，据食品安全国家标准食品添加剂使用标准（GB2760-2011），甘油（食品用合成香料，FEMA 编号：2525）及甘氨酸甜菜碱（食品用天然香料，FEMA 编号：4223）可作为食品用香料加入食品中，符合食品添加剂使用的基本要求及食品用香料的标准，安全性较高；海藻糖亦是一种安全、可靠的天然糖类，广泛存在于自然界中许多可食用动植物及微生物体内部，如人们日常食用的蘑菇类、海藻类、豆类、虾、面包、啤酒及酵母发酵食品中都有含量较高的海藻糖。因此本发明所使用的相容性溶质既可以为产品带来浓郁优良的品质，又具有安全性。

[0036] （6）更重要的是本发明所述的发酵用酶液与相容性溶质共固定化技术相对与发酵用乳酸菌和相容性溶质共固定化技术相比具有以下优点：添加蛋白酶能直接提高蛋白质的转化率，纤维素酶分解大豆细胞壁成分，使得蛋白质溶出从而间接提高了蛋白质的转化率水平。相比发酵用乳酸菌直接使用蛋白酶和纤维素酶更有针对性。对多种相容性溶质的复配优化，提高了相容性溶质对酶的作用效果。

附图说明

[0037] 图1.高盐稀态酱油发酵过程中氨基态氮含量变化对比。

[0038] 图2.高盐稀态酱油发酵过程中总酸含量变化对比。

[0039] 图3.高盐稀态酱油发酵试验出油中氨基态氮含量对比。

[0040] 图4.高盐稀态酱油发酵试验出油中总酸含量对比。

[0041] 图5.高盐稀态酱油发酵试验出油中全氮的含量对比。

[0042] 图6.高盐稀态酱油发酵试验出油中蛋白质转化率对比。

具体实施方式

[0043] 下面结合附图和具体实施例进一步详细说明本发明。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

[0044] 实施例1：（共固定化蛋白酶+溶质）

[0045] 将占包埋材料（海藻酸钠）3%(w/w)的蛋白酶（5000~10000U/g）酶液与分别占酶液（蛋白酶酶液）质量分数1.0‰的甘油，3.0‰甜菜碱和5.0‰的海藻糖混合均匀，加入到灭菌后的质量百分比浓度为4%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管泵出，滴入质量百分比浓度为3%的CaCl2溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2溶液，得共固定化凝胶颗粒。

[0046] S1.按常规方法制备成曲；

[0047] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.3 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量的 1.0% 向酱醅或酱醪中添加共固定化凝胶颗粒，加入共固定化凝胶颗粒后要每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0048] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0049] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0050] 实施例2（共固定化纤维素酶+溶质）

[0051] 将占包埋材料（聚乙二醇）3%(w/w)的纤维素酶（700EGU/g，密度1.2g/mL）酶液与占酶液质量的3.0‰（w/w）的甜菜碱混合均匀，加入到灭菌后的质量百分比浓度为2.5%的聚乙二醇溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管泵出，滴入质量百分比浓度为3%的CaCl2溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2溶液，得共固定化凝胶颗粒。

[0052] S1.按常规方法制备成曲；

[0053] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.5 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量的 1.0% 向酱醅或酱醪中添加共固定化凝胶颗粒，加入共固定化凝胶颗粒后要每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0054] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0055] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0056] 对比例1.（游离蛋白酶+游离溶质）

[0057] S1.按常规方法制备成曲；

[0058] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.3 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量分数的1.50‰加入先用适量的蒸馏水溶解的蛋白酶粉（酶活5000U/g），再添加占酶液质量分数为1.0‰的甘油，3.0‰的甜菜碱和5.0‰的海藻糖，然后每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0059] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0060] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0061] 对比例2（游离纤维素酶+游离溶质）

[0062] S1.按常规方法制备成曲；

[0063] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.5 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，向酱醅或酱醪中加入1.5‰（v/w）的纤维素酶液（700EGU/g，密度1.2g/mL），酶液中混有3.0‰（w/w）的甜菜碱，然后每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0064] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0065] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0066] 对比例3（单独固定化蛋白酶）

[0067] 将占包埋材料（海藻酸钠）3%(w/w)的蛋白酶（5000~10000U/g）酶液加入到灭菌后的质量百分比浓度为4%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管泵出，滴入质量百分比浓度为3%的CaCl2溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2溶液，得共固定化凝胶颗粒。

[0068] S1.按常规方法制备成曲；

[0069] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.3 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量的 1.0% 向酱醅或酱醪中添加共固定化凝胶颗粒，加入固定化凝胶颗粒后要每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0070] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0071] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0072] 对比例4（单独固定化纤维素酶）

[0073] 将占包埋材料（聚乙二醇）3%(w/w)的纤维素酶（700EGU/g，密度1.2g/mL）酶液加入到灭菌后的质量百分比浓度为2.5%的聚乙二醇溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管泵出，滴入质量百分比浓度为3%的CaCl2溶液中，交联得珠体，珠体置于4℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2溶液，得共固定化凝胶颗粒。

[0074] S1.按常规方法制备成曲；

[0075] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.5 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量的 1.0% 向酱醅或酱醪中添加共固定化凝胶颗粒，加入固定化凝胶颗粒后要每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0076] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0077] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0078] 对比例5（空白）

[0079] S1.按常规方法制备成曲；

[0080] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.5 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0081] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0082] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0083] 对比例6（共固定微生物+溶质）

[0084] 将占包埋材料（海藻酸钠）3%(w/w)的耐盐乳酸菌菌液与占菌液质量分数2.0‰甜菜碱混合均匀，加入到灭菌后的质量百分比浓度为3%的海藻酸钠溶液中，混合均匀后用蠕动泵通过橡胶管泵出，滴入质量百分比浓度为4%的CaCl2溶液中，交联2 ~5小时得珠体，珠体置于-20℃钙化过夜，除去珠体表面的CaCl2溶液，得共固定化凝胶颗粒。

[0085] S1.按常规方法制备成曲；

[0086] S2.将成曲与盐水（18%，w/v）按1 : 2.3 的质量比例混合均匀后制成酱醅或酱醪，上罐发酵；在上罐发酵时或上罐发酵两周后，按照所述酱醅或酱醪质量的 1.0% 向酱醅或酱醪中添加共固定化凝胶颗粒，加入共固定化凝胶颗粒后要每天淋油一次，淋油一周，而后自然发酵直至发酵酱油到达酱油生产技术标准；

[0087] S3.自上罐发酵开始，当自然发酵到60~100天时滤出头油。

[0088] 发酵结束后测定各项指标，如氨基酸态氮，总酸，以及还原糖和全氮等。总酸与氨基态氮的测定依据：GB/T5009.39-2003。全氮的测定依据：GB/T5009.5-2003。

[0089] 结果分析：图1中所示是各组氨基酸态氮变化情况，各个试验组的氨基酸态氮含量现增加后稳定的趋势。其中共固定纤维素酶组发酵过程中比游离纤维素酶+相容性溶质组氨态氮含量提高明显，提高幅度达1.6%~4.2%，与单固定纤维素组相比前期提高不明显，而后期出现较大差异，其中在发酵第90天时氨基酸态氮含量为0.767 g/100mL，空白组为0.759 g/100mL，相比空白组提高1.05%。共固定蛋白酶组与游离蛋白酶+相容性溶质组相比，在整个发酵过程中提高幅度在0.12%~1.91%。与单固定蛋白酶组相比提高幅度在0.71%~2.5%。与空白组相比提高最高达到6.07%。共固定纤维素酶组和共固定化蛋白酶组在整个发酵过程中相比共固定乳酸菌组的氨基酸态氮分别提高约0.92%~1.66%和0.81%~2.86%。以上分析说明共固定化酶组对提高氨基酸态氮的含量具有明显效果。

[0090] 如图2所示为各试验组总酸的含量变化，共固定纤维素酶组在整个发酵过程中总酸含量均高于游离纤维素酶+相容性溶质组，在第45天时高出游离组6.92%，最低也达到1.78%。共固定纤维素酶组相比单固定纤维素酶组总酸提高幅度最高为5.22%，最低也在
2.83%。共固定蛋白酶组相比游离游离蛋白酶+相容性溶质组和单固定蛋白酶组，有不同程度的提高，其中与游离蛋白酶+相容性溶质组相比平均高出1.18%~6.90%。与单固定蛋白酶组相比发酵第60天以后增加量明显，最高高出4.46%。共固定乳酸菌组相比共固定纤维素酶与共固定化蛋白酶组在整个发酵过程中的总酸分别提高约1.26%~3.61%和0.4%~2.9%。
说明共固定化蛋白酶与共固定纤维素酶对总酸的提高有较好的作用，但效果不如共固定乳酸菌组。原因是乳酸菌作为产酸微生物能够大量产酸，并在固定化结构和相容性溶质的共同保护作用下，产酸能力突出，但产酸量与酱油品质高低无直接关系。

[0091] 由图3可知，发酵头油中的氨基酸态氮含量，最高为共固定蛋白酶组达0.782 g/100mL，相比共固定乳酸菌组、游离蛋白酶+相容性溶质组、单固定蛋白酶组、空白组，分别提高0.92%、1.96%、2.61%、6.11%。共固定纤维素酶组氨基酸态氮含量为达0.767 g/100mL相比共固定乳酸菌组、游离纤维素酶+相容性溶质组，比单固定纤维素酶组、空白组，分别提高2.86%、1%、1.59%、4.07%。因此说明共固定化酶技术能够有效提高头油中的氨基酸态氮含量。

[0092] 由图4可知，共固定蛋白酶组头油总酸含量为1.301 g/100mL相比游离蛋白酶+相容性溶质组和单固定蛋白酶组以及空白组分别提高3.17%、4.42%、10.16%。共固定纤维素酶组头油总酸含量为1.26 g/100mL相比游离纤维素酶+相容性溶质组和单固定纤维素酶组以及空白组分别提高2.69%、1.69%、6.73%。共固定化乳酸菌组头油中总酸含量相比共固定纤维素酶和共固定蛋白酶组分别提高3.52%和4.21%，虽共固定乳酸菌组对总酸的提高效果优于共固定酶，但相比空白组，共固定化酶技术对总酸含量的提高也是较为显著的有促进作用。

[0093] 由图5可知，共固定蛋白酶组头油中全氮含量1.389 g/100mL相比其他各组提高明显，相比共固定乳酸菌组、单固定蛋白酶组、游离蛋白酶+相容性溶质组和空白组分别提高0.67%、2.78%、3.68%、7.53%。共固定纤维素酶组头油全氮含量为1.40 g/100mL相比其他各组全氮含量提高明显，相比共固定乳酸菌组、单固定纤维素酶组、游离纤维素酶+相容性溶质组和空白组分别提高0.85%、2.90%、5.33%、8.35%。说明该共固定化酶技术对提高全氮含量具有较好作用。

[0094] 由图6可知各试验组中头油中蛋白质转化率共固定纤维素酶组最高，比共固定乳酸菌组提高3.69%、比游离纤维素酶+相容性溶质组提高1.18%、相比空白组提高5.97%。共固定蛋白酶组蛋白质转化率为59.92%比共固定乳酸菌组提高2.50%，比游离蛋白酶相容性溶质组提高4.16%，相比空白组提高5.52%。因此该固定化酶技术对提高蛋白质转化率有较大作用。

[0095] 从图1、2可以比较出，实施例中总酸和氨基酸态氮均比空白组生成速度快；若以达到国家标准中的指标含量的时期记为发酵结束时间，氨基态氮指标较空白组可提前5~10天达标；总酸含量按照1.2g/100mL为标准，各试验组相对空白组可提前10~18天左右达到标准。

[0096] 综合以上数据分析，各实施例中酿造出的酱油的各理化指标均比空白组有较大幅度的提高。根据对比试验结果所示，在酱油酿造过程中引入相容性溶质与酶的共固定化技术，能有效的提高高盐稀态酿造酱油中各指标水平，且原料蛋白质利用率提高幅度达1.31~5.96%，同时显著缩短了发酵周期。

[0097] 综合以上因素可知，酶与相容性溶质的共固定化技术能够有效提高总酸、氨基酸态氮、全氮含量，提高蛋白质转化率。因此，该共固定化酶技术具有较好的实际生产价值。