用于提高作物产量的双基因及其编码蛋白和应用

摘要

本发明公开了用于提高植物产量的双基因，属于植物基因工程领域。本发明所述的双基因包括基因A和基因B两个基因，其中基因A由SEQID No:1所示的核苷酸序列组成；基因B由SEQID No:2所示的核苷酸序列组成。其中所述的基因A是指油菜胞质果糖-1,6-二磷酸酶基因。所述的基因B是指油菜景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因。本发明还公开了其表达载体等。本发明两个基因的过表达对植物的生长发育有较明显的促进作用；转双基因植株在基因表达和酶活性方面高，本发明为提高植物产量提供了有效方法。

权利要求

1.用于提高植物产量的双基因，其特征在于包括基因A和基因B两个基因，其中基因A由SEQID No：1所示的核苷酸序列组成；基因B由SEQID No：2所示的核苷酸序列组成。

2.用于提高植物产量的双基因，其特征在于包括基因A和基因B两个基因；所述的基因A由SEQID No：3所示的核苷酸序列组成，所述的基因B由SEQID No：4所示的核苷酸序列组成。

3.权利要求1所述的用于提高植物产量的双基因的编码蛋白，其特征在于包括两种蛋白，其中基因A编码的蛋白由SEQID No：5所示的氨基酸序列组成；基因B编码的蛋白由SEQID No：6所示的氨基酸序列组成。

4.含有权利要求1或2所述的双基因的表达载体。

5.用于检测权利要求1或2所述的双基因的两对引物，其特征在于其中一对引物由SEQ ID No：9和SEQ ID No：10所示的核苷酸序列组成；另一对由SEQ ID No：11和SEQ ID No：

12所示的核苷酸序列组成。

说明书

用于提高作物产量的双基因及其编码蛋白和应用

技术领域

[0001] 本发明属于植物基因工程领域。具体涉及用于提高作物产量的双基因，以及双基因的编码蛋白，还有它们在提高作物产量上的应用。

背景技术

[0002] 培育高产和抗逆性强的作物品种,是人类农业生产一直以来所追求的目标，随着环境不断恶化，极端天气增多，气候对农业的影响加大，农业面临着自然灾害多发的严峻考验，加之世界人口不断增长，粮食危机逐渐显现，培育高产、抗逆性强的作物新品种显得尤为紧迫。

[0003] Mason和Maskill(1928)提出光合生产中的源(source)库(sink)概念，之后为Evans等人所发展，植物的“源”是指植物能进行光合作用，合成植物生长所需的有机物质，为植物其他各组织器官和各项生理活动提供物质和能量的器官。比如成熟的叶片，幼茎等。“库”是植物消耗有机物质用于其自身的生长和代谢或者用于贮存有机物质形成作物产量的器官或组织。比如幼叶、果实、种子、块茎等。作物的“流”是指作物源器官形成的同化产物向库器官的转移过程，其主要的载体物质是蔗糖。从源、库与流的关系看，“源”的供应能力和“库”的需求水平对“流”分别起到推力和拉力的作用。源、库、流三者的平衡对于植物生长发育和作物产量形成有非常重要的意义。如果只是单一的考虑一方面的因素而忽略了其他因素的限制，就不能从最大程度上开发作物的生长潜力。所以在植物高产育种中必须全面协调三者的关系，使植物可以更加高效的利用有机物质，进而促进植物生长。

[0004] 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（简写为：SBPase）是以景天庚酮糖-1，7-二磷酸为专一性底物酶(Breazeale等．1978)。是高等植物所特有的酶。SBPase在植物体内含量很低，主要负责CO2受体核酮糖-1,5-二磷酸RuBP的再生，对卡尔文循环碳的流通有重要作用。SBPase由核基因编码，在细胞质中合成，在N端叶绿体靶向肽的引导下进入叶绿体。SBPase处在卡尔文循环核酮糖-1,5-二磷酸的再生途径中，催化SBP的脱磷酰基作用，控制碳源流向。

[0005] 现在已经在很多的植物中克隆到了SBPase基因序列，如小麦、拟南芥、菠菜、玉米、水稻等，对序列进行比对分析发现SBPase在植物中有很强的保守性。其CDS序列保守性可达80%-90%，这也进一步说明了这个酶在植物生理过程中的重要性。

[0006] 最近Feng等获得了过表达SBPase的转基因水稻，但是研究结果表明，该基因在水稻中的过表达对生物量和生长速率并没有很明显影响，却意外地发现其对高温和盐胁迫的抗性明显增强。另外，过表达SBPase基因的番茄植株在低温下的净光合速率和RuBP最大再生速率明显高于野生型，低温处理后电解质渗漏率降低，说明SBPase过量表达提高了番茄叶片的光合功能，增强了其对低温的耐受性。进一步研究表明，不同叶位和叶龄叶片中SBPase对碳同化的影响能力也不同。在同一株过表达SBPase的转基因植株中，通过对光合作用效率的测定，发现刚长出的新叶比野生型相同位置的新叶光合效率可提高12%，而老叶则只能比野生型提高约6%。

[0007] 果糖-1,6-二磷酸酶，在植物细胞中存在两种类型，叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶（cp-FBPase）和细胞质果糖-1,6-二磷酸酶（cy-FBPase），两种类型的酶不光作用位置不同，酶活性调节方式以及作用途径也不同。叶绿体果糖-1,6-二磷酸酶参与Calvin循环，是受光调控的酶，其活性不能被AMP抑制，最佳活性pH是8.8；而胞质FBPase活性则不受光调控，其活性被AMP所抑制，最佳活性的pH为8.0。但两个酶的结构相似，作用底物相同，都是催化果糖-1,6-二磷酸酶水解成为果糖-6-磷酸和无机磷酸。两个酶所催化的反应相同，都是催化果糖-1,6-二磷酸的水解反应，但是所处的调节位置不同，cp-FBPase处在卡尔文循环途径中有机物质分配的分支点上，对于调节碳元素的流向和分配有重要作用，cy-FBPase处于胞质蔗糖合成途径的较上游部位，蔗糖合成的限速酶。因此两个酶对于植物的生长和有机物质的分配都有重要作用。

[0008] 胞质果糖-1,6-二磷酸酶（cy-FBPase）：司丽珍等将水稻的cy-FBPase基因上游的调控序列与报告基因连接转化水稻,该报告基因只在源组织中表达，这暗示着果糖-1,6-二磷酸酶在植物中与光合作用及蔗糖的代谢有关。2011年，Masahiro Tamoi等将蓝藻的SBPase/FBPase双功能酶转入马铃薯，使其在胞质内表达，观察到酶活性的增强可以促进马铃薯侧枝的发育，在酶活性较高的植株中，侧枝分化较多，干重量增加，在转基因拟南芥中也有相似的表型。说明FBPase在胞质中过表达可以影响碳水化合物在植物体的分配，进而影响植物的生长发育。

[0009] 目前已经获得菠菜,甘蔗,水稻等几种植物的果糖-1,6-二磷酸酶的cDNA序列。将马铃薯cy-FBPase的反向cDNA在35S启动子的调控下转入到马铃薯,当酶活性低于野生型的20%时,在源叶片中积累3-磷酸甘油酸、磷酸丙糖和果糖-1,6-二磷酸；在光源和CO2充足的情况下，光合速率显著下降。在拟南芥中降低cyFBPase的表达可导致蔗糖的合成降低,磷酸化中间产物的积累,淀粉合成增加。以上结果表明细胞质型果糖-1,6-二磷酸酶在调控蔗糖合成以及光合作用产物的分配中起重要作用。

[0010] 蔗糖是高等植物中有机物从源到库运输的主要形式，在库组织中用于细胞的代谢、细胞壁的合成、呼吸作用、或者合成淀粉贮存起来，维持植物正常的生理代谢和生长发育过程。因此蔗糖的合成速率直接影响到植物的生长。

[0011] SBPase对于促进光合作用，即促进作为植物的“源”的有机物质的合成有重要作用，而cy-FBPase能促进蔗糖的合成，即对形成作为植物的有机物质的分配的“流”有重要作用，如果将两种基因同时进行转入植物中，使两种基因同时过表达，不仅能提高“源”的有机物质的合成，而且提高有机物质运输载体的“流”的形成，从而可能对“库”产生较大的促进作用，提高植物的产量。经检索，未发现将两个基因同时转入植物进而提高植物产量的报道。

发明内容

[0012] 本发明目的在于提供用于提高植物产量的双基因。

[0013] 本发明另一目的在于提供上述用于提高植物产量的双基因的编码蛋白。

[0014] 本发明第三目的在于提供含有上述双基因的表达载体。

[0015] 本发明第四目的在于提供含有上述表达载体的植物组织或植物。

[0016] 本发明第五目的在于提供上述双基因在提高植物产量上的应用。

[0017] 本发明第六目的在于提供利用上述双基因提高植物产量的方法。

[0018] 本发明第七目的在于提供用于上述双基因植物的检测试剂盒。

[0019] 实现本发明的技术方案如下：

[0020] 用于提高植物产量的双基因，包括基因A和基因B两个基因，其中基因A由SEQID No:1所示的核苷酸序列组成；基因B由SEQID No:2所示的核苷酸序列组成。

[0021] 上述双基因中所述的基因A是指油菜胞质果糖-1,6-二磷酸酶（cy-FBPase）基因。

[0022] 上述双基因中所述的基因B是指油菜景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因（SBPase）。

[0023] 上述双基因中所述的基因A由SEQID No:1所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的添加、替换或缺失所产生的、且编码与油菜胞质果糖-1,6-二磷酸酶相同功能的衍生序列组成。

[0024] 上述双基因中所述的基因B由SEQID No:2所示的核苷酸序列经过一个或几个碱基的添加、替换或缺失所产生的、且编码与景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶功能相同的衍生序列组成。

[0025] 上述双基因中所述的基因A由SEQID No:3所示的核苷酸序列组成。

[0026] 上述双基因中所述的基因B由SEQID No:4所示的核苷酸序列组成。

[0027] 用于提高植物产量的上述双基因的编码蛋白，包括两种蛋白，其中基因A编码的蛋白由SEQID No:5所示的氨基酸序列组成；基因B编码的蛋白由SEQID No:6所示的氨基酸序列组成。

[0028] 含有上述双基因的表达载体。

[0029] 含有上述双基因的转基因植物组织。

[0030] 含有上述双基因的转基因植物。

[0031] 上述双基因在提高植物产量方面的应用。

[0032] 所述的植物是指水稻、玉米、大豆、棉花、小麦、烟草等。

[0033] 利用上述双基因提高植物产量的方法，包括将上述含有上述双基因的表达载体转入植物中，形成转基因植物。

[0034] 用于检测上述双基因的两对引物，其中一对引物由SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列组成；另一对由SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的核苷酸序列组成。

[0035] 用于上述双基因植物的检测试剂盒，含有两对引物，其中一对引物由SEQ ID No:9和SEQ ID No:10所示的核苷酸序列组成；另一对引物由SEQ ID No:11和SEQ ID No:12所示的核苷酸序列组成。

[0036] 本发明具有的优点和有益效果：（1）、本发明两个基因的过表达对植物的生长发育有较明显的促进作用，转双基因植株的株高、叶面积、茎粗、干重/鲜重等各项指标明显优于相应的转单基因植株，显著优于野生型植株。（2）、转双基因植株在基因表达和酶活性方面高，其SBPase的表达量和酶活性为野生型的1.96倍和1.45倍；cy-FBPase基因的表达量和酶活性分别为野生型的2.18倍和1.77倍。而且两个基因之间存在一定的协同促进作用，转SBPase单基因植株的cy-FBPase基因的表达比野生型提高28%，酶活性提高22%；而转cy-FBPase单基因植株的SBPase基因表达比野生型提高约11%，酶活性提高10%。（3）转双基因的植株叶片淀粉和蔗糖含量高，野生型的1.53倍和2.0倍。本发明为提高植物产量提供了有效方法。

附图说明

[0037] 图1为油菜cy-fbpase基因保守序列的PCR扩增电泳图谱；其中1为Marker，2为cy-fbpase基因保守序列。

[0038] 图2为油菜cy-fbpase基因全长的PCR扩增电泳图谱；其中1为Marker，2为油菜cy-fbpase基因。

[0039] 图3为cy-fbpase基因cDNA序列PCR扩增电泳图谱；其中为1Marker，2为cyFBPase的cDNA序列。

[0040] 图4为cy-fbpase基因的表达载体pGBI-fbpase的结构示意图。

[0041] 图5为表达载体转化农杆菌后的PCR扩增电泳图谱；其中1为Marker，2-5为cy-fbpase基因。

[0042] 图6为转基因烟草cy-fbpase基因的PCR扩增电泳图谱；其中1和18为Marker，2-15为烟草转化苗，16为表示阳性质粒对照，17为野生型烟草，8和11为转化没成功的烟草苗。

[0043] 图7为SBPase基因保守序列的扩增电泳图谱；其中1为Marker，2为SBPase基因的保守序列。

[0044] 图8为SBPase基因PCR扩增电泳图谱；其中1为Marker，2为SBPase基因全长序列。

[0045] 图9为SBPase基因PCR扩增电泳图谱；其中1为Marker，2为SBPase基因

[0046] 图10为双基因表达载体结构示意图图，cyFBPase基因和SBPase基因为独立表达盒，并串联在表达载体上。

[0047] 图11为双基因烟草转化株的PCR鉴定电泳图谱，其中1.2k的条带为SBPase基因、1.1k的条带为cyFBPase基因。1和18为Marker，2-17为不同植株的烟草基因组PCR鉴定，9和14没有扩增条带说明这两株为阴性转化株，其他为转基因阳性植株。

[0048] 图12为淀粉含量标准曲线。

具体实施方式

[0049] 下面以具体实施例说明本发明，但是不用于限制本发明的范围。

[0050] 如无特别说明，以下实施例中所涉及的方法为本领域常用方法，可参见《分子克隆》等，或按照制造厂商提供的试剂或试剂盒说明书进行。

[0051] 实施例1、油菜cy-fbpase基因片段的获得

[0052] 按照如下方法进行：

[0053] （1）、cy-fbpase基因的克隆：首先通过已知的cy-fbpase基因同源序列比对，找出该基因的保守序列，设计引物。保守序列扩增引物如下：

[0054] F-1 GTTGTTTTTGATCCACTTGATGG（Seq ID No:7）

[0055] R-1 GGCTTGCTCCATCAAGAACG（Seq ID No:8）

[0056] 以油菜基因组DNA为模板，以F-1和R-1为引物（引物由上海生工生物工程有限公司合成）进行PCR扩增，反应体系如下：10×Taq DNA Polymerase Buffer5μL，dNTP Mix（10mM）2μL，F-1(10μM)1μL，R-1(10μM)1μL，基因组DNA（50ng/μL）1μL，Taq DNA聚合酶（Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司，下同）0.5μL，ddH2O39.5μL，共50μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，30cycles；72℃8min。PCR产物电泳检测：配制1%的琼脂糖凝胶，100V电压电泳30-40min，凝胶成像观察电泳结果（图1），将目的条带切下，回收（琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒购自Axygen公司，按照产品说明书进行操作，下同），送交北京华大基因研究中心进行测序，其序列长度为971bp。

[0057] （2）将得到的保守序列在NCBI中的油菜EST序列库中进行比对搜索，推测到基因的全长引物。全长引物如下：

[0058] FBP-F 5’-ATGGATCACGAAGCAGATGC-3’ （Seq ID No:9）

[0059] FBP-R 5’-CTATTCGTCCGCAGCATACAG-3’ （Seq ID No:10）

[0060] 以油菜基因组DNA为模板，以FBP-F和FBP-R为引物进行PCR扩增；其反应 体 系（50μL） 为：10×Taq DNA Polymerase Buffer5μL，dNTP Mix（10mM）2μL，FBP-F(10μM)1μL，FBP-R(10μM)1μL，油菜基因组DNA（50ng/μL）1μL，Taq DNA聚合酶
0.5μL，ddH2O39.5μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，60℃30s，72℃1min20s，30个循环；72℃8min。电泳检测：配制1%的琼脂糖凝胶，100V电压电泳30-40min，凝胶成像观察电泳结果（见图2），获得大小为1910bp的片段，将目的条带切下，回收。送交北京华大基因研究中心进行测序，获得全长为1910bp的基因片段。

[0061] （3）反转录提取油菜的总RNA（EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自原平皓生物技术有限公司，按照产品说明书进行操作）,并进行反转录（Rever Tra Ace-α-反转录试剂盒购自TOYOBO公司，按照产品说明书进行操作），得单链cDNA,以反转录所得的单链DNA为模板，以FBP-F和FBP-R为引物进行PCR扩增，电泳检测（见图3）,获得全长为1017bp的基因片段，即得到cy-FBPase的cDNA，送交北京华大基因研究中心进行测序(见SEQ ID No:1)；其编码的氨基酸序列为338个氨基酸(见SEQ ID No:5)。

[0062] 实施例2、cy-fbpase基因表达载体的构建

[0063] 按照如下方法进行：

[0064] （1）为了避免目的基因上含有的酶切位点在载体构建过程中被切开，对油菜cy-fbpase基因的cDNA序列通过软件Vector NT1分析，将油菜cy-fbpase基因第173bp位点上由G变为A,第258位点上由变成G，第374位点上由A变成G，尽管密码子变化，其所编码的氨基酸没有变化，这三点突变通过以油菜cDNA为底物，以叠加延伸PCR方法进行定点突变，定点突变后所得序列见SEQ ID No:4（以下仍称该基因为cy-fbpase）。

[0065] （2）中间载体的构建：用PstⅠ和XhoⅠ（限制性内切酶均购自Fermentas公司，下同）同时酶切载体质粒pG4AB和两端已加上酶切位点并连接到T载体上的cy-fbpase基因片段，分别回收约4kb的载体片段和约1.2kb的cy-fbpase基因片段。并将基因片段与载体连接,构建中间载体pG4A-cyfbpase。所述的连接是通过T4DNA连接酶（购自Promega公司）进行的。

[0066] （3）将构建的中间载体pG4A-cyfbpase和载体质粒pBI121经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切，回收约11k的pBI121载体片段和1.7kb左右的中间载体表达盒片段，将回收的载体片段和目的基因表达盒片段连接，构建植物表达载体pGBI-cy-fbpase。所得的表达载体结构（见图4），在基因的5’端有CaMV35S启动子和Ω序列，3’端有PolyA序列和Nos终止子。

[0067] 实施例3、SBPase基因片段的克隆

[0068] （1）SBPase基因的保守序列：根据SBPase基因的保守序列设计的SBPase基因的PCR扩增引物对，所设计的引物为SBP-F和SBP-R，然后以油菜基因组DNA为模板，以SBP-F和SBP-R为引物进行PCR扩增，保守序列简并引物序列如下：

[0069] SBP-F GGGAATTCGATGTGYATGGGAGAAGCWTTG （SEQ ID No:11）

[0070] SBP-R GGAAGCTTGGMACCATTCCTCCRGTGTATC （SEQ ID No:12）

[0071] 保守序列的PCR扩增的反应体系（50μL）：10X Taq DNA聚合酶缓冲液5μL，dNTP Mix（10mM）2μL，SBP-F(10μM)1μL，SBP-R(10μM)1μL，油菜基因组DNA1μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，ddH2O39.5μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，63℃30s，72℃1min，30个循环；72℃8min。电泳检测：配制1%的琼脂糖凝胶，100V电压电泳30-40min，凝胶成像观察，结果（见图7）显示有一条0.85kb左右的条带，将该条带切胶回收，连接到T载体上，取T载体的阳性克隆，送交北京华大基因研究中心测序，测序结果显示该片段长度为868bp。

[0072] （2）SBPase基因侧翼序列的Tail-PCR扩增及全长基因克隆

[0073] 根据得到的SBPase基因的保守序列设计Tail-PCR引物。3’侧翼的克隆只经过了一次Tail-PCR反应，延伸了约0.8kb，出现了PolyA结构，说明3’侧翼克隆完整。而5’侧翼序列的克隆则经过了两次Tail-PCR反应才得到基因的全长序列，第一次反应延伸了约450bp，没有出现起始密码子，第二次反应延伸了1.5kb，序列拼接后，软件预测基因全长并设计基因全长引物，最终获得1820bp的SBPase基因全长序列（见图8）。

[0074] （3）反转录提取油菜的总RNA（EASYspin植物RNA快速提取试剂盒购自原平皓生物技术有限公司，按照产品说明书进行操作）,并进行反转录（Rever Tra Ace-α-反转录试剂盒购自TOYOBO公司，按照产品说明书进行操作），得单链cDNA,以反转录所得的单链DNA为模板，以SBP-F和SBP-R为引物进行PCR扩增，凝胶电泳观察（见图9），得到SBPase基因的全长cDNA序列1185bp(见SEQ ID No:2)

[0075] （4）SBPase基因序列的定点突变，为了避免目的基因上含有的酶切位点在载体构建过程中被切开，通过重叠延伸PCR方法将SBPase基因序列进行定点突变，即在第238bp位点上将C突变为T；在第416bp位点上将G突变为A；在第641bp位点上将A突变为T，652bp位点上C突变为A；上述碱基突变后其编码的氨基酸残基没有改变。定点突变后所得的核苷酸序列见SEQ ID No:4。

[0076] 实施例4双基因表达载体的构建

[0077] 按照如下方法进行：

[0078] （1）HindⅢ酶切实施例2构建的cy-fbpase基因的中间载体pG4A-cy-fbpase，切下约2.3k的cyfbpase基因的表达盒，同时HindⅢ单酶切实施例5构建的sbpase单基因植物表达载体pGBI-sbpase，分别回收2.3k的cyfbpase基因的表达盒和约13k的HindⅢ单酶切的sbpase单基因植物表达载体pGBI-sbpase。回收产物连接，得连接产物。

[0079] （2）将连接产物热激法转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，在卡那抗性平板上筛选阳性单菌落，挑菌后在卡那抗性LB液体培养基中37℃、200rpm培养过夜。

[0080] （3）将摇起的菌液小提质粒，对质粒进行PCR和HindⅢ酶切鉴定。将鉴定正确的质粒命名为pGBI-sbp-fbp（见图10），以备下一步的转化农杆菌LBA4404感受态细胞。

[0081] 实施例5、目的基因的重组质粒导入农杆菌

[0082] 按照如下方法进行：

[0083] 将构建好的表达载体通过电激法转化农杆菌

[0084] （1）、于-80℃冰箱中取出制备好的LBA4404感受态细胞，在50μL感受态细胞中加入1μL实施例2中构建好的，植物过表达载体质粒（pGBI-sbpase、pGBI-cy-fbpase、pGBI-sbp-fbp）混匀、冰浴15min。

[0085] （2）、吸入2mm电击杯中（避免产生气泡），2500V电击转化。

[0086] （3）、电激完立即往电击杯中加入800μl LB液体培养基；用枪头混合几次后吸出加入EP管中，直至菌液完全吸出，然后在28℃、180rpm培养复苏4～5h。

[0087] （4）、将菌体涂布于含50μg/mL利福平（简写为：Rif）、卡那霉素（简称为：Kan）的LB平板上，28℃倒置培养两天左右可出现菌落。

[0088] （5）、挑取单菌落接种于含有50μg/mLRif、Kan的LB液体培养基中，菌液摇起后进行PCR鉴定，鉴定结果显示获得相应的的基因片段，说明pGBI-sbpase、pGBI-cy-fbpase、pGBI-sbp-cyfbp基因表达载体分别已成功转入农杆菌中。

[0089] 实施例6、含目的基因转化植株的获得

[0090] （1）、农杆菌培养从LB平板上挑取含有目的基因的（pGBI-sbpase、pGBI-cy-fbpase、pGBI-sbp-fbp）单菌落，接种到LB液体培养基3ml中（Rif50μg/ml、Kan100μg/ml），于恒温摇床上28℃，180rpm摇培过夜至OD600为0.6-0.8，得活化的菌液。

[0091] （2）、将已活化的菌液按1:1000的比例（500μl：500ml比例）接种于LB液体培养基（Rif50μg/ml、Kan100μg/ml）中，28℃，250rpm摇菌过夜，至菌液OD值约0.6-0.8，既可用于转化。菌液4℃、4000rpm、离心5min，弃去液体培养基，用2倍体积MS液体悬浮，用于侵染。

[0092] （3）、侵染：于超净工作台上，以1-2周苗龄的无菌的烟草NC89的苗叶为实验材料，将切去尖端和基部的叶片切成0.5cm左右的方块，浸入菌液中约20min，用无菌滤纸吸干叶片上的菌液，接种在共培养基（MS+2mg/L6-BA+0.5mg/LIAA）上，并在叶片的上下均放一张无菌滤纸。

[0093] （4）、共培养：用封口膜封好培养皿，28℃黑暗中培养2-4天。

[0094] （5）、选择培养：将共培养的外植体转移到筛选培养基（组成成分及其比例为：MS共培养培养基+500mg/LCar+200mg/LKan）上，在光照为2,000Lux、25-28℃、16/8h光暗条件下选择培养。叶盘边缘轻压入培养基中，以增加选择压力。每周转接一次。

[0095] （6）、生根培养：约2-3周后，抗性芽长到2cm左右时，切下抗性芽并转移到生根培养基（组成成分及其比例为：1/2MS培养基+500mg/LCep+200mg/LKan）上进行生根培养，1-2周后长出不定根。

[0096] （7）、无菌苗的移栽：约2周根长出时，在培养箱中将封口膜打开一半至逐渐打开全部炼苗。一周后，将幼苗移植到盛有蛭石的小盆中，上面盖一层薄膜以保湿，室温（25℃）自然光照下培养，一周后将薄膜逐渐揭开。当幼苗完全成活长到10cm左右时可以将幼苗移到盛有营养土和蛭石3:1混合配制的大盆中自然生长,对转化苗进行检测（T0代），成熟时收获得T1代种子。

[0097] （二）、转基因植株的PCR鉴定试验

[0098] 以烟草转化苗的基因组DNA为模板，以FBP-F和FBP-R为引物进行PCR扩增，对cy-fbpase基因转基因植株进行检测，所述引物为：

[0099] FBP-F 5’-ATGGATCACGAAGCAGATGC-3’ （Seq ID No:9）；

[0100] FBP-R 5’-CTATTCGTCCGCAGCATACAG-3’ （Seq ID No:10）；

[0101] 以烟草转化苗的基因组DNA为模板，以SBP-F和SBP-R为引物进行PCR扩增，对sbpase转基因植株进行检测。

[0102] SBP-F GGGAATTCGATGTGYATGGGAGAAGCWTTG （SEQ ID No:11）；

[0103] SBP-R GGAAGCTTGGMACCATTCCTCCRGTGTATC （SEQ ID No:12）；

[0104] PCR反应体系（共50μL）：dNTP2μl，10×Buffer5μl，上游引物1μl，下游引物1μl，转化苗的基因组DNA1μL，Taq0.5μL，ddH2O39.5μL。PCR反应条件：94℃5min；94℃30s、60℃30s、72℃60s、35个循环；72℃5min。电泳检测，

[0105] 扩增结果显示获得了1017bp的cy-fbpase基因片段和1185bp的sbpase基因片段，说明cy-fbpase基因已成功转化到烟草NC89中，获得了cy-fbpase基因烟草转化苗。

[0106] 双基因烟草转化株的PCR鉴定（见图11）显示双基因烟草PCR分子检测，1.2k的条带为SBPase基因、1.1k条带为cy-FBPase基因。

[0107] 通过叶盘法将三个植物表达载体pGBI-sbpase、pGBI-cyfbpase、pGBI-sbp-fbp分别转化烟草，共得到转化株77株，其中SBPase单基因转化株24株，cy-FBPase单基因转化株26株，双基因转化株27株。

[0108] 实施例7转基因烟草基因表达量测定试验

[0109] 取野生型和转基因烟草六叶期时第二新鲜叶片，提取总RNA,反转录，进行荧光定量PCR检测，分析转基因植株的目的基因表达情况。结果显示各转基因植株中基因的mRNA表达量都有相应的提高，且双基因植株中两个基因的表达量都为最高，其中SBPase基因mRNA表达量为野生型的1.96倍，cy-FBPase表达量为野生型的2.18倍。SBPase单基因植株中SBPase基因的表达量约为野生型的1.71倍，cy-FBPase单基因植株cy-FBPase的基因表达量为野生型的1.88倍。此外，SBPase单基因植株中除了SBPase基因表达量有明显的提高外cy-FBPase的表达也比野生型提高28%。cy-FBPase单基因植株中SBPase表达量比野生型提高约11%。这一结果说明两个基因之间存在协同促进表达的作用，且SBPase促进cy-FBPase表达的作用更加明显一些。两个基因之间的相互促进表达作用也解释了双基因转化株中两个基因的表达量都为最高这一现象。

[0110] 实施例8转基因烟草酶活性检测

[0111] 对转基因植株和野生型植株叶片分别进行SBPase和cy-FBPase的酶活性检测，分析转基因植株相应的酶活性是否有明显的提高。对以下酶活性数据分析显示，双价转基因烟草的SBPase活性和cy-FBPase的酶活性均有显著提高,分别为野生型的1.45倍和1.77倍。SBPase单基因植株的SBPase酶活性比野生型提高30%，cy-FBPase单基因植株cy-FBPase酶活性比野生型提高约55%。与基因的表达相同，其中一个酶活性的提高对另一个酶活性也有影响，cy-FBPase的单基因植株中SBPase活性比野生型提高10%，SBPase单基因植株中cy-FBPase酶活性要比野生型提高达20%。说明在植物体内这两个酶彼此之间存在一定的相互促进作用，且SBPase酶活性对cy-FBPase酶活性的促进作用更强一些,可能是因为SBPase酶活性的提高增加了有机物质的积累，“源”的固定能力增强，推动了蔗糖的合成和转运。

[0112] 实施例9转基因植株蔗糖含量测定对比试验

[0113] 取八叶期顶部第三叶的叶片去掉主叶脉，和第三叶与第四叶之间的茎组织分别进行蔗糖含量的测定。

[0114] 蔗糖测定采用高效液相色谱法。因为可溶性糖在高温条件下溶于乙醇，故采用乙醇高温提取方法。称取0.1g植株的叶片和茎放在105℃的烘箱15min,然后在75℃的烘箱中烘干过夜至恒重,取出研碎。置于15mL试管中，加入6～7mL80％乙醇，在80℃水浴中提取30min，取出离心3000rpm5min，收集上清液。重复提取两次（各10min）同样离心，收集三次上清液合并于烧杯，置于85℃恒温水浴，使乙醇蒸发至2～3mL，转移至50mL容量瓶，以蒸馏水定容，供蔗糖的测定。

[0115] 结果（见表1）显示转双基因植株叶片和茎中蔗糖含量均为最高，分别达到野生型的2倍和2.26倍，转cy-FBPase单基因植株叶片、茎中蔗糖含量也有明显提高，分别比野生型提高59%和66%，转SBPase基因植株叶片和茎中蔗糖含量也分别比野生型提高10%和14%。以上结果可以看出，在cy-FBPase过表达植株叶片和茎中蔗糖含量都有较显著提高，但是在茎中蔗糖的提高幅度比叶片更大。这个结果说明cy-FBPase酶活性提高，使植株的蔗糖合成能力增强，碳同化物向蔗糖的分配水平提高，从源向库的运输量也随之增加，因此茎中蔗糖含量的提高更大。进一步证明cy-FBPase酶对于提高蔗糖合成效率和调节有机物质的转化、运输和分配有重要的作用。同时转SBPase基因的植株中蔗糖含量的提高说明了“源”固定能力的增强也可以在一定程度上促进“流”的合成和运输。转双基因植株其本身的蔗糖合成能力提高，加之源固定能力增强，更大程度上促进了蔗糖的合成，所以其蔗糖含量最高。

[0116] 表1.蔗糖含量测定结果表（mg/g）

[0117]

[0118] 表中数据为均值±标准差（n=5）All values shown are mean±SD(n=5).[0119] 实施例10转基因植株淀粉含量测定

[0120] 蔗糖提取后的沉淀物质供淀粉检测。

[0121] （1）将以上沉淀用蒸馏水洗2-3次后加5ml80%的Ca（NO3）2溶液，震荡混合，转移到100ml的三角瓶中，用10ml80%的Ca（NO3）2冲洗研钵，沸水浴上煮沸5min。

[0122] （2）加入20ml蒸馏水，混合液转入离心管中，3000rpm离心2～3min，将离心后的胶体浑浊液移入100ml容量瓶中，蒸馏水定容。

[0123] （3）取5～10ml淀粉待测液，加入到盛有2ml0.5%碘液的离心管中，混匀静置15min后3000rpm离心5min，弃上清液。沉淀用5%的含碘Ca（NO3）2溶液冲洗两次，加入
10ml0.1M的NaOH溶液混匀，将离心管浸入沸水内5min。

[0124] （4）沉淀溶解后转入50ml容量瓶中，加入0.3ml0.5%碘液，用30ml左右的水冲洗并入容量瓶，加入2ml1M的盐酸，用水定容并显色，测590nm波长下的吸光值。

[0125] （5）绘制标准曲线，取标准淀粉溶液（1mg/mL）0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于6个离心管中，用80％硝酸钙溶液将各管的体积补足至5mL，再向各管加入2mL0.5％碘液，混匀静置15min后离心，其他操作同样品测定步骤，显色后在590nm波长下测定光密度。然后以光密度为横坐标，以淀粉含量为纵坐标绘制标准曲线。

[0126] （6）将样品测得的吸光值带入标准曲线，计算出样品的淀粉含量。

[0127] 淀粉含量测定结果(见表2)发现双基因植株叶片中淀粉含量比野生型提高53%，转SBPase单基因植株淀粉含量比野生型提高约37%，说明SBPase酶活性的提高对于碳固定能力的增强和淀粉合成效率有显著的作用。而转cy-FBPase单基因植株叶片淀粉含量比野生型略低。分析原因可能是cy-FBPase活性的提高，促进了同化产物从源到库的分配，表现在降低源组织同化物的积累，增加了由源到库的运输，使淀粉含量减少，蔗糖含量提高。

[0128] 表2.淀粉含量测定结果表(mg/g)

[0129]

[0130] 表中数据为均值±标准差（n=5）All values shown are mean±SD(n=5).[0131] 对同一叶片的蔗糖含量和淀粉含量做比值，以便较直观的说明同化产物的源库分配情况。具体数值见图12，显示转cy-FBPase单基因植株中该比值最大，而在SBPase单基因植株中比值最低，可能是因为SBPase活性较高，光合作用的碳固定合成淀粉量较大，而蔗糖合成能力未能相应提高，所以该比值相对较小。而在双基因植株中虽然蔗糖含量也有显著的提高，但同时其淀粉的固定能力也有较大提高，所以该比值小于cy-FBPase单基因植株。结果也说明叶片作为源组织，蔗糖合成与淀粉的积累呈负相关，cy-FBPase活性的提高，蔗糖合成量增加，促进了同化物从源到库的分配。

[0132] 实施例11转基因植株干重的测定试验

[0133] 取八叶期从顶部数第四片叶的叶片和第四叶与第五叶之间的茎组织，叶片除掉主叶脉。称取相同的重量0.5g，70℃烘干5-6h，称烘干后的重量，计算出干重/鲜重的比值。每一转基因株系各取5株进行测定。

[0134] 结果（如表3）所示，在转双基因植株中叶片和茎的该比值都为最大，转SBPase单基因植株次之。说明该比值与SBPase酶活性有关系，SBPase活性越高该比值越大，说明植株干重与光合碳固定能力呈正相关。同时转cy-FBPase单基因植株茎的干重与SBPase单基因植株茎的干重的差异不如叶片干重的差异大，再一次说明了cy-FBPase促进了有机物质从叶片到茎的运输。在双基因植株中该比值最高，可能是两个酶起到相互的促进作用调节植株有机物质的合成和转化的效率更高，更有效的促进植株生长。

[0135] 表3.叶片和茎的干重/鲜重比值测定结果

[0136]

[0137] 表中数据为均值±标准差（n=5）All values shown are mean±SD(n=5)[0138] 实施例12转基因植株株高、叶面积、茎粗性状测定对比试验

[0139] 在植株的生长过程中定期的对各生长指标进行观察统计。每两周测定一次株高和茎直径，茎直径的测定位置为植株低端接近根部的位置。记录统计株高和茎直径的生长变化。植株停止营养生长后测定每一植株从底部向上的叶面积变化，记录不同植株相同叶位的叶面积大小。叶面积计算方法：叶面积=2/3×叶长×叶宽。每个数据均取5个样品的平均值。

[0140] 结果发现SBPase单基因植株高度与转双基因植株的高度相差不大，而cy-FBPase单基因植株的高度却要低一些，与野生型的高度相似。在植株停止营养生长进入开花期时测量植株的叶面积，统计每一植株从底部向顶部的叶面积变化。通过叶面积的比较发现，双基因植株在相同叶位上的叶面积最大，其次是cy-FBPase单基因植株和SBPase单基因植株，都大于野生型。植株生长不同时期茎的直径测量，统计结果显示双价植株直径最大，两单基因植株茎粗相似略小于双基因植株，野生型的直径最小。综上生长参数我们可以推测各基因在植物生长中的功能，SBPase和cy-FBPase对于叶面积和茎的生长都有促进作用，但是cy-FBPase对茎的加粗和叶片的生长作用更加明显，可能是蔗糖促进了有机物质之间的转化，使纤维素的合成能力增强进而促进植物茎和叶的生长。

[0141] 实施例13烟草果荚重量测定

[0142] 对收获的不同转基因株系的烟草的果荚进行晾干、称重比较分析。分析不同转基因植株的种子产量的差异。不同的转基因株系各取5株，每株称量10个果荚，计算平均值。

[0143] 结果（见表4）收获T1代的种子果荚，晾干称重，野生型单果荚重量2.6g，双基因植株平均每个果荚重量为4g，比野生型提高了53%，SBPase单基因植株和cy-FBPase单基因植株的平均果荚重量分别为3.45g和3.3g，比野生型提高了32%和26%。这些数据都说明了两个基因对植株的生长发育和植株产量都有积极的影响和促进作用。双基因植株则表现出更加显著的生长优势，说明了源库流效率对作物产量的影响是很大的，源库流效率越高，则有机物质的利用率越高，植物生长状态越好，故作物产量越高。

[0144] 表4、种子的果荚重量测定结果表（g）

[0145]