一种辅助鉴定猪背膘厚性状的方法及其专用产品转让专利
申请号 : CN201310278483.7
文献号 : CN103320516B
文献日 : 2014-08-27
发明人 : 王立贤 , 张龙超 , 王立刚 , 赵克斌 , 颜华
申请人 : 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所
摘要 :
本发明公开了一种辅助鉴定猪背膘厚性状的方法及其专用产品。该辅助鉴定猪的背膘厚性状的方法，是检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C,以确定所述待测猪的基因型是TT还是TC还是CC，根据所述待测猪的基因型确定背膘厚性状：TT基因型的待测猪的背膘厚高于TC基因型的待测猪，TC基因型的待测猪的背膘厚高于CC基因型的待测猪。应用本发明对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪背膘厚。
权利要求 :
1.一种辅助鉴定猪的背膘厚性状的方法，是检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C,以确定所述待测猪的基因型是TT还是TC还是CC，根据所述待测猪的基因型确定背膘厚性状：TT基因型的待测猪的背膘厚高于或候选高于TC基因型的待测猪，TC基因型的待测猪的背膘厚高于或候选高于CC基因型的待测猪；所述TT基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，所述TC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的方法为测序分析；所述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件:以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的第47033位脱氧核糖核苷酸。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述PCR扩增所用的引物对为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对。
4.根据权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：所述背膘厚为六七肋对应处的背膘厚和/或平均背膘厚。
5.一种辅助鉴定猪的背膘厚性状的试剂，是检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质。
6.根据权利要求5所述的试剂，其特征在于：所述物质为由序列表中序列1所示的DNA和序列表中序列2所示的DNA组成的引物对。
7.根据权利要求5或6所述的试剂，其特征在于：所述背膘厚为六七肋对应处的背膘厚和/或平均背膘厚。
8.辅助鉴定猪的背膘厚性状的试剂盒，含有权利要求5所述的试剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述辅助鉴定猪的背膘厚性状的试剂盒含有权利要求6所述的试剂。
10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于：所述背膘厚为六七肋对应处的背膘厚和/或平均背膘厚。
11.权利要求5或6所述的试剂、或权利要求8或9所述的试剂盒在辅助鉴定猪的背膘厚性状中的应用、或在制备辅助鉴定猪的背膘厚性状的产品中的应用。
12.根据权利要求11所述的应用，其特征在于：所述背膘厚为六七肋对应处的背膘厚和/或平均背膘厚。
13.权利要求1-4中任一所述的方法、权利要求5-7中任一所述的试剂或权利要求
8-10中任一所述的试剂盒在猪育种中的应用。
14.培育薄背膘猪的方法，包括选择CC基因型或TC基因型的猪进行育种；所述CC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，所述TC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。
说明书 :
一种辅助鉴定猪背膘厚性状的方法及其专用产品
技术领域
[0001] 本发明涉及一种辅助鉴定猪背膘厚性状的方法及其专用产品。
背景技术
[0002] 我国地方猪种闻名于世的一大优良特性就是肉品质优良，这些地方品种、含地方品种血液的培育品种甚至是中外杂交商品猪肉都因其优良的肉品质，广受消费者欢迎，例如北京黑猪肉、莱芜黑猪肉、黑山猪肉、苏太猪肉等深受消费者好评。并且，这些高品质猪肉的售价为普通猪肉的1.5-3倍，充分体现了当前阶段我国地方品种猪的商业价值。但是这些猪种多数都为脂肪型猪，其显著特点是背膘厚度大。背膘沉积过多不仅导致生长缓慢，同时也不符合当前形势对于节粮的要求。众所周知，生长瘦肉相比生长脂肪所需能量少，而我国多数地方品种猪为脂肪型猪，其料肉比多数都在4:1以上。据研究表明，背膘厚与料肉比的遗传相关可达0.55（Hoque MA,Suzuki1K,Kadowaki H,Shibata T，Oikawa T.Genetic parameters for feed efficiency traits and their relationships with growth and carcass traits in Duroc pigs.J Anim Breed Genet.2007,124:108-116.），与瘦肉率的遗传相关可达-0.58（孙华，宋忠旭，李良华，彭先文，郭万正，武华玉，梅书棋.中国大白猪SⅡ1系主要生长和胴体性状的遗传参数估测.湖北农业科学.2009,48,3086-3089.）。因此，我国地方猪种及含有地方猪血统的品种背膘厚均在3厘米以上，我国地方品种的优势还未充分发挥出来，与国际商业猪种相比，还有很大的改进潜力。
[0003] 基于上述猪背膘厚性状的重要性，针对其开展育种工作是当前育种工作的一个重点。由于传统育种速度慢、准确程度低，分子育种以其准确性和快速性等特点已成为当前育种工作主要技术手段。
[0004] 过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARs)是一类由配体激活的核转录因子，属于类固醇／甲状腺／维甲酸受体超家族，由PPARα、PPARγ和PPARδ(PPARD)3个成员组成，它们都能介导亲脂性小分子化合物调节DNA转录，PPARs能够调控许多参与细胞内外脂类代谢的目的基因表达，尤其是编码β氧化过程中一些重要酶类的基因，另外PPARs也参与脂肪细胞的分化(Evans RM,Barish GD,Wang YX.PPARs and the complex journey to obesity.Nat Med.2004,10:355-361.)。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种辅助鉴定猪背膘厚性状的方法及其专用产品。
[0006] 本发明提供的辅助鉴定检测猪背膘厚性状的方法，是检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARD）基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C,以确定所述待测猪的基因型是TT还是TC还是CC，根据所述待测猪的基因型确定背膘厚性状：TT基因型的待测猪的背膘厚高于或候选高于TC基因型的待测猪，TC基因型的待测猪的背膘厚高于或候选高于CC基因型的待测猪；所述TT基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体；所述CC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第
47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，所述TC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第
47033位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。
47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，所述TC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第
47033位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。
[0007] 上述方法中，所述检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C具体可为检测序列表中序列3或序列4的第95位是T还是C还是T和C。
[0008] 上述方法中，所述检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的方法具体可为测序分析；所述述测序分析包括PCR扩增和对PCR扩增产物进行测序两个步骤；所述PCR扩增所用的引物对满足如下条件:以待测猪的基因组DNA为模板进行PCR扩增的产物含有猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸。
[0009] 上述方法中，所述PCR扩增所用的引物对具体可为由序列表中序列1所示的单链DNA和序列表中序列2所示的单链DNA组成的引物对。
[0010] 本发明所提供的辅助鉴定猪背膘厚性状的一种专用产品是辅助鉴定猪的背膘厚性状的试剂。
[0011] 本发明所提供的辅助鉴定猪的背膘厚性状的试剂是检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质。
[0012] 上述试剂中，所述物质具体可为由序列表中序列1所示的单链核苷酸和序列表中序列2所示的单链核苷酸组成的引物对。当采用所述引物对进行PCR扩增时，根据待测猪的基因组DNA的不同，扩增得到的DNA片段为序列3所示的核苷酸或序列4所示的核苷酸。
[0013] 本发明所提供的辅助鉴定猪背膘厚性状的另一种专用产品是含有上述辅助鉴定猪的背膘厚性状的试剂的试剂盒。
[0014] 上文中，检测待测猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸是T还是C还是T和C的物质可为通过下述至少一种方法确定猪的过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位的单核苷酸多态性所需的试剂和/或仪器：DNA测序、限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、变性高效液相色谱和SNP芯片。其中，SNP芯片包括基于核酸杂交反应的芯片、基于单碱基延伸反应的芯片、基于等位基因特异性引物延伸反应的芯片、基于“一步法”反应的芯片、基于引物连接反应的芯片、基于限制性内切酶反应的芯片、基于蛋白DNA结合反应的芯片，及基于荧光分子DNA结合反应的芯片。
[0015] 上述试剂、或上述试剂盒在辅助鉴定猪的背膘厚性状中的应用以及在制备辅助鉴定猪的背膘厚性状的产品中的应用均属于本发明的保护范围。
[0016] 所述产品可为试剂或试剂盒，还可为试剂或试剂盒和仪器的组合产品，如由引物和DNA测序仪组成的组合产品，或由PCR试剂和DNA测序试剂和DNA测序仪组成的组合产品。
[0017] 上文中，所述背膘厚可为第六七肋对应处的背膘厚和/或平均背膘厚。
[0018] 在本发明的一个实施方式中，所述待测猪为大民杂交猪。
[0019] 上述方法、试剂或试剂盒均可用于培育具有更厚或更薄背膘厚性状的猪，从而应用于猪的育种。
[0020] 本发明还提供了一种培育薄背膘猪的方法。
[0021] 本发明所提供的培育薄背膘猪的方法，包括选择CC基因型或TC基因型的猪进行育种；所述CC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARD）基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体，所述TC基因型为过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位脱氧核糖核苷酸为C和T的杂合体。
[0022] 实验证明，CC基因型群体分别比TT基因型群体在六七肋背膘厚和平均背膘厚分别薄5.49mm和5.60mm（P<0.01），CC基因型群体分别比TC基因型群体在六七肋背膘厚和平均背膘厚分别薄3.12mm和3.31mm（P<0.01）。所以过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位可作为猪背膘厚性状分子育种标记。
[0023] 应用本发明对猪进行育种，可对待选猪进行早期筛选，有效地缓解实际生产中的选优良种猪时间长的问题，降低育种花费，有效降低或提高实际生产中的猪背膘厚。本发明的检测方法操作简单、费用不高、准确度高，并可实现自动化的直接检测。
附图说明
[0024] 图1为序列M1和序列M2的测序结果图（猪PPARD基因g.47033C>T突变位点测序图）。
具体实施方式
[0025] 下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0026] 下述实施例中的大民杂交猪为大白猪×民猪的F2代，按照文献中的方法获得：Luo W,Cheng D,Chen S,Wang L,Li Y,Ma X,Song X,Liu X,Li W,Liang J,Yan H,Zhao K,Wang C,Wang L,Zhang L.Genome-wide association analysis of meat quality traits in a porcine Large White×Minzhu intercross population.Int J Biol Sci.2012,8:580-595。具体方法如下：四头大白猪分别交配16头民猪，获得F1代群体，此F1代群体中的9头公猪交配46头母猪，三个胎次共生产了575头F2代个体。
[0027] 实施例1、辅助鉴定猪的背膘厚性状
[0028] 一、猪PPARD基因g.47033C>T多态性位点的确定
[0029] 1、PCR扩增
[0030] 根据猪PPARD基因基因组DNA序列(GenBank Accession Number GU565976.1)信息,设计一对引物如下：
[0031] U（上游引物）：5’-caaaacgcagtagcaggaaa-3’（序列表的序列1）；
[0032] D（下游引物）：5’-cccaacctctctagcacacc-3’（序列表的序列2）。
[0033] 选择3头大民杂交猪为实验材料。以每头大民杂交猪的基因组DNA为模板，使用引物U和D进行PCR扩增。
[0034] 扩增体系为：基因组DNA200ng，10×PCR扩增缓冲液5μl，dNTPs10mM，上、下游引2＋
物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg 2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl。
物各50ng，Taq DNA聚合酶0.75U，Mg 2.5mmol/L，用ddH2O补充反应体系至50μl。
[0035] PCR反应条件为：95℃变性5min；然后95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸30s，共35个循环；最后72℃延伸10min。
[0036] PCR产物经琼脂糖凝胶检测后于-20℃保存。分别以3头大民杂交猪的基因组DNA为模板进行扩增的产物分别命名为产物1、产物2、产物3。
[0037] 2、克隆测序及序列分析
[0038] 分别将3种PCR产物用琼脂糖凝胶回收试剂盒（天根生化科技有限公司）回收纯化，回收的DNA片段连接载体pGEM-T(Promega公司)后，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞（明日百傲（北京）科技有限公司），根据载体上的羧卞青霉素抗性标记筛选阳性克隆，得到含有回收片段的重组质粒。以该重组质粒载体上的T7和SP6启动子序列为引物对其进行核苷酸序列测定（英潍捷基（上海）贸易有限公司）。测序结果表明：产物1为序列M1，产物2为序列M1和序列M2的混合物，产物3为序列M2；序列M1和序列M2的长度均为212bp，只存在一个脱氧核糖核苷酸的差异（T/C）(见图1)，此脱氧核糖核苷酸为GenBank Accession Number GU565976.1（update date 是2010年4月26日）的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸，将该单核苷酸多态命名为g.47033C>T。序列M1的核苷酸序列见序列表的序列3，序列M2的核苷酸序列见序列表的序列4。将过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的自
5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体基因型命名为TT，过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月
26日）的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体基因型为CC，它们的杂合体基因型为TC。
5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为T的纯合体基因型命名为TT，过氧化物酶体增殖物激活受体δ基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月
26日）的自5′末端第47033位脱氧核糖核苷酸为C的纯合体基因型为CC，它们的杂合体基因型为TC。
[0039] 二、猪PPARD基因g.47033C>T多态位点与猪背膘厚及肉品质性状的相关性分析[0040] 为确定g.47033C>T多态位点与猪背膘厚性状是否相关，以575头大民杂交猪为实验材料，进行如下试验：提取每头猪的基因组DNA，用上述引物U和D进行PCR扩增并对每头猪的PCR扩增产物进行测序分析，确定每头猪的基因型是TT还是TC还是CC，方法同步骤一。根据猪的基因型确定背膘厚性状：TT基因型的待测猪的背膘厚高于TC基因型的待测猪，TC基因型的待测猪的背膘厚高于CC基因型的待测猪。
[0041] 测定并记录每头猪240日龄时的背膘厚（肩部最厚处膘厚、第六七肋对应处的背膘厚（六七肋背膘厚）、胸腰椎接合处膘厚、腰荐椎接合处膘厚）、肌内脂肪含量（IMF）等性状，对g.47033C>T位点与性状以最小二乘法开展关联分析。所用模型如下：
[0042] Y=S+P+B+G+e
[0043] 其中Y为性状测定值，S为性别效应，P为胎次效应，B为屠宰批次效应，G为基因型效应，e为残差效应。
[0044] 表1PPARD基因突变位点g.47033C>T基因型与脂肪沉积相关性状的关联[0045]基因型 数量 六七肋背膘厚(mm) 平均背膘厚(mm) 肌内脂肪(%)
TT 161 40.01±0.77A 40.14±0.76A 3.14±0.18A
TC 273 37.64±0.68B 37.85±0.67B 3.11±0.16A
CC 141 34.52±0.77C 34.54±0.76C 3.13±0.18A
TT 161 40.01±0.77A 40.14±0.76A 3.14±0.18A
TC 273 37.64±0.68B 37.85±0.67B 3.11±0.16A
CC 141 34.52±0.77C 34.54±0.76C 3.13±0.18A
[0046] 注：同列上标字母相同表示差异不显著(P>0.01),同列上标字母不同表示差异极显著(P<0.01).
[0047] 其中，膘厚指皮下脂肪的厚度，不含皮厚。取肩部最厚处膘厚、六七肋对应处的膘厚、胸腰椎接合处膘厚、腰荐椎接合处膘厚的平均值做为平均背膘厚。
[0048] 结果如表1，表明在背膘厚性状中，TT基因型猪的背膘厚高于TC基因型猪，TC基因型的猪背膘厚高于CC基因型的猪；CC基因型群体分别比TT基因型群体在六七肋对应处的背膘厚和平均背膘厚分别薄5.49mm和5.60mm（P<0.01），CC基因型群体分别比TC基因型群体在六七肋对应处的背膘厚和平均背膘厚分别薄3.12mm和3.31mm（P<0.01）。说明本发明利用过氧化物酶体增殖物激活受体δ（PPARD）基因的GenBank Accession Number GU565976.1（update date是2010年4月26日）的第47033位的单核苷酸多态性鉴定猪背膘厚性状的方法与猪背膘厚的实际测定结果一致。
[0049] 所以，在实际的猪育种中，为获得更薄背膘的猪，最好选择CC基因型的猪进行育种。