一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡及其应用

摘要

本发明提供了一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金免疫试纸卡，包括微孔试剂、反应膜、样本吸收垫、吸水垫、保护膜和底板，在所述反应膜上具有包被氟喹诺酮类药物?载体蛋白偶联物的检测区和包被羊抗鼠IgG的质控区。本发明还提供了一种应用上述试纸卡检测牛奶中氟喹诺酮类药物的方法，它包括步骤：首先进行样本前处理，然后用试纸卡进行检测，最后分析检测结果。本发明提供的试纸卡可用于检测牛奶中的氟喹诺酮类药物残留，其操作简单、灵敏度高、检测速度快、成本低，能够现场监控，满足大量样本筛查的需要。

权利要求

1.一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的试剂盒，其特征在于包括试纸条和微孔试剂，所述试纸条包括反应膜、样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板，所述反应膜上有检测区和质控区，检测区包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物，质控区包被有抗抗体，所述微孔试剂上冻干有氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物，所述氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物为喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白的偶联物，所述喹诺酮类药物半抗原的制备方法主要包括如下步骤：将诺氟沙星1mmol，溶于55ml三氯甲烷中，加入DCC 2mmol，DMAP催化剂适量，对氨基苯乙酸乙酯1.5mmol，室温搅拌5h，TLC监测原料消失，过滤，将液相水洗，无水Na2SO4干燥，用体积比为1:5的乙酸乙酯/石油醚进行柱层析纯化，将产物溶于甲醇中，加NaOH 0.76g，60℃搅拌5h，TLC监测原料消失，减压脱溶剂，将得到的粘稠物溶于1mol/L NaOH溶液，调节pH3～5，乙酸乙酯萃取，干燥，用体积比为1:1的乙酸乙酯/石油醚进行柱层析纯化，得到喹诺酮类药物半抗原。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试纸条由样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次黏贴在底板上组成，所述微孔试剂上具有微孔塞。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述保护膜粘贴在试纸条两端，其中一端粘贴在样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线，另一端粘贴在吸水垫上为手柄端。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一侧，所述质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一侧。

5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物由喹诺酮类药物半抗原与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白或卵清蛋白。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物中的氟喹诺酮类药物特异性抗体是以氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得，所述氟喹诺酮类药物特异性抗体为氟喹诺酮类药物单克隆抗体，所述氟喹诺酮类药物单克隆抗体是由保藏登记号为CGMCC NO.5885的抗氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株D-3-1分泌的。

7.一种制备权利要求1-6任一项所述的试剂盒方法，其包括步骤：

1)制备冻干有氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

2)制备具有包被氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、保护膜、吸水垫、底板组装成试纸条；

4)将1)和3)制备好的冻干有氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸条组装成试剂盒。

8.一种牛奶样本中氟喹诺酮类药物残留的检测方法，其包括步骤：

1)用权利要求1-6任一项所述的试剂盒进行检测；

2)分析检测结果。

说明书

一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的胶体金试纸卡及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的试剂盒及方法，属于免疫化学速测技术领域。

背景技术

[0002] 氟喹诺酮类(Fluoroquinolones，FQs)药物是近10年来迅速发展起来的一类十分重要的广谱抗生素，是第三代喹诺酮类抗菌药物。主要有环丙沙星(Ciprofloxacin，CIP)、恩诺沙星(Enrofloxacin，ENR)、沙拉沙星(Sarafloxaxcin，SAR)、单诺沙星(Danoxacin，DAN)和达氟沙星(Difloxacin，DIF)等。在化学结构上本类药物属吡酮酸衍生物，其共同特点是喹啉环的C-6位上有氟原子，C-7位上连接哌嗪基或吡咯基。FQs均为白色或淡黄色粉末，一般易溶于稀碱和稀酸溶液。FQs结构中均含有苯并杂环或并杂环骨架和羰基、羧基、杂原子等生色基团或助色基团组成的共轭系统，在紫外区具有特征性和强的吸收。

[0003] FQs为细菌DNA合成抑制剂，作用的靶酶是DNA旋转酶DNA-grase。细菌的DNA旋转酶是由A、B两个亚单位组成的四聚体(A2B2)，主要催化染色体或质粒DNA发生拓扑学转变。亚单位A具有切断双链DNA的功能，使DNA结构发生拓扑学改变，以不断解除DNA复制过程中产生的拓扑学障碍，或使DNA发生超螺旋化、环化、打结或解结等。

[0004] FQs的作用特点可归结为对革兰氏阴性菌、支原体和一些革兰氏阳性菌具有强大的杀灭作用，组织渗透能力强。可用于大肠杆菌、肺炎链球菌、肺炎杆菌、肺炎衣原体、金黄色葡萄球菌、肠球菌、变形杆菌、流感杆菌、绿脓杆菌等引起的多种组织感染，如呼吸道、肠道、泌尿、皮肤和深部组织感染或败血症的治疗。人们关注FQs的作用机制是否可能具有致癌或遗传毒性。实验室研究表明ENR在实验动物中显示一定的致突变和胚胎毒作用，DIF和DAN对大鼠有潜在的致癌作用。

[0005] 动物源性食品中残留较低浓度的FQs药物，除了可能对消费者产生毒副作用外，更为严重的是，随着FQs使用的增多，细菌对FQs的耐药性增长较快，耐药水平越来越高，越来越普遍，易诱导人类致病菌产生耐药性，从而不利于该类药物在人类疾病中的治疗。另外，我国是动物源性食品出口国，多年来因药残问题造成拒收、扣留、退货、索赔直至终止贸易事件时有发生，给外贸及相关产业，甚至我国的国际形象造成很大的影响。我国已经加入WTO，农畜产品出口面临的国际市场压力更大。

[0006] 目前测定动物组织中喹诺酮残留量的定性检测技术有微生物法、荧光分光光度法、酶联免疫分析法等；定量检测技术有高效液相色谱法、液相色谱-质谱联用法，还可采用毛细管区带电泳和毛细管胶束电动色谱法等。气相色谱因其熔点高极性大气化时易分解并被吸附，一般必须进行化学修饰以提高其挥发性及气相色谱条件下的稳定性，故较为少用；毛细管电泳国内研究较少。农业部在第236号公告45中发布了动物性食品中恩诺沙星、环丙沙星、嗯喹酸和氟甲喹的残留检测方法，其它FQs标准检测方法尚未规定。

[0007] 酶联免疫试剂盒因为操作简单，省时，所以是各个国家检测兽药残留的首选方法。但是试剂盒对于实验环境仍然有较高的要求，不能进行现场检测，因此，在实践中有必要建立一种敏感度高、操作简单、成本低、检测药物种类多、适合大规模推广的现场检测方法。

发明内容

[0008] 本发明的一个目的是提供一种检测牛奶中氟喹诺酮类药物的试剂盒。

[0009] 本发明所提供的试剂盒包括微孔试剂和试纸，微孔试剂具有微孔塞，试纸包括底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜，其依次连接；所述微孔试剂中冻干有氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物；氟喹诺酮类药物特异性抗体为氟喹诺酮类药物单克隆抗体；反应膜上包被有检测区和质控区；检测区包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物，质控区包被羊抗鼠抗抗体。

[0010] 所述保护膜粘贴在试纸两端，其中一端粘贴在样品吸收垫上，为检测端，上面有MAX标记线，另一端粘贴在吸水垫上为手柄端。

[0011] 所述检测区位于近于有MAX标记的保护膜的一侧，所述质控区位于远离有MAX标记线的保护膜的一侧。

[0012] 所述氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物是由氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联得到，所述载体蛋白为牛血清白蛋白、卵清蛋白。

[0013] 所述氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物中的氟喹诺酮类药物特异性抗体是以氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物作为免疫原制备获得。

[0014] 所述底板为PVC底板；样品吸收垫为吸滤纸；吸水垫为吸水纸；反应膜可为硝酸纤维素膜；保护膜为PE材质保护膜。

[0015] 本发明的另一个目的是提供一种制备上述试剂盒的方法，其包括步骤：

[0016] 1)制备冻干有氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

[0017] 2)制备具有包被氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的检测区和包被抗抗体的质控区的反应膜；

[0018] 3)将2)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

[0019] 4)将1)和3)制备好的冻干有氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

[0020] 具体的说，制备步骤包括：

[0021] 1)将氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联，形成氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物；

[0022] 2)用氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物免疫小鼠，将小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞通过融合、筛选，得到分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

[0023] 3)提取小鼠IgG免疫健康山羊，得到羊抗鼠IgG抗体；

[0024] 4)用柠檬酸三钠与氯金酸反应制备胶体金；

[0025] 5)将制备的氟喹诺酮类药物特异性抗体加入到制备的胶体金中，得到氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物；

[0026] 6)将氟喹诺酮类药物特异性抗体-胶体金标记物冻干在微孔试剂中后，将微孔试剂加上微孔塞；

[0027] 7)将样品吸收垫用含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，在37℃下烘干2h。

[0028] 8)在底板上按顺序贴上样品吸收垫、反应膜、吸水垫和保护膜；

[0029] 9)将制备好的微孔试剂和试纸组装成试剂盒，2～8℃条件下保存12个月。

[0030] 本发明的另一个目的是提供一种牛奶样本中氟喹诺酮类药物残留的检测方法。

[0031] 用本发明上述任一所述试剂盒进行检测。

[0032] 本发明试剂盒的检测原理：将待检牛奶样本滴加于微孔试剂，混匀后，孵育5min，将标有MAX标记线端向下，插入孵育后的微孔试剂，待检样品液与微孔中的金标抗体结合后一起向反应膜扩散；若待检样品液中氟喹诺酮类药物的含量高，则扩散过程中待测样品液中的氟喹诺酮类药物可与金标抗体相结合，进而完全封闭金标抗体上氟喹诺酮类药物的抗原结合点，阻止金标抗体与反应膜上氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物结合，检测区不能显色，而抗抗体则可与金标抗体结合，质控区显色；若待检样品液中氟喹诺酮类药物的含量低或者无，则金标抗体上的抗原结合位点不能被完全封闭，进而金标抗体会与反应膜上氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联抗原结合，检测区显色，同时抗抗体也可与金标抗体结合，质控区显色。如果质控区不显色，则试纸失效。如图4所示。

[0033] 阳性：当质控区(C)显示出红色条带，而检测区(T)不显色，判为阳性，用“+”表示。

[0034] 阴性：当质控区(C)显示出红色条带，而检测区(T)显色，判为阴性，用“-”表示。

[0035] 无效：当质控区(C)不显示红色条带，则无论检测区(T)是否出现红色条带，试纸均失效。

[0036] 本发明的试剂盒具有敏感度高、特异性高、成本低、操作简单、检测时间短、适合各种单位使用、储存简单、保质期长的优点。其中，采用高特异性的氟喹诺酮类药物单克隆抗体，保证了检测结果的可靠性；将金标抗体冻干在微孔试剂中，在检测过程中，能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，从而减少误差，增加整个体系的反应灵敏度。用本发明试剂盒检测氟喹诺酮类药物的方法，简便、快速、直观、准确，适用范围广，成本低，易推广使用。

附图说明

[0037] 图1为试纸剖面结构示意图。

[0038] 图2为试纸的俯视图。

[0039] 图3为微孔试剂图。

[0040] 图4为试纸检测结果判定图。

[0041] 图中：1、样本垫；2、反应膜；3、吸水垫；4、检测区；5、质控区；6、背衬；7、保护膜；8、微孔；9、胶塞。

具体实施方式

[0042] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0043] 实施例1、检测氟喹诺酮类药物的试剂盒的构成

[0044] 一、微孔试剂

[0045] 所述微孔试剂上具有微孔塞；

[0046] 所述微孔试剂上冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物，包被量0.20～0.25μg/mL。

[0047] 二、试纸(称作试纸条)(图1)：

[0048] 所述试纸是由底板、样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜组成；

[0049] 所述样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜依次按顺序黏贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；

[0050] 所述试纸两端黏贴有保护膜。

[0051] 保护膜7-1覆盖在吸水垫上手柄端，保护膜7-2覆盖在样品吸收垫上的检测端，在检测端保护膜上印有MAX字样(图2)。

[0052] 所述反应膜上有检测区4和质控区5，检测区和质控区均为与所述试纸条的长相垂直的条带状，检测区位于近于有MAX标记线的保护膜的一侧，质控区位于远离有MAX标记的保护膜的一侧。检测区包被有氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物(氟喹诺酮类药物-牛血清白蛋白的偶联物)，质控区包被有羊抗鼠抗抗体。

[0053] 底板为PVC底板；样品吸收垫为吸滤纸；吸水垫为吸水纸；反应膜为硝酸纤维素膜；所述保护膜为PE材质保护膜。

[0054] 将上述试纸与微孔试剂组装成试剂盒，在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

[0055] 实施例2、实施例1中所述试剂盒的制备方法

[0056] 一、试剂盒的制备

[0057] 该试剂盒的制备方法主要包括如下步骤：

[0058] A)制备冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

[0059] B)制备具有包被氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的检测区和包被羊抗鼠抗抗体的质控区的反应膜；

[0060] C)将B)制备好的反应膜与样品吸收垫、吸水垫、保护膜、底板组装成试纸；

[0061] D)将A)和C)制备好的冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂和试纸组装成试剂盒。

[0062] 下面分步详细叙述：

[0063] (一)各部件的制备

[0064] 1、氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的合成与鉴定

[0065] 氟喹诺酮类药物是小分子物质，只有反应原性，没有免疫原性，不能诱发机体产生免疫应答，必须与大分子载体蛋白偶联后才具有免疫原性。

[0066] A，半抗原的制备

[0067] 将诺氟沙星1mmol，溶于55ml三氯甲烷中，加入DCC 2mmol，DMAP催化剂适量，对氨基苯乙酸乙酯1.5mmol，室温搅拌5h，TLC监测原料消失，过滤，将液相水洗，无水Na2SO4干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/5)。将上述产物溶于甲醇中，加NaOH0.76g，60℃搅拌5h，TLC监测原料消失，减压脱溶剂，将得到的粘稠物溶于1mol/L NaOH溶液，调节pH3～5，乙酸乙酯萃取，干燥，柱层析纯化(洗脱剂，乙酸乙酯/石油醚，1/1)，得喹诺酮类半抗原。

[0068] B，包被原的制备-氟喹诺酮类药物与卵清蛋白偶联物合成

[0069] 取15mg诺氟沙星半抗原，溶解于1mL DMF中，得到溶液(1)，取15mg EDC用0.2mL水充分溶解后加入(1)中，室温下搅拌24h，即可得到反应液A。称取BSA40mg，使之充分溶解在3mL PBS(pH 7.2)中，将反应液A逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用
0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

[0070] C，免疫原的制备-氟喹诺酮类药物与牛血清白蛋白偶联物合成

[0071] 取20mg诺氟沙星半抗原用0.8mL DMF溶解，冷却至10℃，得到溶液(1)，取氯甲酸异丁酯10μL加入(1)中，10℃搅拌反应30min，取30mg卵清蛋白用2.2mL 50mmol/L Na2CO3溶解10℃反应4h，然后4℃过夜，用0.01mol/L PBS 4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。

[0072] D，氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的鉴定

[0073] 将载体蛋白、氟喹诺酮类药物、氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物用pH7.4的PBS配成0.5mg/mL的溶液，以0.01mol/L pH7.4PBS调零，用紫外分光光度计在波长200～800nm范围内扫描，得到载体蛋白、氟喹诺酮类药物、氟喹诺酮类药物-载体蛋白偶联物的吸收曲线。三者出现不同的吸收曲线，表明氟喹诺酮类药物与载体蛋白偶联成功。

[0074] 2、氟喹诺酮类药物单克隆抗体的制备

[0075] A，动物免疫

[0076] 用上述制备出的免疫原(FQS-BSA)按100μg/只，以生理盐水溶解免疫原与弗氏完全佐剂等体积混匀，颈背部皮下注射免疫6～8周龄Balb/c雌鼠，初次免疫后第7、14、28天以免疫原与弗氏不完全佐剂等体积混匀，各追加免疫一次，融合前3天以免疫复合物100μg/只，不加弗氏佐剂再追加免疫一次。

[0077] B，细胞融合和克隆化

[0078] 取免疫Balb/c小鼠脾细胞，按9∶1(数量配比)比例与SP2/0骨髓瘤细胞融合，筛选得到稳定分泌氟喹诺酮类药物单克隆抗体的氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株。

[0079] C，细胞冻存和复苏

[0080] 将杂交瘤细胞用冻存液制成1×109个/mL的细胞悬液，在液氮中长期保存。复苏时取出冻存管，立即放入37℃水浴中速融，离心去除冻存液后，移入培养瓶内培养。

[0081] D，最后获得稳定分泌抗氟喹诺酮类药物单克隆杂交瘤细胞株D-3-1，该细胞株已于2012年03月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏登记号为CGMCC NO.5885。

[0082] E，单克隆抗体的制备与纯化

[0083] 增量培养法：将杂交瘤细胞置于细胞培养基中，在37℃条件下进行培养，用辛酸-饱和硫酸铵法将得到的培养液进行纯化，得到单克隆抗体，-20℃保存。

[0084] 所述细胞培养基为添加有小牛血清和碳酸氢钠的RPMI-1640培养基，使小牛血清在细胞培养基中的终浓度为20％(质量百分含量)，使碳酸氢钠在细胞培养基中的终浓度为0.2％(质量百分含量)；所述细胞培养基的pH为7.4。

[0085] 3、羊抗鼠抗抗体的制备：以羊作为免疫动物，以鼠源抗体为免疫原对无病原体羊进行免疫，得到羊抗鼠抗抗体。

[0086] 4、氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

[0087] A，胶体金的制备

[0088] 用双蒸去离子水将1％氯金酸(购于sigma公司，产品目录号T09041)稀释成0.01％(质量百分含量)，置磁力加热棒搅拌器上搅拌煮沸，每100mL 0.01％氯金酸加入2.5mL 1％柠檬酸三钠(购于广州化学试剂厂，产品目录号BG11-AR-01KG)，继续搅拌加热反应至液体呈红色时停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。

[0089] B，氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的制备

[0090] 在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾调胶体金的pH值至7.0，按50～100μg抗体/mL胶体金的标准向胶体金溶液中加入上述氟喹诺酮类药物单克隆抗体，继续搅拌混匀30min，加入10％BSA至BSA在胶体金溶液中的终浓度为1％(体积百分含量)，静置30min。12000rpm、4℃离心30min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/20的复溶缓冲液将沉淀重悬，得到的氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物溶液的浓度为50μg单抗/mL溶液，置4℃备用。

[0091] 复溶缓冲液：含酪蛋白、吐温-80的0.02mol/L、pH7.2的磷酸盐溶液，其中酪蛋白在复溶缓冲液中的终浓度为0.05％(体积百分含量)，吐温-80在复溶缓冲液中的终浓度为0.15％(质量百分含量)。

[0092] 5、将氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上

[0093] 向微孔试剂微孔板中加入100μL氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，冷阱温度为-70℃条件下，预冻4h后，再冻干14h，即可取出，得到冻干有氟喹诺酮类药物单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂；

[0094] 6、样品吸收垫的准备：将样品吸收垫置于含牛血清白蛋白(牛血清白蛋白在缓冲液中的终浓度为0.5％(体积百分含量))、pH为7.2、0.1mol/L磷酸盐缓冲液浸泡2h，37℃烘2h备用；

[0095] 7、反应膜的制备

[0096] 包被过程：用磷酸缓冲液将氟喹诺酮类药物-牛血清白蛋白偶联物稀释到10mg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区，包被量为1.0μg/cm2；用0.01mol/L、pH 7.4PBS缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到200μg/mL，用Biodot点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区，包被量为1.0μg/cm2。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥
2h，备用。

[0097] (二)各部件的组装

[0098] 1、试纸的组装：

[0099] 将所述样品吸收垫、反应膜、吸水垫、保护膜依次按顺序黏贴在所述底板上；样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫的始端相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐；在组装好的试纸两端黏贴保护膜。

[0100] 2、试剂盒组装

[0101] 将上述步骤1得到试纸与微孔试剂组装成试剂盒，在2～8℃的环境中储存，有效期12个月。

[0102] 二、试剂盒的灵敏度和特异性检验

[0103] (一)灵敏度试验

[0104] 将恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、依诺沙星、培氟沙星、氟甲喹、恶喹酸、达氟沙星标准品(购自德国Dr和中国兽医药品监察所)稀释成如下不同浓度：0、10、20、40μg/L(恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星)；0、20、40、80μg/L(依诺沙星、恶喹酸)，所用的稀释液为pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液。

[0105] 用试剂盒进行检测。每次向微孔试剂中滴加200μL样品，混匀，孵育5min后，将试纸插入检测，结果为：滴试0、10μg/L的恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星和0、20μg/L的依诺沙星、恶喹酸时，试纸条上显示出肉眼可见的两条红色条线，呈阴性；当滴试20、40μg/L的恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星和40、80μg/L的依诺沙星、恶喹酸时，试纸条质控区显色，但检测区不显色，呈阳性。

[0106] 表明，本试剂盒对恩诺沙星、沙拉沙星、双氟沙星、氧氟沙星、诺氟沙星、环丙沙星、培氟沙星、氟甲喹、达氟沙星检测灵敏度为20μg/L，对依诺沙星、恶喹酸检测灵敏度为40μg/L。

[0107] (二)特异性试验

[0108] 特异性常用交叉反应率表示，是指抗体与结构不同的抗原决定簇发生结合的能力。将牛奶中常检的其他药物：三聚氰胺、磺胺类药物、氯霉素、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、四环素类药物用pH为7.2、0.2mol/L的磷酸盐缓冲液进行稀释。用实施例1中所述的试剂盒进行检测，结果显示三聚氰胺、磺胺类药物、氯霉素、大环内酯类药物、氨基糖苷类药物、四环素类药物在500μg/L浓度时，试纸条质控区和检测区均显色，可以得出本试剂盒未对这些药物发生交叉反应。

[0109] 实施例3、试纸的应用

[0110] 一、用实施例1中所述试剂盒检测牛奶中氟喹诺酮类药物

[0111] 本发明的试剂盒可以检测牛奶样品。一般的检测方法如下：

[0112] 1、检测方法

[0113] 向微孔试剂中滴加200μL需检测的样品溶液，混匀后，孵育5min，将试纸有MAX线标记端朝下插入微孔试剂，在5min内观看结果。

[0114] 2、检测结果判定

[0115] 氟喹诺酮类药物在样品中浓度高于或等于试剂盒最低检测限时，胶体金抗体与氟喹诺酮类药物结合，从而在检测区内因为竞争反应不会与氟喹诺酮类药物偶联物结合而不出现红色条带，呈阳性。阴性样品在检测过程中由于缺少抗体抗原竞争反应，将会在检测区与质控区内出现红色条带。如图4所示。

[0116] 阳性：当质控区(C)显示出红色条带，而检测区(T)不显色时，判为阳性。如图4a所示

[0117] 阴性：当质控区(C)显示出红色条带，检测区(T)同时也显示出红色条带，判为阴性。如图4b所示

[0118] 无效：当质控区(C)不显示出红色条带，则无论检测区(T)显示出红色条带与否，该试纸判为无效。如图4c、4d所示

[0119] 下面具体举例：

[0120] 取已知恩诺沙星含量大于20μg/L的牛奶阳性样品20份和浓度小于20μg/L的牛奶阴性样品20份，用3个批次生产的试剂盒分别进行检测，计算其阴阳性率。

[0121] 表1检测阳性样本结果

[0122]

[0123] 表2检测阴性样本结果

[0124]

[0125] 结果表明：用3个批次生产的试剂盒检测阳性牛奶样本时，阳性符合率为100％；检测20份阴性牛奶样本时，阴性符合率为100％。本发明的检测氟喹诺酮类药物试剂盒可以对氟喹诺酮类药物残留进行快速检测。