促黄体素配体和配体-促性腺素复合物

摘要

本发明涉及一种促黄体素(LH)配体，其特征在于它包含抗羊LH抗体的互补位，所述配体的重链可变域含有以下CDR：-VH-CDR1，由序列GYTFTNYW(SEQ ID NO:13)限定；-VH-CDR2，由序列IYPGGGYT(SEQ ID NO:14)限定；-VH-CDR3，由序列ARTPLYGSSYGGFAY(SEQ ID NO:15)限定；并且轻链可变域含有以下CDR：-VL-CDR1，由序列QGISNY(SEQ ID NO:16)限定；-VL-CDR2，由序列YTS限定；-VL-CDR3，由序列QQYSKLPWT(SEQ ID NO:17)限定。本发明还涉及一种配体-促性腺素(LH,hCG,FSH)复合物。本发明的配体或复合物可用于诱导雌性哺乳动物的排卵。

权利要求

1.一种促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，其特征在于它包含抗羊LH抗体的互补位，所述单克隆抗体或其抗原结合片段的重链可变域含有以下CDR：-VH-CDR1，由序列GYTFTNYW(SEQ ID NO:13)限定；

-VH-CDR2，由序列IYPGGGYT(SEQ ID NO:14)限定；

-VH-CDR3，由序列ARTPLYGSSYGGFAY(SEQ ID NO:15)限定；并且轻链可变域含有以下CDR：-VL-CDR1，由序列QGISNY(SEQ ID NO:16)限定；

-VL-CDR2，由序列YTS限定；

-VL-CDR3，由序列QQYSKLPWT(SEQ ID NO:17)限定。

2.如权利要求1中所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，特征在于其重链的框架区FR1的N端部分由序列X1VQLQX1SGAE(SEQ ID NO:24)限定，其中X1代表谷氨酰胺或谷氨酸。

3.如权利要求2中所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，特征在于其重链的框架区FR1的N端部分由序列SEQ ID NO:24限定，其中X1代表谷氨酰胺。

4.如权利要求2或3中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，特征在于其轻链的FR1区的N端部分含有序列X2TQX3TSS(SEQ ID NO:25)，其中X2代表甲硫氨酸或赖氨酸并且X3代表苏氨酸或丙氨酸。

5.如权利要求2中所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，选自：a)由杂交瘤CNCM I-4332产生的单克隆抗体1A6C4G11；

b)上文抗体a)的Fab、Fab'或Fab'2片段；

c)包含上文抗体a)的互补位的抗原结合片段。

6.如权利要求3中所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，其选自：a)由杂交瘤CNCM I-4333产生的单克隆抗体9A4A7D3；

b)由杂交瘤CNCM I-4334产生的单克隆抗体9A4D4B6；

c)上文抗体a)或b)的Fab、Fab'或Fab'2片段；

d)包含上文抗体a)或b)的互补位的抗原结合片段。

7.如权利要求6所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段，其为由序列SEQ ID NO:28限定的scFv片段，其中145位的氨基酸为脯氨酸。

8.如权利要求1至7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段在制备医药产品中的用途。

9.如权利要求1至7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于增强LH的生物活性的试剂中的用途。

10.如权利要求1、2、3、4、6或7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段在制备用于增强LH的生物活性和FSH的生物活性的试剂中的用途。

11.一种促黄体素(LH)单克隆抗体-促性腺素复合物或促黄体素(LH)单克隆抗体的抗原结合片段-促性腺素复合物，其选自：-如权利要求1至7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体与LH或hCG的复合物或如权利要求1至7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体的抗原结合片段与LH或hCG的复合物；

-如权利要求1、2、3、4、6、7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体与FSH的复合物或如权利要求1、2、3、4、6、7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体的抗原结合片段与FSH的复合物。

12.如权利要求11中所述的复合物在制备医药产品中的用途。

13.如权利要求1至7中任一项所述的促黄体素(LH)单克隆抗体或其抗原结合片段或如权利要求11所述的复合物在制备用于诱导雌性哺乳动物的排卵的试剂中的用途。

说明书

促黄体素配体和配体-促性腺素复合物

[0001] 本发明涉及针对促黄体素(luteinizing hormone,LH)的抗体及其用途。

[0002] 促黄体素是促性腺素(gonadotropin)家族中的糖蛋白激素。这个家族包括参与生殖腺功能和配子发生的各种激素；在垂体促性腺素和绒毛膜促性腺素之间存在差异，垂体促性腺素在全部哺乳动物物种中产生并且除LH之外还包括促卵泡激素(FSH)，绒毛膜促性腺素由胎盘产生的并仅在某些哺乳动物物种(人(hCG)和马(eCG))中存在。

[0003] 促性腺素具有常见结构：它们由非共价结合的两个糖蛋白链(α和β)形成。在一个物种和相同物种内部，α链常见于LH、FSH、TSH并可能常见于绒毛膜促性腺素，并且正是β链负责该激素的特异性。

[0004] 在雌性中，FSH负责卵母细胞的生长和分化并且LH诱导卵母细胞的末端生长和排卵。在雄性中，LH刺激睾酮产生。

[0005] 在雌性中，LH和FSH在性静息期中和在排卵期之外处于非常低的血浆浓度。这些激素分泌的高峰出现在前排卵期，这导致引发排卵。

[0006] 促性腺素用于人用药物和兽医药物中以便模仿控制性周期的内分泌机制。例如，在羊和山羊育种时，与孕激素组合的eCG(在除马物种之外的物种中，它具有LH和FSH双重活性)用于诱导动情期和排卵并使其同步化，以及用于超排卵处理情境中。

[0007] 虽然这些技术具有经证明的功效，它们带来可察觉的健康风险，因为eCG从孕马血浆提取。另外，在某些动物中，重复使用eCG诱导免疫反应，其反应为抗eCG抗体在血浆中的分泌。在大多数情况下，这种免疫反应导致抵消eCG的活性，并且反应为降低的治疗功效。然而，在少数动物中，发现抗eCG抗体产生相反具有增强eCG的生物活性的性能。在申请EP1518863中描述了具有这种性能的多克隆抗体。然而，这些抗体需要同时施用eCG。

[0008] 本发明人现在已经获得针对羊内源性LH产生的单克隆抗体，并且他们观察到，这些抗体的一些能够增强其作用。

[0009] 这些激动性单克隆抗体在下文分别称作9A4A7D3(下文也命名为D3)、1A6C4G11(下文也命名为G11)和9A4D4B6(下文也命名为B6)。

[0010] 根据布达佩斯条约，在2010年6月30日，将产生抗体9A4A7D3的杂交瘤以编号CNCM I-4333保藏于CNCM(Collection Nationale de Cultures de Microorganismes Institut Pasteur[法国国家微生物培养物保藏中心，巴斯德研究所]，5rue du Docteur Roux,75724Paris Cedex15,法国)。

[0011] 根据布达佩斯条约，在2010年6月30日，将产生抗体1A6C4G11的杂交瘤以编号CNCM I-4332保藏于CNCM。

[0012] 根据布达佩斯条约，在2010年6月30日，将产生抗体9A4D4B6的杂交瘤以编号CNCM I-4334保藏于CNCM。

[0013] 另外，本发明人发现，这些抗体中有两种即9A4A7D3和9A4D4B6令人惊讶地也拥有FSH增强作用。

[0014] 测定了这些抗体的重链和轻链的可变区的序列。在下表I(对于9A4A7D3的轻链和重链而言)、下表II(对于1A6C4G11的轻链和重链而言)、和下表III(对于9A4D4B6的轻链和重链而言)中显示这些序列以及推导的多肽序列。核苷酸序列也在所附序列表中分别以编号SEQ ID NO:1、3、5、7、9和11显示，并且多肽序列也分别以编号SEQ ID NO:2、4、6、8、10和12显示。

[0015] 表I

[0016]

[0017] 表II

[0018]

[0019] 表III

[0020]

[0021] 使用IMGT/V-QUEST软件，也基于以上重链序列和轻链序列确定编码9A4A7D3、1A6C4G11 和 9A4D4B6 的 CDR 的 序 列 (Giudicelli 等 人 Nucleic Acids Research32,W435-W440,2004；Brochet，X.等人,Nucl.Acids Res.36,W503-508,2008)。这些序列对于3种抗体是相同的。

[0022] 下文在表IV中显示3种抗体9A4A7D3、1A6C4G11和9A4D4B6的推导多肽序列。它们也在所附序列表中以编号SEQ ID NO:13至17给出。

[0023] 表IV

[0024]

[0025] 本发明涉及一种促黄体素(LH)配体，其特征在于它包含抗羊LH抗体的互补位，所述配体的重链可变域含有以下CDR：

[0026] -VH-CDR1，由序列GYTFTNYW(SEQ ID NO:13)限定；

[0027] -VH-CDR2，由序列IYPGGGYT(SEQ ID NO:14)限定；

[0028] -VH-CDR3，由序列ARTPLYGSSYGGFAY(SEQ ID NO:15)限定；和

[0029] 所述轻链可变域含有以下CDR：

[0030] -VL-CDR1，由序列QGISNY(SEQ ID NO:16)限定；

[0031] -VL-CDR2，由序列YTS限定；

[0032] -VL-CDR3，由序列QQYSKLPWT(SEQ ID NO:17)限定。

[0033] CDR(互补性决定区)是参与抗原识别特异性的抗体可变区的部分。

[0034] 如本文中所用的“抗羊LH抗体”定义为通过用羊LH免疫动物获得并且能够与羊LH结合的任何抗体。该定义不限于能够与羊LH选择性结合的抗体，还包括也能够与其他哺乳动物(例如牛、山羊、猪或人)的LH结合的抗体；另外，它也包括也能够与其他哺乳动物(例如牛、山羊、猪或人)的LH结合的抗体；也包括能够也与一种或多种其他促性腺素(羊或一些其他来源)结合的抗体，如特别是FSH或hCG。另外，术语“LH配体”也包括也能够与一种或多种个其他促性腺素结合的配体。

[0035] 这里，“促性腺素”意指具有促性腺活性，即能够刺激FSH受体和LH受体的任何蛋白质，无论它是否为天然蛋白或重组蛋白。更具体地，除天然LH或FSH之外，术语“LH”和“FSH”还包括任选地经修饰优化其药理学性能的重组LH或FSH。作为非限制性例子，可以提到绒促卵泡素α，其是由人绒毛膜促性腺素(hCG)的β亚基的羧基端肽与人FSH的β链融合产生的嵌合FSH，具有延长其半寿期的作用并且因此延长其作用的持续期，而不影响其FSH活性。

[0036] 本发明人测试了3种抗羊LH抗体9A4A7D3、9A4D4B6和1A6C4G11与羊、牛或猪LH、羊、牛、猪或人FSH，以及hCG的结合能力，并且发现能够与全部这些促性腺素结合。

[0037] 所述轻链的CDR1、CDR2和CDR3的序列以及所述重链的CDR1、CDR2和CDR3的序列对于3种单克隆抗体B6、D3和G11是相同的。另外，所述轻链的框架FR2、FR3和FR4的序列以及所述重链的FR2、FR3和FR4的序列是相同的。

[0038] 然而，VH链和VL链的FR1的N端序列变动取决于所讨论的抗体：

[0039] 因此，在抗体G11(其与LH和FSH结合，但仅增强LH)的情况下，对轻链的FR1区所测定的N端序列是DIQMTQTTSS(SEQ ID NO:18)，并且对重链的FR1区所测定的N端序列是EVKLQQSGAE(SEQ ID NO:19)。

[0040] 在抗体B6(其与LH和FSH结合，并且激动这两种促性腺素)的情况下，对轻链的FR1区所测定的N端序列是DIVMTQATSS(SEQ ID NO:20)，并且对重链的FR1区所测定的N端序列是EVQLQQSGAE(SEQ ID NO:21)。

[0041] 在抗体D3(其与LH和FSH结合，并且激动这两种促性腺素)的情况下，对轻链的FR1区所测定的N端序列是KTQTTSS(SEQ ID NO:22)，并且对重链的FR1区所测定的N端序列是EVQLQESGAE(SEQ ID NO:23)。

[0042] 在scFv B6(其源自抗体B6并具有与抗体B6和D3相同的结合至LH和FSH并激动这两种促性腺素的性能)的情况下，VH结构域的FR1区的N端序列不同于SEQ ID NO:21，在于存在N端谷氨酰胺，而非谷氨酸。

[0043] 在这种假设不是限制性的情况下，激动FSH的能力似乎由重链的FR1区的N端序列决定，并且尤其由位置3中的氨基酸的性质决定。赖氨酸在这个位置上的存在似乎与抗体仅增强LH活性的能力相关，而谷氨酰胺的存在似乎与抗体同时增强LH活性和FSH活性的能力相关。

[0044] 根据本发明LH配体的第一实施方案，所述配体增强LH但是不激动FSH，并且其重链的框架区FR1的N端部分由序列EVKLQQSGAE(SEQ ID NO:19)限定。

[0045] 根据本发明LH配体的第二实施方案，所述配体增强LH和FSH，并且其重链的框架区FR1N端部分由序列X1VQLQX1SGAE(SEQ ID NO:24)限定，其中X1代表谷氨酰胺或谷氨酸，优选地代表谷氨酰胺。

[0046] 根据这些实施方案的一个或其他的优选构造，所述配体的轻链的FR1区的N端部分含有序列X2TQX3TSS(SEQ ID NO:25)，其中X2代表甲硫氨酸或赖氨酸并且X3代表苏氨酸或丙氨酸；有利地，所述N端部分由DIX4X2TQX3TSS(SEQ ID NO:26)限定，其中X2和X3如上文限定，并且X4代表谷氨酰胺或缬氨酸。

[0047] 作为例子，所述N端部分可以由以下序列之一限定：

[0048] -序列DIQMTQTTSS(SEQ ID NO:18)；

[0049] -序列DIVMTQATSS(SEQ ID NO:20)；

[0050] -序列DIQMTQATSS(SEQ ID NO:27)；

[0051] -序列KTQTTSS(SEQ ID NO:22)。

[0052] 根据第一实施方案LH配体是例如一种配体，其含有抗体G11的轻链FR1区和重链FR1区，并且有利地含有所述抗体的整个可变域VH和VL。

[0053] 根据本发明第二实施方案的LH配体例如是：

[0054] -配体，其含有抗体D3的轻链FR1区和重链FR1区，并且有利地含有所述抗体的整个可变域VH和VL。

[0055] -配体，其含有抗体B6的轻链FR1区和重链FR1区，并且有利地含有所述抗体的整个可变域VH和VL。

[0056] -配体，其含有scFv片段B6的可变域VH的FR1区和可变域VL的FR1区，并且有利地含有所述片段scFv的整个可变域VH和VL。

[0057] 本发明的LH配体特别包括：

[0058] a)由杂交瘤CNCM I-4332产生的单克隆抗体1A6C4G11；

[0059] b)由杂交瘤CNCM I-4333产生的单克隆抗体9A4A7D3；

[0060] c)由杂交瘤CNCM I-4334产生的单克隆抗体9A4D4B6；

[0061] d)上文抗体a)、b)或c)的Fab、Fab'或Fab'2片段；

[0062] e)包含上文抗体a)、b)或c)的互补位的重组蛋白。

[0063] 本发明的重组蛋白可以特别是源自上文的单克隆抗体a)、b)或c)的重组抗体，经修饰以便降低它们在将要施用所述抗体的动物或人中的免疫原性。

[0064] 本发明的重组抗体可以例如是嵌合抗体，即一种重组抗体，其保留衍生所述重组抗体的单克隆抗体的可变域，但是其恒定域已经由另一种抗体的那些可变域替换，所述可变域通常是下述抗体的那些可变域：所述抗体源自必须对其施用所述嵌合抗体的受试者隶属的物种。

[0065] 它也可以是一种重组抗体，其中将原始鼠单克隆抗体(称作“供体”抗体)的互补位转移至一种抗体(称作“接纳”抗体)以代替所述接纳抗体的互补位，所述接纳抗体源自必须对其施用所述重组抗体的受试者隶属的物种。如果接纳抗体是人抗体，则这种重组抗体称作“人源化抗体”。如果接纳抗体例如是羊、山羊、牛、猪等来源的，则相应重组抗体分别称作“”羊源化抗体”、“山羊源化抗体”、“牛源化抗体”、“猪源化抗体”等。

[0066] 用于实施这种替换的各种方法是本身已知的。最常使用的那些基于移植CDR，这由用供体抗体的CDR替换接纳抗体的那些CDR组成。在某些情况下，可以通过优化FR区完成移植CDR，这由以下组成：插入供体抗体的FR区中参与结合抗原性能的氨基酸代替受体抗体的FR区中的相应氨基酸，以优化最终重组抗体的抗原结合性能(参考，例如Routledge等人,“Reshaping antibodies for therapy(重塑治疗用抗体)”，引自Protein Engineering of Antibody Molecules for Prophylactic and Therapeutic Applications in Man,13-44,Academic Titles,Nottingham,England,1993或者ROGUSKA等人,Protein Engineering,9(10):895-904,1996)。

[0067] 本发明的重组抗体优选地是IgM类免疫球蛋白，并且特别是κ同种型免疫球蛋白。

[0068] 本发明的重组蛋白也可以是包含以上抗体a)、b)或c)的互补位的抗体片段。它可以特别是片段Fab、Fab'、Fab'2、Fv、dsFv或scFv、或其他双链抗体、三体抗体或四体抗体。

[0069] 一价Fab片段各自含有由二硫键连接在一起的轻链及前半部分重链。二价Fab'2片段包含两个Fab片段和部分铰链区。一价Fab片段因Fab'2片段的铰链区中的二硫键裂解产生。

[0070] Fv片段由抗体的VH链和VL链的可变域组成，所述可变域通过疏水相互作用彼此连接。dsFv片段由二硫键连接的VH::VL二聚体组成。scFv片段由抗体重链和轻链的可变部分组成，所述可变部分经柔性肽接头连接(Clackson等人,Nature,352:624-628,1991)，因此形成单链蛋白。片段Fv、dsFv、和scFv是一价的。双链抗体、三体抗体和四体抗体是二价、三价或四价形式，它们分别由2个、3个或4个scFv片段的多聚化产生。

[0071] 如果需要，这些抗体片段可以与体内施用时延长其血浆半寿期的分子组合；它们可以例如与足够分子量的水溶性多肽融合，从而如此获得的融合多肽的分子量高于肾过滤阈值，或与多元醇(例如聚乙二醇)缀合。

[0072] 根据本发明的羊LH配体的一个优选实施方案，该配体是scFv片段。

[0073] 作为非限制性例子，在所附序列表中以编号SEQ ID NO:28显示源自抗体CNCM I-4334的本发明scFv片段的肽序列。

[0074] Fab和Fab'2片段可以通过酶消化从本发明的抗体获得，在Fab片段的情况下通过木瓜蛋白酶消化，在Fab'2片段的情况下通过胃蛋白酶消化获得。Fab'片段可以从Fab'2片段通过裂解铰链区中的二硫键获得。

[0075] 也可以通过经典基因工程技术，如Sambrook等人,(MOLECULAR CLONING,A LABORATORY MANUAL， 第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1989)描述的那些，获得这些片段，以及重组抗体、片段Fv、dsFv、scFv和它们的多价衍生物。

[0076] 可以通过从杂交瘤CNCM I-4333、CNCM I-4332和CNCM I-4334的cDNA库克隆，获得编码单克隆抗体9A4A7D3、1A6C4G11和9A4D4B6的可变区的多核苷酸。也可以从所述可变区的核苷酸序列开始，通过核酸合成法完全或部分地制备它们。

[0077] 本发明也涉及编码本发明配体的任何核酸分子，以及包含所述核酸分子的任何重组载体，特别是任何表达载体。

[0078] 除编码本发明重组蛋白的序列，本发明的核酸分子可以有利地包含编码信号肽的序列，所述信号肽允许分泌所述蛋白质；它们也可以包含编码一种或多种标记肽的一个或多个序列，所述标记肽允许检测和/或促进所述蛋白质的纯化。

[0079] 本发明的表达载体包含编码本发明蛋白质的至少一个核酸序列，其与在选定宿主细胞中有活性的、控制转录和翻译的元件结合。可用构建本发明表达载体的宿主载体是本身已知的，并且将根据待使用的宿主细胞变化而特别选择。

[0080] 本发明也涉及表达本发明的羊LH的配体的任何细胞。这种细胞特别包括杂交瘤CNCM I-4333、CNCM I-4332和CNCM I-4334，以及用本发明核酸分子转化的宿主细胞。

[0081] 可用于本发明情境中的宿主细胞可以是原核或真核细胞。可以通过分子生物学经典技术实施本发明表达载体的构建和宿主细胞的转化。

[0082] 本发明也涉及一种产生本发明LH配体的方法，其特征在于它包括培养本发明的至少一种细胞并从所述培养物回收所述配体。

[0083] 如果该配体被分泌，则可以从培养基直接回收它；否则将利用细胞的初步裂解，或在大肠杆菌(Escherichia coli)中表达的情况下回收周质(periplasm)。

[0084] 配体可以随后通过本身由本领域技术人员已知的常规的方法，例如通过分级沉淀法(特别是硫酸铵沉淀法)、电泳、凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析等从腹水(ascetic fluid)，从培养基或从细胞裂解物中纯化。

[0085] 本发明的配体可用于以下全部情况，其中需要增强LH活性，不仅是羊LH、更常见的是所述配体识别的任何天然LH或重组LH的活性。另外，含有抗体D3和B6的互补位的配体使以下成为可能：激动所述配体识别的任何天然或重组FSH的FSH活性。

[0086] 本发明也涉及由本发明配体和能够与所述配体结合的促性腺素以及特别是其作用受所述配体激动的天然或重组促性腺素形成的复合物。

[0087] 本发明的复合物特别包括：

[0088] -本发明配体与LH的复合物；

[0089] -本发明配体与hCG的复合物；

[0090] -源自抗体D3或B6之一的本发明配体与FSH的复合物。

[0091] 可以通过将本发明配体简单地与选择的促性腺素温育获得本发明的复合物。本发明复合物的施用使得以下成为可能：放大复合的促性腺素的活性并因此相对于单独使用相同的促性腺素，减少为产生相同生理反应或甚至更好反应所需要注射的促性腺素的剂量和注射次数。

[0092] 本发明的配体或配体-促性腺素复合物可以在体外用于分析对处于其靶受体水平的所述促性腺素的生物活性的激发。它们可以用作研究工具以便研究由针对以下情况的强化现象所引起的变化：靶受体的信号传导途径活化、这些受体的内化和它们的脱敏。

[0093] 它们也可以在体内特别用作医药产品，用于增加LH的生物活性，或在配体源自抗体B6和D3情况下，用于增加LH和FSH二者的生物活性。

[0094] 为此目的，将它们用于放大待治疗的受试者中的LH活性或内源LH和FSH活性，或用于放大外源LH或FSH的活性。在第一种情况下，配体-内源促性腺素复合物在待治疗的受试者中注射配体后形成，所述抗体发挥非激素替代物的作用。在第二种情况下，配体发挥所注射促性腺素的增效剂的作用；促性腺素和配体可以在施用之前事先混合以形成配体-促性腺素复合物，或分别施用。

[0095] 本发明的配体或配体-促性腺素复合物可以尤其用于：

[0096] -在雌性哺乳动物中诱导排卵。它们的施用可以特别使得以下成为可能：模拟LH分泌高峰和(如果需要)FSH分泌高峰，这通常在前排卵期出现，并且因此引发排卵；

[0097] -用于治疗因低LH和FSH循环水平产生的病理状态，例如因垂体功能低下产生的病症；

[0098] -用于治疗其中性腺对LH和FSH感受性低下的雄性或雌性受试者。

[0099] 本发明的配体或配体-促性腺素复合物可以用于人类中或用于各种哺乳动物中，特别是家畜(例如羊、牛、山羊、猪、马)或宠物(例如犬或猫)。

[0100] 本发明的配体或配体-促性腺素复合物将优选地通过注射施用，所述注射可以同等地是肌内、静脉内、腹内、皮内、眶内或皮下注射，而不改变该配体的增效作用。

[0101] 本发明将从本说明书的下文给出的其余部分更好地理解，所述其余部分指示本发明LH配体的制备和用途的非限制性实施例。

[0102] 实施例1：体外测量MAb的增效作用和激动性gMAb的表征

[0103] 通过对LH活性特异的体外生物测定法测量杂交瘤CNCM I-4333、I-4332和I-4334分泌的单克隆抗体(MAb)的增效作用，所述体外生物测定法用稳定表达LH受体的MLTC细胞系进行。测量的反应是在37°C用单独LH或与杂交瘤上清液事先孵育的LH刺激3小时后的cAMP分泌。

[0104] 另外，通过体外生物测定法测量对FSH活性的激动作用，所述体外生物测定法用稳定表达FSH受体的LTK细胞系(小鼠成纤维细胞系)或在悬浮的牛粒层细胞上进行。测量的反应是在37°C用单独或与杂交瘤上清液事先孵育的FSH刺激3小时后的cAMP分泌。

[0105] 通过比较在单独激素存在的情况下获得的生物反应和采用与杂交瘤上清液(事先测定其抗LH抗体)事先孵育的激素所获得的生物反应，可以确定后者是否产生激动作用、抑制作用或无作用。

[0106] 图1中提供生物测定法的结果。

[0107] 在3种杂交瘤中，一种(I-4332)是严格增强oLH活性的抗体(1A6-C4-G11)的分泌物，对于点5ng/mL激素，这种激动作用是700%至1300%。特别地，其他两个杂交瘤是激动oLH活性和oFSH活性的抗体(9A4-A7-D3和9A4-D4-B6)的分泌物，对于点6.2ng/ml、12.5ng/ml和25ng/ml激素，这种激动作用是150%。这些3抗体均为同种型IgM。

[0108] 如下方法测定抗体9A4A7D3、1A6C4G11和9A4D4B6的重链和轻链的可变区的核苷9
酸序列。使用试剂 (EUROBIO，France)，遵循制造商推荐的操作方案从提取10个杂交瘤细胞提取总RNA。随后分离所述RNA，并且使用在260/280nm分光光度法以便确定样品的RNA浓度。使用RT-PCR(“逆转录-聚合酶锁反应”)技术，从每条RNA链获得DNA的互补序列。反应混合物由2μg/ml的4μl RNA、100ng/μl的添加的20μl寡聚dT和
38.2μl MilliQ水组成。在70°C加热样品5分钟后，添加20μl缓冲液5X和10μl dNTP。
向这个体积补充2μl逆转录酶和3.2μl RNA酶，并且将管留在42°C保持1小时。使用的反应混合物由25mM的2μl MgCl2、2.5mM的8μl四种dNTP、约1U Taq 和5μl反应缓冲液10X组成。随后添加两条“有义”和“反义”引物(1.5μl)以及cDNA(3μl)并且随后用MilliQ水补足终体积至50μl。将9对引物用于扩增VL并将两种引物用于VH。它们的序列由Peter等人(The Journal of Biological Chemistry,278,36740-36747,2003)和由Mousli M.等人(FEBS Letters442:183-188,1999)描述。

[0109] PCR循环的次数是30，每个循环包括在90°C1分钟，在47°C1分钟并且随后在72°C3分钟。

[0110] 将PCR产物通过在溴化乙啶染色的2%琼脂糖凝胶上电泳分析，用“QIA快速PCR纯化试剂盒(QIAGEN，荷兰)纯化并测序。使用Multalin软件(F.Corpet,Nucl.Acids Res.,16(22),10881-10890,1988)进行所获得的VH和VL序列的多重比对。

[0111] 借助IMGT/V-QUEST数据库从以上重链和轻链的寡核苷酸序列推导出抗体9A4A7D3、1A6C4G11和9A4D4B6的可变区的高变环CDR1、CDR2和CDR3d的氨基酸序列。参考数据库FR-IMGT和CDR-IMGT(IMGT/3D结构-DB；KaasQ等人,Nucleic Acid Research,32:208-210,2004)，进行可变区的框架区和CDR的比对和界定。

[0112] 实施例2：在大鼠中体内测量MAb激动作用

[0113] 通过体外培养产生10mg来自实施例1的每种单克隆抗体。在纯化和浓缩后，体内测试它们。

[0114] 选择大鼠模型，原因在于它是由药典用以测量促性腺素活性的国际参比。

[0115] 由于获得的抗-oLH抗体不与大鼠LH交叉反应，因此将人外源激素hCG用于测试这些抗体的激动作用。激素hCG由于被抗oLH抗体良好识别并且提供具有严格LH活性的优点。另外，它是以十分纯的形式轻易地商业可获得的并且价廉。

[0116] 使用由药典中用于测定LH活性的两种参比生物测定法：一种在雄性动物中(Scobey MJ等人,2005,Reprod.Biol.Endocr.3:61)和另一种在雌性动物中(Parlow A F,1958,Fed.Proc.17:402)。

[0117] 在雌性动物中的测定法是实施例3的主题。

[0118] 在雄性动物中，相对于精囊重量的增加，对LH或hCG的生物活性定量。25日龄的年轻大鼠用单独(1.5IU)或与所述抗体事先孵育过的激素注射，每日1次，持续4日，并且随后在第5日处死以测量精囊的重量。这种重量与LH活性成正比变动，精囊发育十分依赖于雄激素。

[0119] 图2显示通过观察以下大鼠的精囊的大小，测定由激动性抗体B6对hCG的生物活性产生的激动作用：用生理盐水溶液处理的对照大鼠、用1.5IU hCG处理的大鼠和用与2μg抗体B6预孵育的1.5IU hCG处理的大鼠。

[0120] 图3显示MAb B6、D3和G11对精囊重量增加的激动作用。这些结果用多批次8只小鼠获得并且每个实验重复二次。在用hCG/MAb复合物处理的大鼠中，相对于单用激素处理的大鼠的精囊重量，精囊的重量加倍。用GraphPad Prism软件(GraphPad PRISM Software；GraphPad，SanDiego，CA)通过单因素方差分析并且通过Bonferroni检验(“Bonferroni's多重比较检验”)进行统计分析。这显示，对于3种MAb(B6、D3、G11)，在通过注射用hCG1.5IU+MAb以0.2μg或2μg处理的批次中所获得的精囊的重量在统计上与用单独hCG处理的批次统计极为不同(p<0.001)。单独用抗体处理或用同种型对照抗体(正常IgM)处理的大鼠具有与对照大鼠相等的精囊重量，这表明单独的抗体不具有效果。

[0121] 这种激动作用用非常低剂量的抗体获得。从剂量0.5ng MAb开始，在用hCG+MAb G11复合物处理的大鼠中观察到精囊重量的增加。在0.5ng和1ngMAb G11的剂量时，重量的增加显示激动趋势，但是它不明显。从注射剂量hCG1.5IU+MAb10ng开始，复合物的激动作用变得十分显著(p<0.001)。应当指出，用剂量hCG1.5IU+10ng-0.1μg-0.2μg或2μg MAb G11分别获得的重量彼此不是统计差异的。另外，它们不同于用单独6IU hCG处理的大鼠中所获得的精囊重量。这意味着，复合物10ng MAb G11+hCG1.5IU能够诱导与单独的6IU hCG相同的刺激水平：其激动作用使得将单一激素的作用放大4倍成为可能。这种作用几乎从10ng MAb一开始就是最大，反映这种MAb十分强的灵敏度和功效。用MAb B6和D3获得相同结果(未显示)。

[0122] 通过称量动物睾丸和附睾和通过性腺的组织学检查验证用所述复合物处理后不存在副作用。性腺完全正常并且在睾丸和附睾的重量方面不存在反常。

[0123] 实施例3：在雌性大鼠中体内测量MAb激动作用

[0124] 在雌性大鼠中，根据Parlow测定法(1958，上文引用)，从卵巢中存在的抗坏血酸的水平下降对LH的生物活性定量。在D0用hCG预处理并且在D2用eCG预处理以使卵巢黄体化后，将雌性大鼠在D8用单独的hCG或用事先与抗体孵育的hCG处理。

[0125] 图4显示在雌性大鼠中通过MAb B6产生的激动作用。用GraphPad Prism软件(GraphPad PRISM Software；GraphPad，SanDiego，CA)通过单因素方差分析并且通过Bonferroni检验(Bonferroni's多重比较检验)进行统计分析。在用复合物hCG1.5IU+B62μg(p<0.01)或0.2μg(p<0.05)和单独hCG6IU(p<0.001)处理的大鼠的卵巢中观察到抗坏血酸水平显著下降。获得的结果显示，复合物hCG1.5IU+抗体导致的抗坏血酸水平下降，等同于单独注射6IU hCG的剂量。这种复合物的作用因此等同于4倍更高剂量的hCG。

[0126] 用其他两种MAb获得相同类型的结果(结果未显示)。当单独注射时，MAb均不产生作用。

[0127] 总之，实施例2和3中的结果表明，激素/抗体复合物在体内十分明晰地产生的激动作用，导致靶器官中放大的类固醇生成反应。它们因此毫无疑问地证明，激动促性腺素活性的概念均体内适用于雄性大鼠中和雌性大鼠中。

[0128] 实施例4：scFv片段的构建

[0129] 基于抗体B6的序列制备scFv B6的合成基因，同时存在两个修改的氨基酸：重链的框架1的氨基酸1(QVQ替代EVQ)和轻链的框架1的氨基酸3(DIQ替代DIV)。将这种合成基因插入质粒pcr4-TOPO中并且这种合成基因在其2个末端含有限制性位点NcoI和XhoI。

[0130] 图5A中示意性显示这种合成基因。为在大肠杆菌中表达scFv而优化密码子。如此设计该基因的序列，从而能够获得由肽接头连接的VH结构域和VL结构域。所述肽接头由甘氨酸和丝氨酸残基组成以赋予这种肽接头灵活性和蛋白酶抗性(Bird等人,Science，242(4877):423-426,1988)。当这种接头大于12个氨基酸时，可变域以其原始构象合并以形成抗原结合位点(Whitlow等人,Protein Eng.,7(8):1017-1026,1994)。在构建体的3'末端，存在编码14残基肽的序列。这种在重组蛋白的C端上融合的旗帜肽MRC-OX74促进其检测(Cyster等人,European Journal of Immunology,22(10):2565-2572，1992)。

[0131] 在合成基因末端的两个限制性位点NcoI和XhoI允许其插入到质粒pSW1中(图5B)。

[0132] 质粒pSW1用于构建和表达编码重组抗体片段的基因。该质粒含有在LacZ诱导型启动子控制下的信号序列pelB，其中与已经形成的合成基因相对应的序列与所述信号序列符合可读框地融合。信号序列pelB将允许scFv在周质中寻址。质粒也含有核糖体结合位点(RBS)和氨苄青霉素耐药基因(Amp+)。

[0133] 在供应商推荐的缓冲液中使用每6μl质粒0.5μl核酸内切酶PstI和XhoI(Promega，USA)在37°C持续1.5小时，从pCR4-TOPO切下合成基因。对质粒pSW1进行相同的消化。随后通过琼脂糖凝胶电泳在溴化乙啶存在的情况下分析获得的产物。

[0134] 将目的条带分离并从琼脂糖凝胶纯化，并且在添加2ul洗脱物的情况下通过在1%琼脂糖凝胶上电泳验证插入物或已消化载体的存在及其它们的浓度。

[0135] 通过将插入物B6与质粒pSW1连接，获得载体pSW1-scFvB6。为此目的，在10μl反应体积中，将插入物(2μg)与经切割并去磷酸化的6μg质粒在连接溶液中孵育，向所述连接溶液中添加1.5μl水和0.5μl T4DNA连接酶(PROMEGA，USA)。平行地，在无插入物情况下设置控制。将整个反应在15°C保持14小时并且随后在4°C保持4小时。

[0136] 将大肠杆菌菌株HB2151用于细菌转化。从连接产物或从已经纯化的质粒常规地实施细菌转化。使用1M氯化钙以化学方式使大肠杆菌HB2151菌株具有感受态。使质粒或连接产物(2μl)在4°C与200μl这些细菌接触30分钟。接下来，将细菌在42°C的浴中进行90秒热休克。立即将细菌放回冰中2分钟以便插入质粒。将每份转化物在800μl LB(LuriaBertani)培养基中稀释并且在37°C孵育45分钟伴以转动搅拌(200转/分钟)以允许氨苄青霉素耐药基因的表达。在插入质粒后，细菌再密封其细胞壁并表达氨苄青霉素耐药基因。随后将它们铺展在含有固体培养基的培养皿上并在37°C孵育过夜。随后分析形成的菌落。

[0137] 在转化后，在由琼脂组成的固体培养基上在氨苄青霉素存在的情况下选择阳性克隆。培养选定的细菌以便从中提取重组质粒。为验证插入物的存在，将质粒DNA用如用于克隆的那些限制性酶相同的限制性酶消化。消化产物在1%琼脂糖凝胶上的迁移揭示出2个克隆拥有插入物(称作26和27)。对这两个克隆测序以便验证序列的可读框相合并且插入物没发生任何突变。

[0138] 细菌培养物

[0139] 将阳性大肠杆菌细菌在需氧条件下在37°C培养，或者在液体培养基中伴以搅拌(200转/分钟)时或在固体培养基中培养。LB培养基在高压釜中灭菌，并且为了获得固体培养基，每升LB添加15g琼脂。用于选择重组细菌的抗生素是氨苄青霉素。以每升100μg的浓度添加它。将大肠杆菌菌株在4°C贮存在固体培养基中，最长时间4周。为了更长期地储存，可以将细菌菌株在-80°C贮存在含有15%(v/v)无菌甘油的LB中。可以通过测量8
在600nm的吸收估计细菌在液体培养基中的密度：在600nm处的1单位OD=8x10个细菌。

[0140] 细菌诱导

[0141] 当培养物处于光密度高于1.2的稳定生长期时通过添加IPTG(异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷)，用LB培养基进行细菌诱导。预培养物始于前一日含有氨苄青霉素的LB培养基中的目的细菌菌落。次日，通过以1:1000比例添加预培养物接种较大体积(500ml)的培养物。当培养物达到高于0.6的OD时，用0.84mM IPTG实施诱导。将培养物在17°C伴以搅拌(130转/分钟)时孵育16小时。

[0142] 在表达重组蛋白16小时后，通过受控渗透休克分离周质蛋白。在SDS-PAGE凝胶上并且随后通过蛋白质印迹法在变性条件下验证scFv的良好产生。这个试验足够灵敏用于展示重组蛋白的良好产生和在细菌周质中的输出。

[0143] 图6显示蛋白质印迹分析大肠杆菌表达scFv B6的结果。泳道1和2对应于不产生scFv B6的表达系统(大肠杆菌BL21菌株中的pHEN质粒)。泳道3和4分别对应于表达scFv B6的克隆26和27。泳道M：以kDa计的分子量标记。观察到存在分子量约28kDa的单一条带。

[0144] 来自这个28kDa条带的蛋白质在免疫印迹法中被抗OX74抗体识别并且因此显示产生的蛋白质对应于scFv B6。

[0145] scFv的提取

[0146] 全部提取和透析步骤均在4°C实施。为了从细菌周质提取重组蛋白，将培养物以5000转/分钟离心20分钟。为了破坏外膜，使细菌沉淀溶解于体积与1:50细菌培养物体积相对应的TES(Tris-HCl30mM，EDTA1mM，蔗糖20%，pH8.5)中。将样品留在冰上15分钟并以规则间距涡旋混合。使用相同裂解缓冲液稀释至1/4并且这次代表1:33.33体积培养物，将这个步骤重复第二次。以10000转/分钟离心30分钟后，将周质针对5升PBS(NaCl0.14M，KCl13mM，KH2PO49mM，Na2HPO450mM，pH7.4)透析过夜，伴随搅拌。

[0147] scFv B6的纯化

[0148] 按照供应商提供的操作方案，将羧基-Adem珠试剂盒(Ademtech，法国)用于从周质蛋白制备物纯化scFv B6。这个试剂盒中使用的磁珠的羧基被激活，因此使得与抗OX74抗体产生肽键成为可能。随后将周质在37°C与这种制备物孵育3小时，因存在OX74flag肽，scFv B6被固定的抗体识别。滞留的蛋白质用pH2.0的0.1M甘氨酸溶液洗脱。收集1-ml级分并且通过添加50μl1M Tris立即调节pH至值7.5。将在280nm处吸光度高于
0.1的洗脱的级分合并并且随后针对PBS缓冲液透析过夜，并且然后在 浓缩器(MILLIPORE，Ireland)上浓缩。

[0149] 在所附序列表中以编号SEQ ID NO:28显示scFv片段B6的肽序列。这个序列SEQ ID NO:28不包括flag肽MRC-OX74。

[0150] 可以通过直接诱变修饰编码scFv B6的基因序列，以便在肽序列中SEQ ID NO:28的位置145上获得脯氨酸残基(P)替代苏氨酸残基(T)。这种突变赋予scFv以下特性：它可以由蛋白质L识别并且可以因此在蛋白质L上通过亲和层析纯化。

[0151] 蛋白质分析

[0152] 在这项研究中，将SDS-PAGE技术用于表征scFv在细菌周质中的存在。相对于目的蛋白的大小选择丙烯酰胺凝胶(12%)的浓度(Sambrook等人,1989，上文引用)。在沉积之前，将样品在上样缓冲液(Tris-HCL100mM,pH6.8,SDS4%,β-巯基乙醇1%，溴酚蓝0.2%，甘油20%)中稀释并在95°C变性5分钟。在电泳缓冲液中以60V在浓缩胶中实施蛋白质的迁移并且随后当蛋白质穿透进入分离胶时在150V实施蛋白质的迁移。凝胶随后在考马斯蓝溶液(考马斯蓝0.25%(w/v)，甲醇50%(v/v)，乙酸10%(v/v))中孵育至少30分钟，伴随搅拌。通过在漂洗溶液(乙醇25%(v/v)，乙酸7%(v/v))中连续洗涤去除过多染色。凝胶上存在的蓝色条带对应于在样品中所含的蛋白质。通过电泳分离的蛋白质在与凝胶接触的硝酸纤维素膜上被动转移过夜。整体由转移缓冲液(Tris25mM pH8.3，甘氨酸129mM，SDS0.01%(w/v)，甲醇20%(v/v))中浸透的几个厚度的Whatman滤纸包裹。

[0153] 在转移结束时，硝酸纤维素膜的自由位点在室温在含有5%(w/v)脱脂乳的转移缓冲溶液中饱和1小时。该膜随后与含有抗OX74抗体的培养基上清液孵育1小时，其中所述抗体对添加在scFv C-末端的肽有特异性。在转移缓冲液中洗涤3次后，将膜与含有第二抗体(磷酸酶偶联的小鼠抗IgG抗体)的溶液孵育1小时。最后，将膜洗涤3次，并且通过用显色缓冲液中稀释一倍的偶联于碱性磷酸酶的底物(BCIP/NBT，溴氯吲哚基磷酸酯/硝基四氮唑蓝))一起孵育几秒显色。

[0154] 相对于LH的scFv特异性分析并通过ELISA定量

[0155] 通过ELISA测量scFv相对于oLH的特异性。为此目的，测试克隆26/27的周质和没有识别oLH的分子的对照周质。

[0156] 为实施ELISA测定，在37°C下在平板(Nunc Immuno Plate)每孔中放置100μl1μg/ml的oLH溶液(稀释于0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液，pH9.6)持续1小时并且随后在4°C过夜。残余位点用饱和溶液(100μl PBS-Tween0.1%-BSA1%的溶液)在
37°C封闭45分钟。以每孔100μl的比率一式两份放置周质的不同稀释物，并将平板在
37°C孵育1小时。用PBS-Tween0.1%洗涤5次后，通过添加100μl由培养上清液组成的溶液放置scFv B6的第一抗体，所述溶液含有在PBS缓冲液-Tween0.01%-BSA0.01%中稀释三倍的抗OX74抗体。这种抗体由过氧化物酶偶联的小鼠IgG识别，所述小鼠IgG在与第一抗体相同的缓冲液中稀释2500倍；每孔添加100μl。再洗涤平板5次后，将平板在
37°C保持1小时。随后添加100μL过氧化物酶生色底物TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺，Kirkegaard&Perry Laboratories Inc.,USA)至每个孔。孵育25至30分钟后，反应用
100μL硫酸(1M H2SO4)终止。在450nm用微量平板读数仪分光光度计测量溶液的吸光度。

[0157] 与对照相反，用重组蛋白获得阳性比色信号：scFv确实识别oLH。

[0158] 通过定量性ELISA测定法测量周质的浓度。每孔放置100μL标准第一抗oLH抗体(10、5、1、0.5、0.1、0.05、0.025μg/ml)，其中每孔已经事先以1μg/mloLH吸附。在孵育过氧化物酶偶联的第二抗体并并用TMB显色后，在450nmm读取吸光度获得标准范围，以便估计稀释2倍至8倍的所测试的不同周质稀释物中的scFv浓度。

[0159] 因此估计克隆26/27的周质浓度为34μg/μl。

[0160] 为了增加这种浓度并去除细菌蛋白，从连接于Ademtech珠的抗OX74抗体开始纯化scFv。将两个洗脱级分合并成单一样品，并且在4°C透析过夜后，通过测量280nm吸光度估计它们的浓度。下表V中给出浓度测量值。基于几种稀释物在280nm测量的吸光度可以估计溶液的scFv浓度为0.84mg/ml。

[0161] 表V：

[0162]OD1 OD，1/10th OD，1/20th 平均OD 蛋白质的估计量
1.211 0.106 0.068 1.21 0.84mg/ml

[0163] 实施例5：研究scFv对体外oLH生物活性的激动作用

[0164] 针对oLH和激素HCG(其从活性观点看为同源)的生物活性，表征SCFV的激动作用。为此目的，在体外对MLTC细胞并且在体内在大鼠中实施生物测定法(实施例6)。对稳定表达LH受体并且用LH或hCG刺激时分泌cAMP和孕酮(P4)的MLTC细胞(小鼠Leydig肿瘤细胞)实施体外试验。

[0165] 测量的反应是在37°C用单独或与周质或纯化scFv事先孵育的渐增范围的LH刺激3小时后的cAMP分泌。cAMP的产生提供以下证据：偶联受刺激型蛋白G激动的LH受体并且因此借助G/腺苷酸环化酶/PKA(cAMP依赖性蛋白激酶)/cAMP途径的信号转导。该反应以每100000个细胞分泌的皮摩尔cAMP为单位表述。比较在单独激素存在的情况下获得的生物反应和与上清液事先孵育的激素所获得的生物反应，测量后者是否产生激动作用或无作用。

[0166] 根据Martinat等人(Martinat等人,Reprod Nutr Dev.,45(1):101-8,2005)描述的方法，在RPMI1640培养基(添加有L-谷氨酰胺和Hepes25mM)(Gibco，USA)中培养MLTC细胞，所述培养基补充有10%FBS(胎牛血清)、0.1%庆大霉素和青霉素和链霉素混合物。在50%汇合度时，将细胞用胰蛋白酶消化并且随后以每孔(300μl)100000个细胞的比率在24孔平板中接种并且留在温箱中过夜。次日将细胞在37°C，5%CO2戒断2小时，在每个孔中
200μl戒断培养基替换所述培养基。戒断培养基与生长培养基相同，但是它不具有FBS并含有240μM IBMX(异丙基甲基黄嘌呤)，后者是磷酸二酯酶的抑制剂。IBMX阻止cAMP在刺激间降解，导致其积累，从而允许正确评价激动剂的功效。平行地，以110μl体积制备一系列oLH(0、5、10和20(ng/mL终浓度)以及不同浓度待测试的scFv(0.1和1μg/ml)并且在37°C预孵育1小时。在戒断后，将MLTC细胞用50μl各种混合物(与LH复合或不复合的scFv)刺激并且置于温箱中2小时。对两个培养孔一式两份测试单独LH或各种复合物的每个刺激点。随后在玻璃管中回收上清液，并且使用ELISA试剂盒，根据供应商的说明书(Biomedical Technologies,Inc.,Stoughton,USA)测量刺激后分泌的cAMP。

[0167] 平行地，也测试纯化的IgM B6以观察用scFv观察到的激动作用是否大于或小于用完整B6抗体获得的激动作用。

[0168] 图7显示用一系列与纯化并以0.1μg/ml浓度测试的scFv或IgM预孵育的oLH刺激所获得的结果。纯化的scFv的激动作用低且不显著，与IgM B6不同(p<0.01)。可以见到，没有oLH一起孵育时，单独的scFv和单独的IgM均不影响细胞反应(曲线的零点)。

[0169] 图8显示用一系列与周质或IgM以1μg/ml浓度预孵育的oLH刺激所获得的结果。可以见到，纯化的scFv的激动作用十分接近于IgM并且是显著的(p<0.05)。单独的周质不影响反应(曲线的零点)。

[0170] 实施例6：在大鼠中研究scFv对oLH生物活性的体内激动作用

[0171] 目的是验证在体外观察到的scFv对oLH生物活性调节作用的影响也可以在体内对hCG(LH类似物)的生物活性上观察到。为评价scFv B6的激动作用，使用药典使用的参比生物测定法，所述参比生物测定法在雄性大鼠中确定LH或hCG的生物活性(Scobey等人,2005，上文引用)。在这种生物测定法中，利用精囊重量的增加，对LH或hCG的生物活性定量，其中精囊的发育极度依赖雄激素。因为羊LH的成本极高，所以这些生物测定法用hCG进行，所述hCG以纯形式轻易可获得并且价廉。实际上，hCG具有严格的LH活性并且被激动性抗体B6很好识别。它被视作LH类似物。

[0172] 操作方案用25日龄大鼠实施，其中将所述大鼠用单独或与scFv或抗体B6事先孵育过的激素注射，每日1次，持续4日，并且随后在第5日处死以测量精囊的重量。精囊重量改变与hCG活性成正比。在一批4只大鼠上测试每种条件并且在两个独立实验中重复。

[0173] 将scFv样品和IgM B6样品在生理盐水溶液中以几个浓度制备。在先前实验中，当IgM以2.5nM浓度或2μg注射时，hCG/IgM B6复合物显示最大效果。IgM五聚体的分子量是750kDa，而scFv的分子量估计为25kDa。为比较IgM和scFv的激动作用，也以2.5nM浓度或0.06μg测试scFv，从而保持等摩尔条件。scFv也按照与IgM相同的量或每次注射2μg测试。

[0174] 这些样品在37°C与1.5IU hCG预孵育或不与之孵育1小时。每只大鼠每次注射接受100μl混合物。在第五日，将大鼠称重并且随后处死。取出它们的精囊并称重。精囊重量以mg/100克体重表述，从而能够比较用不同实验批次所获得的结果。

[0175] 图9显示复合物scFv/hCG和IgM/hCG对精囊重量(n=1)的影响。当scFv以2μg单独注射时，它不产生任何作用：平均精囊重量处于与接受生理盐水溶液注射的对照批次相同的水平。当scFv/hCG复合物以浓度2μg和0.06μg测试时，它导致精囊重量相对于注射单独激素时大幅度增加(250%)。2μg的scFv的激动作用达到与按照相同量注射的IgM B6的水平相当。然而，当scFv以等摩尔条件测试(0.06μg)时，其激动作用大于完整抗体。

[0176] 图10显示复合物scFv/hCG复合物对精囊大小的影响。当scFv(0.2μg和0.06μg)作为与hCG的复合物注射时，它引起精囊大小增加。

[0177] 实施例7：MAb B6和D3以及SCFV B6对雌性大鼠中oFSH和hFSH的活性的激动作用

[0178] 为了验证体外LTK细胞上观察到的单克隆抗体B6和D3对FSH激动作用(实施例1)的确与体内观察到的FSH激动作用相关，在雌性大鼠中测试它们对羊FSH和人FSH生物活性的激动作用。

[0179] 用于测量FSH生物活性的操作方案是由Steelman和Pohley(Steelman SL,Pohley FM.Endocrinology,53:604-616，1953)描述的生物测定法，所述生物测定法由药典作为参比操作方案。

[0180] 不成熟的21日龄雌性大鼠接受100μl hCG和FSH的混合物注射2次(早晨和晚上)，持续连续3日。注射以皮下方式进行并且包含恒定量的hCG(3.5IU)，同时添加可变量的FSH，范围从0.5至1.5IU人FSH(GonalF，Merck-Serono)或0.5至2μg的羊FSH。为了对测试的MAb的激动作用定量，将其他雌性大鼠用添加有2μg纯化抗体的相同混合物处理，所述混合物事先已经在37°C孵育20分钟。

[0181] 在第4日，将大鼠安乐死，称重，并且将它们的卵巢摘下并且随后称重。结果以毫克卵巢/100克体重表示。卵巢重量的增加与注射的FSH量成正比，这使得定量所注射FSH的生物活性以及MAb对这种生物活性的激动作用成为可能。

[0182] 对人FSH(GonalF，重组激素，Merck-Serono)评价它们的作用，其中所述人FSH用于辅助受孕治疗的情况下在女性中刺激排卵(MAP)。由于其高纯度和可获得性而选择这种激素。实际上，已经显示MAb B6和D3在体外在LTK细胞上对oFSH产生激动作用(实施例1)。相反，MAb G11在体外在相同的细胞上对oFSH不产生激动作用。

[0183] 在这个实施例中，MAb B6和D3以完整抗体形式以及对于B6以scFv形式(scFv B6)测试。

[0184] 作为严格LH激动作用的对照，也研究了G11完整抗体。

[0185] 如图11中所示，同不与所述MAb预孵育情况下注射的混合物hCG+hFSH的作用相比，用B6、D3和scFv B6获得十分显著的激动作用(p<0.001)。这些结果是两个独立实验的累积作用，并且在对于每个批次的8只动物上实施。用GraphPad Prism软件(GraphPad PRISM Software；GraphPad，SanDiego，CA)通过单因素方差分析并且通过Bonferroni检验(Bonferroni's多重比较检验)进行统计分析。

[0186] 然而，随混合物hCG+hFSH一起注射时，G11不具有显著的激动作用，这与其严格的LH激动作用良好相关。

[0187] 在以上实验中，由于雌性大鼠已经用hCG和FSH的混合物处理，实施“对照实验”以便区别和区分由这些MAb一方面对hCG活性产生的激动作用和另一方面对FSH活性产生的激动作用。实际上，进行由以下组成的两个对照实验：注射：

[0188] (1)单独或与MAb D3预孵育的FSH，或者

[0189] (2)单独或与MAb D3预孵育的hCG。

[0190] 由于MAb D3产生最大FSH激动作用，故选择它用于实施这些实验。使用的FSH是hFSH Gonal F(Serono，Merck)。

[0191] “对照”实验(1)：

[0192] 目的是测量MAb对单独FSH的激动作用。雌性大鼠因此用单独或用与所述MAb预孵育的FSH处理。

[0193] 雌性大鼠用(a)单独或与D3(2μg)预孵育的0.5IU FSH、(b)单独或与D3(2μg)预孵育的1IU FSH或(c)1.5IU单独FSH处理。

[0194] 结果显示在图12中，以伴随相应卵巢照片的简图的形式。来自用FSH+D3处理的批次的卵巢的平均重量显著高于单用激素、尤其以剂量1IU FSH处理的批次，其中用所述复合物记录的卵巢重量加倍。应当强调用批次FSH1IU+D3所观察到的卵巢刺激作用大于用单独注射1.5IU FSH所获得的卵巢刺激作用。

[0195] 比较单用激素或用FSH/D3复合物处理的大鼠中的卵巢平均重量，揭示MAb的明显激动作用，尤其在剂量1IU FSH的情况下。在后一种情形下，大鼠中所获得的卵巢平均重量大于用1.5IU FSH处理的大鼠中所获得的卵巢平均重量(每批次n=5只大鼠)。

[0196] “对照”实验(2)：

[0197] 目的是测量MAb对单独hCG的激动作用。为此目的，根据Steelman和Pooley的注射剂量方案，雌性大鼠用单独或与MAb预孵育的hCG处理。

[0198] 处理的不同批次如下：

[0199] -单独或与D3(2μg)预孵育的3.5IU hCG

[0200] -单独0.5IU hFSH

[0201] -3.5IU hCG+0.5IU hFSH

[0202] -3.5IU hCG+0.5IU hFSH+2μg D3

[0203] 在图13中显示结果。它们显示，来自用hCG+D3处理的批次的卵巢的平均重量大于用单独hCG处理的批次所观察到的卵巢平均重量。因此存在由MAb所致的hCG激动作用，所述激动作用叠加至对FSH产生的激动作用。

[0204] 还应当指出，用混合物MAb+hCG+hFSH所观察到的作用导致大于两种独立作用之总和的卵巢重量增加：因此在两种处理(hCG和FSH)的组合中存在协同效应。

[0205] 总之，用混合物MAb+hCG+hFSH所观察到的作用的确归因于MAb对FSH的激动作用，与其对hCG的激动作用无关。这些“对照实验”也强化MAb D3和B6对FSH生物活性的激动作用的证实。

[0206] 这些结果证实两种MAb(D3和B6)对LH活性和FSH活性产生双重激动作用。

[0207] 实施例8：MAb G11在体内对法兰西岛母羊的激动作用

[0208] 这项研究在年龄全部相同的近青春期的法兰西岛母羊上(Ile de France ewes,pubescent)实施。目的是在所述母羊中体内评价MAb G11对猪LH(pLH)活性的激动作用，其中注射所述猪LH以诱导排卵。在一些处理中使用从猪垂体提取的pLH以在母羊中诱导排卵。为此目的，在撤除海绵后36小时静脉内注射3mgpLH。

[0209] 采用两种操作方案(A和B)。它们的原理是，通过一方面标定排卵时刻并且另一方面放置功能性黄体(反映为黄体期期间孕酮分泌增加)，评价G11对LH活性的激动作用。为此目的，所用的生理参数如下：

[0210] -通过内窥镜观察黄体所诱导的排卵次数和日期，所述内窥镜观察在麻醉下通过腹腔镜检查术进行，

[0211] -通过黄体期期间每日血浆分析，放置和监测孕酮分泌。

[0212] 这些试验在年龄全部相同(1至3岁)的近青春期的法兰西岛母羊上实施。这些雌羊在操作方案之前均已经通过放置用孕激素浸透的阴道海绵(45mg醋酸氟孕酮(FGA)-Intervet-France)14日进行同步化。

[0213] 操作方案A：通过注射前在37°C孵育30分钟的pLH+MAb复合物评价G11的激动作用：

[0214] *放置海绵14日

[0215] *在撤除海绵后36小时肌内注射pLH+MAb复合物

[0216] *在撤除海绵后7和11日之间内窥镜观察

[0217] *在撤除海绵后从第1日至第21日每日采集血液样品用于分析血浆孕酮[0218] 操作方案B：通过依次注射(1)pLH和(2)48小时后注射MAb评价G11的激动作用：

[0219] *放置海绵14日

[0220] *在撤除海绵后36小时静脉注射单独的pLH(3mg)

[0221] *在撤除海绵后72小时或在pLH后48小时肌内注射单独的MAb(2mg)

[0222] *在撤除海绵后11日内窥镜观察

[0223] *在撤除海绵后从第1日至第21日每日采集血液样品用于分析血浆孕酮[0224] 操作方案A的结果：

[0225] 在撤除海绵后36小时，两批次的10只母羊通过肌内途径接受：

[0226] -3mg pLH(采用单独pLH的批次)

[0227] -或注射之前在37°C孵育30分钟的3mg pLH+2mg MAb G11的混合物(采用pLH+MAb G11的批次)

[0228] a-内窥镜分析

[0229] 对每只母羊进行内窥镜分析以便检查排卵是否已经发生和以便通过Cognie J.等人描述的方法(Review Med.Vet.2007,158,8-9,447-451)标定黄体(corpus luteum)或黄体(corpora lutea)的时刻。

[0230] 对于每只母羊，内窥镜分析结果使得在一方面可以精确测定排卵次数(通过计数黄体)并且在另一方面可以相对于海绵撤除评价排卵时刻(通过标定黄体)。

[0231] 在采用单独pLH的批次中，全部母羊均已经排卵并具有正常黄体期。

[0232] 在采用pLH+MAb的批次中，全部母羊均已经排卵。只有一只具有短黄体期(短周期)，黄体早期消退。其他9只具有正常黄体期。这种差异在两个批次之间不显著。

[0233] 下表VI中汇总排卵结果。

[0234] 表VI：

[0235]单独pLH的批次 pLH+MAb G11批次
不排卵的母羊的数目 0 0
具有退行CL和短黄体期的母羊的数目 0 1
已经排卵并具有正常黄体期的母羊的数目 10 9

[0236] 如下表VII中所示，相对于采用单独pLH的批次中3.5日，在采用pLH+MAb G11的批次中，平均排卵时刻是撤除海绵后2.5日。T检验统计分析表明这种差异显著，p<0.1(GraphPad PRISM Software;GraphPad,San Diego,CA)。在两个批次之间，在排卵次数方面没有观察到显著差异。

[0237] 表VII：

[0238]单独pLH的批次 pLH+MAb G11的批次
每只母羊的平均黄体数目 2±0.7 1.7±1.06
平均排卵时刻(撤除海绵后日数) 3.5±1.5 2.5±0.81

[0239] 相对于单独pLH处理，用复合于pLH的MAb处理因此诱导更早的排卵，偏移1日。这种早期引发反映MAb G11对LH活性的激动作用。

[0240] b-性周期期间孕酮分泌(P4)的测量

[0241] 从海绵撤除(D0日)开始并直至第21日每日收集血液样品。根据Canepa S.等人描述的操作方案(Cahiers Techniques INRA,2008,64,19-30)通过ELISA测定孕酮。

[0242] 仅考虑已经正常排卵的母羊；排除具有短黄体期(短循环)的母羊。

[0243] 对于每个批次，将在该循环的每日所测量的孕酮浓度值平均化。从而为了能够平均一只且相同批次的雌羊的P4浓度，将撤除海绵后在D1测量的P4基线值视为每只雌羊的零水平。另外，对一个黄体对应P4的结果：在一只母羊中观察到两个黄体的情况下，对于每个量值，将P4值除以2。图14显示对每个批次所获得的平均曲线。

[0244] 为了比较两条完整曲线，使用(GraphPad PRISM Software;GraphPad,San Diego,CA)通过采用两个变量的方差分析(两因素ANOVA)进行统计分析。显示这两条曲线并无显著差异(p>0.1)，这表示肌内注射的pLH+MAb G11复合物在这个批2X10只母羊中没有诱导显著的作用。然而，观察到提早12至24小时引发P4分泌的趋势，这表明，在采用pLH+MAb G11的批次中的母羊内，黄体比采用单独pLH的批次中的母羊提早约24小时变得有功能(分别是4日对5日)。直至撤除海绵后第8日还观察到这种偏移。

[0245] 在采用pLH+MAb G11的批次中，功能性黄体放置提早的趋势与通过内窥镜观察到的排卵时刻明显提早相关。实际上，对于这两种生理事件，在两种情况下均获得提早24小时，从而支持采用pLH+MAb G11的批次。

[0246] 总之，这些结果表明pLH+MAb G11复合物能够在母羊体内增强LH活性。这种激动作用反映为与单用激素处理的母羊相比，用pLH+MAb G11复合物处理的母羊中显示出统计上更早的排卵和更早诱导受刺激的黄体细胞发生类固醇生成反应的趋势。

[0247] 操作方案B的结果：

[0248] 操作方案B的目的是评价与激素间隔注射并存在时间差的MAb是否也能够在母羊体内对循环的LH产生激动作用。

[0249] 为此目的，处理两个批次的8只母羊，一个批次采用撤除海绵后36小时静脉内(IV)注射的3mg单独pLH，另一个批次采用撤除海绵后36小时给予3mg pLH(静脉内)，接着48小时后通过肌内(IM)途径给予2mg MAb G11。

[0250] a-内窥镜分析

[0251] 对每只母羊进行内窥镜分析以便检查排卵是否已经发生和以便通过Cognie J.等人描述的方法(2007，上文引用)标定黄体(corpus luteum)或黄体(corpora lutea)发生的时刻。

[0252] 对于每只母羊，内窥镜分析结果使得在一方面可以通过计数黄体(CL)精确测定排卵次数并且在另一方面可以通过标定黄体发生的时刻，相对于海绵撤除评价排卵时刻。

[0253] 在采用pLH的批次中，8只雌羊中有5只雌羊正常排卵，并且在采用pLH/MAb的批次中，8只雌羊中有6只雌羊正常排卵。两只母羊排卵但是具有短黄体期。

[0254] 下表VIII中汇总排卵结果。

[0255] 表VIII：

[0256]采用pLH的批次 采用pLH/MAb的批次
不排卵的母羊的数目 1 2
具有退行CL和短黄体期的母羊的数目 2 0
已经排卵并具有正常黄体期的母羊的数目 5 6

[0257] 如下表IX中所示，相对于采用单独pLH批次的3.71日，在采用pLH/MAb G11的批次中，平均排卵时刻是撤除海绵后2.83日。T检验统计分析表明这种差异是在p<0.1显著(GraphPad PRISM Software;GraphPad,San Diego,CA)。在排卵次数方面没有观察到差异。

[0258] 表IX：

[0259]采用pLH的批次 采用pLH/MAb的批次
每只母羊的平均黄体数目 1.14±0.37 1.16±0.4
平均排卵时刻(撤除海绵后日数) 3.71±1.11 2.83±1.16

[0260] b-性周期期间孕酮分泌(P4)的测量

[0261] 从海绵撤除(D0日)开始并直至第21日每日收集血液样品。根据Canepa S.等人描述的操作方案(2008，上文引用)通过ELISA测定孕酮。

[0262] 仅考虑已经正常排卵的母羊；排除具有短黄体期(短循环)的那些母羊。

[0263] 对于每个批次，将在该循环的每日所测量的孕酮浓度值平均化。从而为了能够平均一只且相同批次的雌羊的P4浓度，将撤除海绵后在D1测量的P4基线值视为每只雌羊的零水平。另外，对一个黄体对应P4的结果：在一只母羊中观察到两个黄体的情况下，对于每个测量，将P4值除以2。图15显示对每个批次所获得的平均曲线。

[0264] 将结果编纂并且用GraphPad Prism软件(GraphPad PRISM Software；GraphPad，SanDiego，CA)统计分析。为了比较两条完整曲线，通过采用两个变量的方差分析(两因素ANOVA)进行统计分析。显示两条曲线显著差异(p<0.05)，这表示单独注射的MAb G11对LH活性产生显著激动作用，p<0.05。

[0265] 这种激动作用由相对于采用单独pLH的批次(其中在撤除海绵后5.5日引发分泌)而言，提早24小时引发P4分泌显示(在撤出后平均4.5日)。这些结果表明，在采用pLH/MAb的批次中的母羊内，黄体比采用单独pLH的批次中的母羊提早24小时变得有功能。直至撤除海绵后第9日还清楚地观察这种差异。

[0266] 在采用pLH/MAb G11的批次中，功能性黄体放置提早与通过内窥镜观察到的排卵时刻提早相关。实际上，在两种情况下，在两个批次之间获得约24小时的间隙，每次在用MAb处理的批次中这两种生理事件均提前。

[0267] 综上所述，这些结果表明通过肌内途径单独注射的MAb能够与血液循环中存在的羊LH结合并激动其活性。这种启动作用反映为更快诱导受血浆LH/MAb复合物刺激的黄体细胞的类固醇生成反应。

[0268] 也应当指出，由于pLH的半寿期非常短(在母羊中20分钟)，这种激素在注射MAb时已经被完全消除，所述注射相对于pLH的注射延迟48小时。这意味获得的结果归因于MAb G11对动物内源性LH的激动作用。因此这些结果表明，在大动物中(在本例中为母羊)，单独注射的MAb可以在体内与内源性LH复合并诱导对其作用的激动。

[0269] 实施例9：MAb B6、D3和G11特异性的表征

[0270] 通过ELISA研究这些MAb的特异性。将评价的每种激素在4°C在ELISA平板的孔上在0.1M碳酸钠缓冲液中2μg/ml的浓度，按每孔100μl的比率吸附18小时。

[0271] 在(用PBS-Tween0.1%)洗涤 5次和封 闭步 骤(surcoating step)(100μl PBS-Tween0.1%-BSA1%，在37°C，45分钟)后，将以浓度0.1-1和10μg/ml制备的每种MAb在37°C孵育1小时。

[0272] 洗涤5次后，将第二抗体(过氧化物酶偶联的小鼠抗IgM，Jackson Laboratories)在37°C孵育1小时(100μl/孔)。洗涤5次后，过氧化物酶用TMB(100μl/孔)室温显色30分钟在并且随后用1M H2SO4(50μl/孔)终止。

[0273] 将颜色反应的强度定量(OD)并且它将作为计算每种所测试的激素的交叉反应%的参照物。对于LH和FSH，用参比羊激素测量的OD值视为100%值。交叉反应%的比率是所测试激素的OD与羊激素OD的比值X100。

[0274] 1)与猪源LH和牛源LH并与人绒毛膜促性腺素(hCG)的交叉反应

[0275] 3种MAb以大于或等于oLH的交叉反应%识别猪LH和牛LH，并且也与人激素hCG交叉反应(见下表X)。

[0276] 表X：

[0277]B6 D3 G11
oLH 100% 100% 100%
pLH 168% 170% 140%
bLH 122% 121% 100%
hCG 97% 72% 68%

[0278] 2)与猪源、牛源和人源FSH的交叉反应

[0279] 3种MAb以大于或等于FSH的交叉反应%识别猪FSH、牛FSH和人FSH(见下表XI)。

[0280] 表XI：

[0281]B6 D3 G11
oFSH 100% 100% 100%
pFSH 137% 100% 230%
bFSH 430% 460% 380%
hFSH 100% 100% 113%

[0282] 3种MAb因此具有相似的特异性谱，其特征在于支持猪、牛和人同源激素的广谱识别作用。

[0283] 3)与马绒毛膜促性腺素(eCG)或PMSG的交叉反应

[0284] 以相同方式，对用于羊和山羊中诱导排卵处理的商品eCG(Synchro Part,CEVA,Libourne,France)评价所述抗体。同种型对照(针对与促性腺素十分远缘的另一类型抗原的IgM)。将每种抗体以10μg/ml和1μg/ml的浓度孵育。在下表XII中提供以光密度(OD)单位表述的结果。

[0285] 表XII

[0286]商业eCG的OD B6 D3 G11 对照抗体
10μg/ml的抗体 0.088 0.091 0.09 0.09
1μg/ml的抗体 0.078 0.102 0.088 0.09

[0287] 没有观察到与商业eCG的交叉反应：无论采用特异性抗体或采用同种型对照时，OD值均相同。

[0288] 在纯化eCG(6000IU/mg)上评价该抗体时，获得相同的结果。

[0289] 实施例10:MAb B6、D3和G11的框架的多态性

[0290] 对于其轻链和重链而言，3种MAb B6、D3和G11具有相同的CDR1、CDR2和CDR3序列。

[0291] 另外，它们的VH和VL链的框架FR2、FR3和FR4的序列相同。

[0292] 仅VH和VL的FR1序列根据MAb变动。

[0293] 1)轻链(VL)的FR1：

[0294] 在轻链FR1的4位和7位的残基观察到多态性(见下表XIII)。

[0295] 表XIII：

[0296]FR1(VL的氨基酸1至10)
B6 DIVMTQATSS(SEQ ID NO:20)
D3 ---KTQTTSS(SEQ ID NO:22)
G11 DIQMTQTTSS(SEQ ID NO:18)

[0297] 应当注意，4位为甲硫氨酸(M)(一种带有非极性疏水侧链的氨基酸)或赖氨酸(K)(一种带有带正电荷侧链的氨基酸)。这种多态性引起物理化学性能的巨大变化，原因在于存在或不存在正电荷，但是不构成增强LH及FSH生物活性的两种MAb共有的结构元件。

[0298] 应当注意，7位为丙氨酸(A)(一种具有疏水性非极性链的氨基酸)或苏氨酸(T)(一种具有不带电荷极性链的氨基酸)。在这种情况下，它是氨基酸的物理化学性能相对保守的多态性。再次，这不构成增强LH及FSH生物活性的两种MAb共有的结构元件。

[0299] 因此，在轻链中，FR1的多态性似乎与LH和FSH双重激动作用不相关。

[0300] 2)重链(VH)的FR1：

[0301] 在重链FR1的3位和6位的残基水平上观察到多态性(见下表XIV)。

[0302] 表XIV：

[0303]FR1(VH的氨基酸1至10)
B6 EVQLQQSGAE(SEQ ID NO:21)
D3 EVQLQESGAE(SEQ ID NO:23)
G11 EVKLQQSGAE(SEQ ID NO:19)

[0304] 应当注意到，2位为谷氨酰胺(Q)(一种具有不带电荷极性链的氨基酸)或赖氨酸(K)(一种具有带正电荷侧链的氨基酸)。这次，它是引起该区域的物理化学性能巨大变化的多态性。3位谷氨酰胺的存在似乎对增强LH及FSH生物活性的两种MAb为特异的。

[0305] 应当注意，6位为谷氨酰胺(Q)(一种具有不带电荷极性链的氨基酸)或谷氨酸(E)(一种具有带负电荷侧链的氨基酸)。再次，它是引起物理化学性能巨大变化的多态性，但在这种情况下似乎与LH和FSH双重激动作用不相关。

[0306] 实施例11：抗体D3和scFv B6对受oLH或hCG刺激的MLTC细胞产生孕酮的影响[0307] 将细胞在补充有10%FBS和1%青霉素/链霉素的RPMI1640培养基中培养。在用单独的激素(oLH或hCG)或抗体/激素或scFv/激素复合物刺激之前，使它们戒断1小时。

[0308] 用oLH刺激：

[0309] 用0.5nM单独oLH刺激的MLTC细胞所分泌的孕酮的量与用0.5nM oLH(其与10nM或500nM的完整IgM D3或scFv B6预孵育)刺激的MLTC细胞分泌的孕酮的量比较。图16显示结果。横坐标显示IgM或scFv的浓度(0nM表示以单独oLH刺激)；在纵坐标上，显示在D3/oLH或B6/oLH复合物存在下所分泌的孕酮的量与在单独oLH存在下所分泌的孕酮的量的比率。相对于用单独oLH刺激，在两种浓度下，scFv B6和IgM D3均对MLTC细胞的类固醇生成反应产生显著激动作用(Bonferroni检验，p<0.001)。从10nM浓度IgM D3和
500nM浓度scFv B6开始，这种激动作用最大。

[0310] 用hCG刺激：

[0311] 用恒定浓度0.05nM的hCG实施相同实验。在用0.05nM单独hCG刺激的情况下和在用复合物0.05nM hCG+完整IgM D3或0.05nM hCG+(5nM和37.5nM)scFv B6刺激的情况下，比较分泌的孕酮的量。图17显示结果。横坐标显示IgM或scFv的浓度(0nM表示以单独hCG刺激)；在纵坐标上，显示在DD3/hCG或scFv B6/hCG复合物存在下所分泌的孕酮的量与在单独hCG存在下所分泌的孕酮的量的比率。相对于用单独hCG刺激，在两种浓度下，scFv B6和IgM D3均对MLTC细胞的类固醇生成反应产生显著激动作用(Bonferroni检验，p<0.001)。激动作用在浓度37.5nM IgM D3或scFv B6时最大。

[0312] 实施例12：源自B6B5P0抗体的双链抗体对雌性大鼠中FSH活性的体内激动作用[0313] 利用抗体B6的VH和VL序列构建双链抗体(diabody)(下文命名为B5P0)，所述序列由具有5个氨基酸的接头连接。

[0314] 在所附序列表中分别以编号SEQ ID NO:29和SEQ ID NO:30显示这种双链抗体的核苷酸序列和肽序列。

[0315] 如上文实施例7中所述，在不成熟的雌性大鼠中利用Steelman和Pohley试验，测定抗体B5P0对体内FSH活性的激动作用。

[0316] 图18中显示结果。

[0317] 这些结果显示，事先与0.5IU hFSH孵育的双链抗体B5P0(2μg)产生等同于完整IgM B6(2μg)的激动作用。这种作用在两种情况下导致卵巢重量增加2.1倍，这是高度显著的(p<0.001，Bonferroni检验)。

[0318] 实施例13：svFv B6在体内对母羊中LH活性和FSH活性的激动作用

[0319] a)scFv B6对LH活性的激动作用

[0320] 该研究在3岁近青春期的法兰西岛母羊上实施。与完整IgM G11相比，评价scFv B6对内源LH的活性的激动作用。

[0321] 母羊均已经通过放置用孕激素浸透的阴道海绵(45mg醋酸氟孕酮(FGA)-Intervet-France)14日进行同步化。

[0322] 在撤除海绵后36小时，动物接受静脉内注射3mg pLH。将这些母羊分成3个批次A、B和C：

[0323] *批次A：用单独pLH处理；

[0324] *批次B：用pLH处理并随后用scFv B6处理；

[0325] *批次C：用pLH处理并随后用IgM G11处理。

[0326] 在撤除海绵后72小时，批次B和C中的动物通过肌内途径分别接受2mg纯化的scFv B6或2mg的纯化IgM G11。

[0327] 在撤除海绵后从第1日至第8日每日采集血液样品用于分析血浆孕酮。在撤除海绵后8日，实施内窥镜分析以便计数和标定黄体。

[0328] 表XV中提出内窥镜分析结果。

[0329] 表XV

[0330]处理 黄体数目 黄体的标定
批次A：单独pLH3mg 2.09±3.23 4.06±4.7
批次B：pLH，随后scFv B6P2mg 1.33±0.58 5±0.5
批次C：pLH，随后IgM G112mg 2±0.71 5.2±0.27

[0331] 黄体数目表述为均数±标准偏差。在3个批次中所得到的黄体数目之间不存在显著差异[通过T检验分析(GraphPad PRISM Software；GraphPad，SanDiego，CA)]。黄体的标定表述为排卵后日数(均数±标准偏差)。相对于用单独pLH处理批次的平均4日龄，用IgM G11或scFv B6P处理的批次的平均黄体龄是5日。批次A和批次B和C之间的这种黄体龄差异是显著的(p<0.05)。批次B和C之间不存在显著差异。这些结果意味着，在用pLH处理并且随后用IgM或scFv处理的母羊中，排卵在用单独pLH处理的母羊中所观察到的排卵之前1日发生。scFv B6因此在母羊中产生与完整抗体G11相同的体内激动作用。

[0332] 图19中显示在黄体期开始时的孕酮分泌曲线。

[0333] 对于每个批次，将孕酮浓度值(ng/mL)对每黄体数目归一化。每条曲线代表每个批次中在雌羊中所获得的孕酮均值。通过采用两个变量的方差分析(两因素ANOVA，GraphPad PRISM Software;GraphPad,San Diego,CA)比较P4分泌曲线。这个分析显示平均P4分泌曲线在批次A和批次B及C之间显著差异(p>0.05)并且在批次B和C的曲线之间不存差异。这些结果表明与MAb G11相似，单独注射的scFv B6产生激动作用，表现为比单用pLH处理的批次中更大和更快的孕酮分泌。这个结果通过内窥镜在用pLH处理并随后用scFv B6P或G11处理的母羊中观察到的排卵时刻提早相关。

[0334] 综上所述，这些结果表明scFv B6能够与内源性羊LH结合并在体内激动其活性，与完整MAb G11的功效相同。

[0335] b)scFv B6对FSH活性的激动作用

[0336] 本研究在性静息期(长日)实施并且涉及18只4年龄母羊。在实施操作方案之前，这些雌羊均已经通过放置用孕激素浸透的阴道海绵(45mg醋酸氟孕酮(FGA)-Intervet-France)14日进行同步化。

[0337] 在撤除海绵之前24小时和12小时，母羊接受100μg和随后83μg纯pFSH的肌内注射。

[0338] 将母羊分成两个批次：

[0339] *批次A：用单独pFSH处理

[0340] *批次B：用pFSH处理并随后用scFv B6处理。

[0341] 在批次B中的母羊通过肌内途径接受1mg纯化scFv B6P的3次连续注射：在海绵撤除期间的D0注射第一次，在D1注射第二次，并且在D3注射第三次。

[0342] 在D7：进行内窥镜分析以便计数黄体数目。

[0343] 对于全部雌羊，均通过定量ELISA测定法测量排卵前LH峰值。

[0344] 表XVI显示内窥镜分析结果和LH分析结果。

[0345] 表XVI

[0346]

[0347] 可以见到，在用pFSH处理并且随后用scFv B6P处理的批次中已经排卵的雌羊数目显著更高(3/7对1/7)。批次B也显示显著更高的排卵次数[(p<0.001)，通过T检验分析(GraphPad PRISM Software；GraphPad，SanDiego，CA)]。另外，在采用pFSH随后采用scFv B6P的批次中，已经排卵的3只雌羊在撤除海绵后48小时具有同步化LH峰值，相对于采用单独pFSH的批次，提前了12小时。这种差异是显著的(p<0.005)。

[0348] 这些结果表明，考虑到pFSH的短半寿期(30分钟)，scFv B6P对内源性FSH引起激动作用，反映为更高次数的排卵和十分同步化的LH峰值。