抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体及其应用

摘要

本发明提供一种抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体及其应用，涉及生物技术领域。一种分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3，其保藏号为CCTCCC201383。所述杂交瘤细胞株D3分泌的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体。所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体在制备检测弓形虫的试剂盒、胶体金试纸条中的应用。本发明杂交瘤细胞株D3能够稳定、高效的分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体对弓形虫MIC3蛋白的效价高，特异性好，因此，可以用于制备检测弓形虫的试剂盒和胶体金试纸条。所述单克隆抗体的制备方法简单，抗体纯化过程简单，效率高，成本低。

权利要求

1.一种分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3，其保藏号为CCTCC NO:C201383。

2.一种权利要求1所述杂交瘤细胞株D3分泌的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体。

3.权利要求2所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体在制备检测弓形虫的试剂盒中的应用。

4.权利要求2所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体在制备检测弓形虫的胶体金试纸条中的应用。

5.含有权利要求2所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的检测弓形虫的试剂盒。

6.含有权利要求2所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的胶体金试纸条。

说明书

抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] 弓形虫病是一种呈世界性分布且严重危害人类健康和畜牧业发展的人兽共患寄生虫病。人类可通过食用未煮熟的含有弓形虫包囊的猪肉感染弓形虫病。弓形虫病能够引起孕妇流产、早产、畸胎、死胎等。

[0003] 弓形虫的检测方法有多种。病原学检查，如从体液和组织中镜检虫体、动物接种等，找到虫体可以确诊，但是检出率低，耗时长；血清学检查有染色试验（DT）、酶联免疫吸附试验（ELISA）、间接血凝试验（IHA）、免疫印迹等方法，敏感性高，但是特异性有待提高；基因检查，如DNA探针技术、聚合酶链反应等方法，具有较高的敏感性和特异性，但操作复杂、实验条件要求较高； IgM和IgG检测试剂盒价格昂贵，难以推广应用与流行病学普查。

[0004] 弓形虫微线体蛋白3（MIC3）存在于弓形虫速殖子期、缓殖子期和子孢子期等不同时期的排泄物中, 持续时间长。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3。MIC3蛋白的全称是微线体蛋白3。

[0006] 本发明的另一目的是提供所述杂交瘤细胞株D3分泌的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体，该单克隆抗体效价高、特异性好。

[0007] 本发明提供的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的制备方法简单，抗体纯化过程简单，效率高。

[0008] 一种分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3，其保藏号为CCTCC NO：C201383。

[0009] 一种所述杂交瘤细胞株D3分泌的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体。

[0010] 所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体在制备检测弓形虫的试剂盒中的应用。

[0011] 所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体在制备检测弓形虫的胶体金试纸条中的应用。

[0012] 含有权利要求2所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的检测弓形虫的试剂盒。

[0013] 含有权利要求2所述抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的胶体金试纸条。

[0014] 有益效果：

[0015] 本发明杂交瘤细胞株D3能够稳定、高效的分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体。该单克隆抗体对弓形虫MIC3蛋白的效价高，特异性好，因此，可以用于制备检测弓形虫的试剂盒和胶体金试纸条。本发明提供的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的制备方法简单，抗体纯化过程简单，效率高，成本低。采用本发明提供的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体来检测弓形虫，快速、敏感、特异性高、操作简单而且成本低。

附图说明

[0016] 图1 是重组MIC3蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中1：含空载体BL21菌体的蛋白；2：插入含有MIC3基因重组质粒的BL21未诱导的裂解液上清； 3：插入含有MIC3基因重组质粒的BL21诱导表达后的裂解液上清；4：纯化后的重组MIC3蛋白； M-分子量Mark。

[0017] 图2 是抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的Western blot 分析，其中1：纯化的重组MIC3蛋白；2：含有空载体BL21菌体的蛋白；3：全虫蛋白； M：蛋白质Marker。

[0018] 图3本发明金标试纸敏感性试验结果， 1-6的检测样品为不同浓度的弓形虫悬6 5 4 3
液，其中1-4×10 个虫/mL， 2-4×10 个虫/mL， 3-4×10 个虫/mL， 4-4×10 个虫/mL，
2
5-4×10 个虫/mL，6-PBS。

[0019] 图4 本发明金标试纸特异性检测结果，其中1-弓形虫，2- PBS阴性对照，3-大肠杆菌E. coli O26，4-猪霍乱沙门氏菌，5-猪囊尾蚴，6-华支睾吸虫，7-猪蛔虫。

[0020] 杂交瘤细胞株D3保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC）（地址：中国武汉大学），其保藏号为CCTCC No：C201383，保藏日期为：2013年5月22日，分类命名为杂交瘤细胞株D3。

具体实施方式

[0021] 本发明实施例中使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。

[0022] 弓形虫NT株由本实验室保种。

[0023] BALB/c小鼠购自扬州大学动物实验中心。Sp2/0骨髓瘤细胞和Vero细胞购自中科院上海细胞库。DMEM培养基、HAT、HT、弗氏完全佐剂及不完全佐剂均为Sigma产品；蛋白质分子量标准为TaKaRa产品；鼠单克隆抗体亚类检测试剂盒为SANTA CRUZ公司产品；胎牛血清购自杭州四季清生物工程有限公司；聚乙二醇( PEG4000)购自Roche 公司；辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG（缩写为羊抗小鼠IgG-HRP），辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗猪IgG（缩写为羊抗猪IgG-HRP）、NC膜购自BIO-RAD公司；CO2 培养箱为美国Thermo公司产品；酶标仪为美国BIO-RAD公司生产。氯金酸为上海化学试剂有限公司产品，硝酸纤维素膜 、玻璃纤维垫、吸收垫及背衬等层析材料为Millipore 公司产品，购自上海金标生物科技有限公司；protein G亲和层析纯化柱为 GE公司产品；NANODROP2000核酸蛋白含量测定仪为Thermo公司产品。

[0024] PBS缓冲液： 氯化钠（NaCl）8.0 g，氯化钾（KCl ）0.2 g，磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）2.9 g，磷酸二氢钾（KH2PO4）0.2 g，加去离子水溶解后定容至1,000 mL，用1 M 氢氧化钠（NaOH）调pH值为7.4。

[0025] 包被液：含有0.05 mol/L Na2CO3和0.05 mol/L NaHCO3的水溶液，pH值为9.6。

[0026] 洗涤液：含质量浓度为0.1% Tween-20的PBS缓冲液。

[0027] 封闭液：含有质量百分浓度为1%明胶的洗涤液。

[0028] 显色液：包括A液和B液。A液和B液均需4℃密封、避光保存。使用时每10 mL A液加50 μL B液混匀即用。A液：将1 mL浓度为10 mg/mL的3,3',5,5'-四甲基联苯胺（缩写为TMB，郑州四季化工公司）溶液加入到100 mL 浓度为0.1 mol/L、pH为6.0的磷酸缓冲液中配成。B液：体积浓度为3%的H2O2水溶液。

[0029] 终止液：2mol/L的H2SO4水溶液。

[0030] 饱和硫酸铵溶液：取蒸馏水500ml，加热至80℃，称取400g (NH4）2SO4，搅拌下缓慢加入蒸馏水直到硫酸铵完全溶解，溶液澄清后，置4℃过夜至结晶析出，使用前取上清用氨水将pH调至7.0。

[0031] 浓度为0.06M、pH4.8 的醋酸盐缓冲液：100ml双蒸水中加入0.36ml醋酸，用NaOH调节pH值至4.8。

[0032] 实施例1 抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的制备

[0033] 按照如下方法制备抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体：利用大肠杆菌表达系统制备重组MIC3蛋白；用重组MIC3蛋白为抗原免疫小鼠，制备融合的杂交瘤细胞，通过有限稀释法获得能够稳定分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3。

[0034] 一 制备重组MIC3蛋白

[0035] 1. 构建阳性重组质粒pET-32a(+)-MIC3

[0036] 将序列如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列(南京金斯瑞生物科技有限公司合成)和pET-32a(+)表达载体分别采用限制性内切酶Hind III、SacⅠ双酶切，片段经1.5%琼脂糖凝胶电泳回收后进行连接，连接产物经热冲击法转化入E. coli BL21，经氨苄青霉素LB平板初筛，挑取单菌落于含有氨苄青霉素的LB培养基中，200 r/min振摇37 ℃培养过夜，小量抽提质粒，用HindIII、SacⅠ双酶切及PCR鉴定，南京金斯瑞生物科技有限公司测序鉴定。测序正确的为阳性重组质粒pET-32a(+)-MIC3。

[0037] 2.重组MIC3蛋白的表达和纯化

[0038] 将阳性重组质粒pET-32a(+)-MIC3转化入BL21(DE3)中，诱导表达20h，收集菌体。将菌体超声破碎，于4℃条件下离心取上清液，采用His标签蛋白纯化试剂盒纯化得到可溶性的重组MIC3蛋白，4℃保存备用。重组MIC3蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0039] 同时，将空载体pET-32a(+)转化入BL21(DE3)，诱导表达20h，收集菌体。将菌体超声破碎，于4℃条件下离心取上清液，获得含空载体BL21菌体的蛋白，以备抗体效价及Western-blot分析中作为对照。

[0040] 将重组MIC3蛋白经SDS-PAGE电泳检测，其大小为56KDa左右（如图1所示），与设计的目的条带相符，纯化后且杂蛋白较少，经蛋白含量测定仪得到蛋白的浓度为225μg/ml。

[0041] 二 杂交瘤细胞株D3的制备

[0042] 1. BALB/c小鼠的免疫

[0043] 将重组MIC3蛋白与福氏完全佐剂等体积混合后皮下注射BALB/c小鼠，重组MIC3蛋白的免疫剂量为50μg/只；首免后第2周进行二免，将重组MIC3蛋白与福氏不完全佐剂等体积混合，皮下注射，重组MIC3蛋白的免疫剂量为50μg/只；首免后第4周进行三免，腹腔注射重组MIC3蛋白，50μg/只，10d后采血测定抗体效价，当血清的ELISA抗体效价达到1:8000以上时，静脉注射重组MIC3蛋白，20μg/只，3天后按照常规方法无菌取脾脏以备细胞融合。

[0044] 2. 细胞融合及阳性杂交瘤细胞株的筛选

[0045] 融合前36-48h将SP2/0细胞分瓶扩大培养。融合当天，选择形态良好、呈对数生长的SP2/0细胞，将其从瓶壁上轻轻吹下，收集于离心管内，1000rpm离心5min，然后用DMEM营养液重新悬浮，取少量台盼蓝染色计数，保证细胞成活率大于90%以上，用于融合。

[0046] 按照常规方法制备饲养细胞。

[0047] 按照Naundor的方法【Naundor S , Preithner S , Mayer P , et al . In vitro and in vivo activity of MT201, a fully human monoclonal antibody for pan-carcinona treatment [J]. Int J Cancer, 2002, 100: 101-110.】将脾细胞与SP2/0细胞融合。将脾细胞与SP2/0细胞融合后，用HAT选择性培养液培养，于96孔培养板中37℃在CO2培养箱中培养至长满孔底面积的1/10时，吸取上清液，用重组MIC3蛋白和全虫蛋白分别作为检测原，经间接ELISA法筛选阳性杂交瘤细胞。用有限稀释法对阳性孔进行连续3次亚克隆，至所有单克隆孔均为阳性为止。最终获得能够稳定、高效分泌抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株D3。杂交瘤细胞株D3的培养上清对重组MIC3蛋白的抗体效价为1:2700，对全虫蛋白的抗体效价为1:300，对含空载体BL21菌体蛋白的抗体效价为0。

[0048] 全虫蛋白的制备方法：将液氮冻存的弓形虫速殖子在37℃水浴中溶解复苏，接种Vero细胞，转种3次恢复其活性。第3次转种后待细胞全部破裂释放出速殖子，收集培养液用Percoll密度梯度离心法进行纯化 (王洁琳，贾博寅，王心蕊等.刚地弓形虫速殖子分离纯化方法的优化[J].中国兽医科学,2012,42(05):467-472. )。纯化后的速殖子用1/10原体积的PBS重悬进行超声波破裂，10000rpm/min离心5min后取上清得到弓形虫全虫蛋白。弓形虫全虫蛋白中含有大小为38kDa的天然MIC3蛋白。

[0049] 间接ELISA法的具体过程：

[0050] （1）包被：将重组MIC3蛋白（或全虫蛋白）用包被液稀释至5μg/ml，每孔加100μl，37℃孵育1h，4℃过夜。阴性对照中为5μg/ml的BSA代替重组MIC3蛋白。

[0051] （2）封闭：弃去包被液，用洗涤液洗涤3次，加入封闭液，每孔300μl，37℃封闭2h。

[0052] （3）加待测样品：待测样品以适当起始浓度倍比稀释后加入酶标板，每个孔中加入100μl，每个浓度做3个重复。37℃温育1.5h后，用洗涤液洗涤，拍干。

[0053] （4）加酶标二抗：将羊抗猪IgG-HRP做1:10000稀释，每孔100μl，37℃孵育0.5h。

[0054] （5）加显色液并终止反应：每孔中加入显色液100μl，避光显色5min后每孔加入50μl终止液，在酶标仪上读取OD450值，计算P/N值。

[0055] 待测样品的OD450值≥2.1×阴性对照时，判为阳性。

[0056] 3. 单抗腹水的制备及纯化

[0057] 取12周龄BALB/c小鼠腹腔注射灭菌石蜡油（每只注射0.5ml），10d后每只BALB/6
c小鼠腹腔注射1×10 个生长状态良好的杂交瘤细胞株D3 。7d左右小鼠腹部开始明显膨大，反复抽取腹水，以3000r/min离心10 min除去细胞成分和其他沉淀，收集上清即为抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体粗制品。将所述单克隆抗体粗制品经辛酸-硫酸铵法初步纯化，再用商品化的Protein G亲和层析柱纯化，得到纯化的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体，-70℃保存。

[0058] 辛酸-硫酸铵法：取4ml抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体粗制品加10ml、浓度为0.06M pH4.8 的醋酸盐缓冲液，磁力搅拌器中边搅拌边加入终浓度为11ul/ml的正辛酸，加完后继续搅拌30min，4℃静置2h，10000rpm离心30min，弃沉淀，上清用PBS透析6小时后用NaOH调节PH值7.4，加入等体积的饱和硫酸铵溶液，边加边搅拌，再置4℃静置2h，
10000rpm离心30min，取沉淀用适量PBS溶解，经PBS透析后取出分装，调节蛋白浓度为
2.0mg/ml，-20℃保存备用。

[0059] 4. 单克隆抗体特性鉴定

[0060] 单克隆抗体效价测定：间接ELISA法测定纯化的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的效价，检测抗原分别为重组MIC3蛋白、全虫蛋白和含空载体BL21菌体的蛋白。其中重组MIC3蛋白作为检测抗原时，其包被浓度为2.5μg/ ml。其他步骤同实施例1。具体见表1。从表1中可以看出，纯化的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体对重组MIC3蛋白的效价很高。

[0061] 表1抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体的效价

[0062]抗原 纯化的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体
重组MIC3蛋白 1:1920000
全虫蛋白 1:24000
含空载体BL21菌体的蛋白 0

[0063] 亚型鉴定：按照亚型鉴定试剂盒操作说明，对抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体进行亚型鉴定。结果显示：杂交瘤细胞株D3分泌的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体为IgG2a亚类，轻链为κ链。

[0064] 单克隆抗体细胞株的稳定性：单克隆抗体细胞株D3在液氮中冻存6个月，复苏后细胞传3代，抗体效价保持不变。

[0065] 单克隆抗体的Western-blot分析：按照蛋白质技术手册方法进行Western-blot分析。将重组MIC3蛋白、弓形虫全虫蛋白、弓形虫培养上清及含空载体BL21菌体的蛋白经SDS-PAGE 电泳后以95mA恒流转膜1.5h。一抗为纯化的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体，以1：100稀释；二抗为羊抗小鼠HRP-IgG，以1：5000稀释。结果如图2所示。可以看到，重组MIC3蛋白泳道上在56kDa位置处出现了特异性的结合条带，弓形虫全虫裂解蛋白泳道上在
38kDa（弓形虫天然MIC3蛋白）位置处出现了特异性的结合条带，作为对照的含空载体BL21菌体的蛋白泳道上没有出现特异性的结合条带。该结果说明，抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体能够特异性的识别大小为56kDa的弓形虫重组MIC3蛋白和38kDa的弓形虫天然MIC3蛋白。由于弓形虫天然MIC3蛋白存在于弓形虫速殖子期、缓殖子期和子孢子期等不同时期的排泄物及虫体表面, 持续时间长，所以可以用抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体检测样品中是否含有弓形虫天然MIC3蛋白，以判断样品中是否污染了弓形虫。

[0066] 实施例2弓形虫抗原胶体金免疫层析检测试纸条的制备及其性质

[0067] （1）20～30nm胶体金颗粒的制备

[0068] 采用柠檬酸三钠还原法制备金溶液。取0.01%氯金酸水溶液 100mL加热至煮沸，搅动下准确加入1 %柠檬酸三钠水溶液1.8mL，继续煮沸10min，冷却后加入蒸馏水使其恢复至原体积，测定金溶液的吸收峰波长，避光4℃保存。经紫外可见光分光光度计扫描观察，测定的吸收曲线在521nm处为吸收峰，峰值扫描结果为D521nm=0.857，其对应的颗粒直径为20～30nm。

[0069] （2）金标垫的制备

[0070] 取20mL、pH 7.5的胶体金溶液（颗粒直径为20～30nm）室温磁力搅拌下缓慢加入终浓度为6.0μg/mL纯化的抗弓形虫MIC3蛋白单克隆抗体，室温搅拌30min。加入终浓度为0.1%的BSA（牛血清白蛋白），室温搅拌5 min，继续加入终浓度为0.2%的PEG（分子量为20000），室温搅拌5min，10000rpm离心60min，小心吸弃上清，加2mL保存液（含有BSA、叠氮钠）悬浮沉淀，用0.45μm滤膜过滤，获得单克隆抗体标记的胶体金探针。

[0071] 将单克隆抗体标记的胶体金探针按4:1进行稀释，均匀地喷涂在玻璃纤维素膜上，制成胶体金标记单克隆抗体玻璃纤维素膜(简称为金标垫)。自然干燥后，加入干燥剂密封保存于4℃冰箱中备用。

[0072] （3）硝酸纤维素膜的处理

[0073] 包被于硝酸纤维素膜上，分别作为检测线和质检线的猪抗弓形虫多抗IgG和羊抗鼠IgG（猪抗弓形虫多抗IgG由弓形虫高免血清经ProteinG亲和层析柱纯化得到，羊抗鼠IgG购自上海杰一生物科技有限公司）的最佳包被浓度均为2.0mg/mL，此时条带清晰，无拖带，阴阳性肉眼区别明显。

[0074] （4）试纸条的组装

[0075] 在PVC底板上分别将包被有猪抗弓形虫多克隆抗体IgG和羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜、金标垫与样品垫（材料为玻璃纤维素膜）、吸水垫（滤纸）依次组装、用切刀裁成0.4cm宽的试纸条，即为弓形虫抗原胶体金免疫层析检测试纸条成品。与干燥剂一起密封4℃贮存。Ｃ线：包被有羊抗鼠IgG的硝酸纤维素膜；Ｔ线：包被有猪抗弓形虫多抗IgG的硝酸纤维素膜。

[0076] （5）检测与结果判读

[0077] 将试纸条恢复至常温、开封，将检测端浸泡在样品检测液中（液面不可超过箭头线），取出水平放置3～5min后观察结果，如试纸条上仅Ｃ线出现紫红条带为阴性；Ｃ线、Ｔ线均出现紫红色带为阳性；Ｃ线没有条带，则试纸条失效。

[0078] （6）弓形虫胶体金试纸条适用性评价

[0079] 敏感性试验：收集Vero细胞培养的弓形虫速殖子计数，用PBS将其分别稀释为6 5 4 3 2
4×10 个虫/mL、4×10 个虫/mL、4×10 个虫/mL、4×10 个虫/mL、4×10 个虫/mL的弓形虫阳性标准样品，同时以PBS作为阴性对照，以试纸条检测到的弓形虫阳性标准样品最低含虫浓度定为试纸条的灵敏度。实验结果如图3所示，随着样品含虫量的降低，试纸条检测
4
线显色逐渐变淡，当样品含虫量降低到4×10 个虫/mL时，检测线虽然已有些模糊，但还是
3
可以与阴性对照相互区分；当样品含虫量降低到4×10 个虫/mL时，检测线几乎看不到，与
4
阴性对照没有明显区别，即该胶体金试纸条检测弓形虫的最低敏感度为4×10 个虫/mL。

[0080] 特异性试验：用试纸条对大肠杆菌E. coli O26、猪霍乱沙门氏菌、猪囊尾蚴、华支睾吸虫和猪蛔虫的灭活抗原进行检测，并设弓形虫为阳性，PBS为阴性对照。结果表明该试纸条特异性良好，与大肠杆菌E. coli O26、猪霍乱沙门氏菌、猪囊尾蚴、华支睾吸虫和猪蛔虫无交叉反应。

[0081] 稳定性试验：将制备好的试纸条密闭包装，分别保存于4℃和室温 (25℃)条件下，每隔30 d取出进行外观及功能检验。检测结果显示胶体金试纸条在4℃保存有效期为12个月，在室温25℃保存有效期为3个月。