狂犬病、破伤风双效马抗血清及其制备方法

摘要

本发明公开了一种狂犬病、破伤风双效马抗血清，它是用狂犬病毒灭活抗原和破伤风类毒素抗原对健康马匹进行注射免疫并使之产生抗体血清，采血并选取每1ml含抗狂犬病血清效价100~20000国际单位，含抗破伤风血清效价1100~20000国际单位的血浆，用注射用水稀释2~4倍后进行纯化精制并加入氯化钠、硫柳汞制备而成的。用于被狂犬或其他疯动物咬伤或抓伤暴露后的患者进行狂犬病及破伤风预防。由于同时含有狂犬病、破伤风双效抗体，患者一次注射即可预防狂犬病与破伤风，使用简单方便，具有较大的社会效益和经济效益。

权利要求

1.一种狂犬病、破伤风双效马抗血清的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

1)挑选健康马匹，在0、14天注射狂犬病毒灭活抗原，然后于21天进行破伤风类毒素抗原的初次免疫注射和狂犬病毒灭活抗原的第三针注射，最后于45和60天同时进行狂犬病毒灭活抗原与破伤风类毒素抗原的加强免疫注射，每次注射的狂犬病毒灭活抗原和破伤风类毒素抗原均为5ml，所述狂犬病毒灭活抗原的效价为15～50IU/ml，其佐剂是液体石蜡与羊毛脂配成的油包水型不完全福氏佐剂，所述破伤风类毒素抗原的效价为100～500Lf/ml，其佐剂是液体石蜡与羊毛脂配成的油包水型不完全福氏佐剂；

2)免疫完成后的第15天采集血浆，选取每1ml含抗狂犬病血清效价100～20000国际单位，含抗破伤风血清效价1100～20000国际单位的血浆，用注射用水稀释2～4倍；

3)稀释后的血浆纯化精制，制得每1ml含抗狂犬病血清效价不少于200国际单位，含抗破伤风血清效价不低于2000国际单位，F(ab’)2片段的纯度不低于60％的狂犬病、破伤风双效马抗血清，所述纯化精制的方法包括以下步骤：

1)将稀释后的血浆调整PH值至3.1～3.7，然后加入胃蛋白酶至胃蛋白酶的终含量为

3～12u/g，消化60～120分钟后加入硫酸铵盐析、过滤，取沉淀；

2)将沉淀用注射用水完全溶解，按重量加入0.8～1.2％的明矾，调整PH值至7.7～

7.9，吸附1小时后过滤，除去明矾，上清液超滤浓缩，向浓缩液中加入注射用水调整蛋白质含量为10～150g/L，并加入氯化钠、硫柳汞使氯化钠的浓度为7.5～9.5g/L、硫柳汞的浓度为0.07～0.1g/L，调pH值至6.0～7.0；

3)将步骤2)得到的溶液用0.20微米滤膜除菌过滤，除菌过滤的压力为0.01～

0.15MPa。

说明书

狂犬病、破伤风双效马抗血清及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物制药领域，具体涉及一种狂犬病、破伤风双效马抗血清及其制备方法。

背景技术

[0002] 狂犬病是一种自然疫源性疾病，是由狂犬病毒引起的所有温血动物都易感的人兽共患性疾病，一旦发病死亡率为100%，及时进行狂犬病抗血清或者免疫球蛋白的注射，以及狂犬病疫苗的及时接种，是唯一的保护性措施。我国的狂犬病防治形势非常严峻。

[0003] 当人受外伤时，破伤风杆菌会经伤口侵入人体，释放出一种高度毒性蛋白——破伤风痉挛毒素，引起神经症状肢体痉挛性麻痹（局部性破伤风）和全身抽搐（全身性破伤风）。

[0004] 人被狗咬伤后，需要同时预防狂犬病和破伤风。现有的方法一般是分别注射破伤风免疫球蛋白和狂犬病免疫球蛋白，由于注射量较大，注射针次较多，而且费用很高，患者难以接受。另外一种是注射马抗血清，马抗血清是将抗原免疫马匹后，马匹产生抗病原微生物的高效抗体，将含有高效抗体的血清进行分离、纯化制备而成，目前市场上有单价的抗狂犬病抗血清，以及抗破伤风抗血清，但由于其都为马的抗体蛋白提取终究为异源蛋白，大剂量的注射不可避免地产生过敏反应，目前没有抗破伤风与抗狂犬病的双效血清上市，只有申请号为200910088039.2的中国发明专利公开了一种狂犬病、破伤风双效价人免疫球蛋白，由于是正常人群免疫后获得，所以来源有限，价格高昂，大规模的获取存在很大的困难。

发明内容

[0005] 本发明的目的是弥补现有技术及产品效能的不足，提供一种人用的既能预防狂犬病同时又能预防破伤风的狂犬病、破伤风双效马抗血清及其制备方法。

[0006] 技术方案如下：

[0007] 一种狂犬病、破伤风双效马抗血清，它是用狂犬病毒灭活抗原和破伤风类毒素抗原对健康马匹进行注射免疫并使之产生抗体血清，采血并选取每1ml含抗狂犬病血清效价100~20000国际单位，含抗破伤风血清效价1100~20000国际单位的血浆，用注射用水稀释
2~4倍后进行纯化精制并加入氯化钠、硫柳汞制备而成的，所述狂犬病、破伤风双效马抗血清中每1ml含抗狂犬病血清效价不少于200国际单位，含抗破伤风血清效价不低于2000国际单位，F(ab’)2的纯度为60~95%，IgG的含量为1~10%，蛋白质的含量为10~150g/L，氯化钠的含量为7.5~9.5g/L，硫酸铵的含量为0.2~1.0g/L，防腐剂硫柳汞的含量为0.07~0.10g/L。

[0008] 一种狂犬病、破伤风双效马抗血清的制备方法，包括以下步骤：

[0009] 1）挑选健康马匹，在0、14天注射狂犬病毒灭活抗原，然后于21天进行破伤风类毒素抗原的初次免疫注射和狂犬病毒灭活抗原的第三针注射，最后于45和60天同时进行狂犬病毒灭活抗原与破伤风类毒素抗原的加强免疫注射，每次注射的狂犬病毒灭活抗原和破伤风类毒素抗原均为5ml，

[0010] 所述狂犬病毒灭活抗原的效价为15~50IU/ml，其佐剂是液体石蜡与羊毛脂配成的油包水型不完全福氏佐剂，

[0011] 所述破伤风类毒素抗原的效价为100~500Lf/ml，其佐剂是液体石蜡与羊毛脂配成的油包水型不完全福氏佐剂；

[0012] 2）免疫完成后的第15天采集血浆，选取每1ml含抗狂犬病血清效价100~20000国际单位，含抗破伤风血清效价1100~20000国际单位的血浆，用注射用水稀释2~4倍；

[0013] 3）稀释后的血浆经纯化精制，即得。

[0014] 其中，稀释后的血浆是采用以下方法纯化精制的：

[0015] 1）将稀释后的血浆调整PH值至3.1~3.7，然后加入胃蛋白酶至胃蛋白酶的终含量为3~12u/g，消化60~120分钟后加入硫酸铵盐析、过滤，取沉淀；

[0016] 2）将沉淀用注射用水完全溶解，按重量加入0.8~1.2%的明矾，调整PH值至7.7~7.9，吸附1小时后过滤，除去明矾，上清液超滤浓缩，向浓缩液中加入注射用水调整蛋白质含量为10~150g/L，并加入氯化钠、硫柳汞使氯化钠的浓度为7.5~9.5g/L、硫柳汞的浓度为0.07~0.1g/L，调pH值至6.0~7.0；

[0017] 3）将步骤2）得到的溶液用0.20微米滤膜除菌过滤，除菌过滤的压力为0.01~0.15MPa。

[0018] 马抗血清与人源免疫球蛋白具有本质的区别，中国药典将其完全归为不同类的产品。本产品不是简单的两种抗血清的混合，而是利用动物机体免疫反应，利用不同抗体分子位点不同而产生的一个抗体分子同时携带两种抗病原体作用的抗体，配合免疫程序及剂量获得免疫血清经制备而成。另外，马匹相对于人来讲属于不同种的生物，免疫的抗原量与佐剂的使用均不相同，且抗体蛋白获得后必须进行更为复杂的制备、提纯，但由于来源简单，容易大规模的获得与制备，所以价格低廉，同时其单位效价较人免疫球蛋白高，使用量少，使用过程中注射量小，注射针次少，如果是双效抗血清将进一步减少一半的使用量，可以最大量减少异源蛋白对人体的过敏反应，从而在临床上具有人源球蛋白与目前单独病原抗血清不可替代的优越性。

[0019] 本发明所述的狂犬病、破伤风双效马抗血清仅与抗马的血清产生沉淀线，与马IgG抗体反应呈阳性。所述的狂犬病、破伤风双效马抗血清用于被狂犬或其他疯动物咬伤或抓伤暴露后的患者进行狂犬病及破伤风预防。由于同时含有狂犬病、破伤风双效抗体，患者一次注射即可预防狂犬病与破伤风，使用简单方便，具有较大的社会效益和经济效益。

具体实施方式

[0020] 实施例1

[0021] 一种狂犬病、破伤风双效马抗血清，它是按以下方法制备而成的：

[0022] 1、挑选合适的4~12岁的健康马匹10匹，分别在0、14天注射狂犬病毒灭活抗原5ml，其抗原的效价为25IU/ml，其佐剂使用液体石蜡与羊毛脂配成“油包水” 的不完全福氏佐剂；然后于第21天进行破伤风类毒素抗原的初免注射，抗原的效价为200Lf/ml，其佐剂使用液体石蜡与羊毛脂配成“油包水” 的不完全福氏佐剂，同时进行狂犬病毒灭活抗原的第三针注射，每种抗原分别为5ml；完成后于45、60天同时进行狂犬病毒灭活抗原与破伤风类毒素抗原的注射加强免疫，每种抗原分别为5ml。建立详细的马匹免疫接种记录。

[0023] 2、血浆的采集

[0024] 进行马匹采集血浆样品进行血清抗体效价的检测，试血破伤风抗体效价1100~20000IU/ml，狂犬病毒抗体100~20000IU/ml的马匹即可采血。对于血清效价没有达到采集标准的马匹进行加强免疫，使其达到采集标准，对于采集完成的马匹同时进行加强免疫以备下次进行血浆采集。每匹马采集血浆5000±500ml。采集的血浆含有狂犬病、破伤风双效抗体，低温冷冻保存。使用前用注射用水稀释3倍。

[0025] 3、血浆纯化精制

[0026] 1）将稀释后的血浆调整PH值至3.4，然后加入胃蛋白酶至胃蛋白酶的终含量为8u/g，消化90分钟后加入硫酸铵（按每100克消化液加入15克硫酸铵）盐析、过滤（板框压滤），取沉淀；

[0027] 2）将沉淀用注射用水完全溶解，按重量加入1%的明矾，调整PH值至7.8，吸附1小时后过滤（加硅藻土助滤），除去明矾，上清液超滤浓缩（先浓缩至体积的1/10，用注射用水稀释6倍后，再次超滤浓缩至体积的1/10），向浓缩液中加入注射用水调整蛋白质含量为50g/L，并加入氯化钠、硫柳汞使氯化钠的浓度为8.5g/L、硫柳汞的浓度为0.08g/L，调pH值至6.5；

[0028] 3）将步骤2）得到的溶液用0.20微米滤膜除菌过滤，除菌过滤的压力为0.01~0.15MPa。除菌过滤应于超滤浓缩完毕后2小时内进行。

[0029] 纯化后的抗毒素原液应置2~8℃避光保存1~12个月作为稳定期。

[0030] 本发明所述的狂犬病、破伤风双效马抗血清，其剂型为液体剂型，分装以狂犬病中和抗体效价为准，其规格有400IU/2.0ml/瓶、1000IU/5.0ml/瓶，内含破伤风的抗体效价为500~2000IU/ml。

[0031] 本发明所采集的原料血浆应低温保存，保存期不超过3年。

[0032] 本发明的狂犬病、破伤风双效抗血清用于被狂犬或其他疯动物咬伤或抓伤暴露患者预防发生狂犬病及破伤风，其使用量以狂犬病中和抗体效价计算，按40IU/kg（特别严重可酌情增至80~100IU）体重计算，在1~2日内分次注射。

[0033] 质量检测结果：

[0034]

[0035] 实施例2

[0036] 1）挑选同批健康小白鼠110只，实验室喂养3天，待小白鼠适应环境。

[0037] 2）将按实施方式所得的产品分别与狂犬病毒、破伤风菌进行混匀37℃中和。

[0038] 3）将购买的狂犬病毒抗血清（武汉生物制品研究所，批号：20120504）与狂犬病毒混匀37℃中和，破伤风抗血清（武汉生物制品研究所，批号：20120607）与破伤风菌进行混匀37℃中和。

[0039] 4）按下表实验方式进行分组实验：