香料组合物

摘要

本发明涉及香料组合物。本发明提供一种新型的具有优异麝香类香味的麝香基香料。本发明还提供一种香料组合物，其含有以下述式（1）表示的大环内酯化合物作为有效成分。式中，A表示亚乙烯基，R表示碳原子数为1～3的烷基，n表示1～6的整数。

权利要求

1.一种香料组合物，其含有以下述式（1）表示的大环内酯化合物作为有效成分，式中，A表示亚乙烯基，R表示碳原子数为1～3的烷基，n表示1～6的整数。

2.如权利要求1所述的香料组合物，其中，R为甲基、A为亚乙烯基、n为5；R为乙基、A为亚乙烯基、n为4；或者R为正丙基、A为亚乙烯基、n为3。

3.一种大环内酯化合物，其以下述式（2）表示，式中，R表示碳原子数为1～3的烷基，n表示1～6的整数。

4.如权利要求3所述的大环内酯化合物，其中，R为甲基、n为5；R为乙基、n为4；或者R为正丙基、n为3。

5.以式（1）表示的大环内酯化合物用于制造权利要求1或者2所述的香料组合物的用途，式中，A表示亚乙烯基，R表示碳原子数为1～3的烷基，n表示1～6的整数。

说明书

香料组合物

[0001] 本申请是申请日为2010年1月13日、申请号为201080003825.9、发明名称为香料组合物的专利申请的分案申请。

技术领域

[0002] 本发明涉及一种含有大环内酯化合物作为有效成分的香料组合物。

背景技术

[0003] 目前，从动物保护的观点来看，难以得到天然麝香香料。另一方面，为了顺应气味喜好的变化，迄今对于具有麝香香味的众多大环化合物已经进行了研究（例如，非专利文献1和2）。然而，由于大环麝香化合物的合成较为困难、并且所述化合物非常昂贵，因而，只有少数几种投放市场。因此，以麝香酮和二甲苯麝香为代表的硝基麝香化合物、以佳乐麝香（Galaxolide，注册商标）和吐纳麝香（Tonalide，注册商标）为代表的多环麝香化合物专门被用于麝香基香料。

[0004] 然而，从现在越来越倾向于天然产品以及环境意识增加的观点考虑，不仅安全性，而且蓄集性和降解性方面几乎都没有问题的大环麝香化合物再次被关注。

[0005] 大环内酯化合物为大环麝香化合物的典型性化合物。然而，就香味和成本而言，至今得到的大环内酯化合物仍不能令人满意。

[0006] 因此，寻求开发一种大环麝香化合物，既能满足实际制备时作为香料材料的有效性，又能满足所述化合物的合成所带来的技术和经济问题。

[0007] 另外，14-正丙基氧杂环十四烷-2-酮（14-n-propyloxacyclotetradecan-2-one）作为大环内酯化合物被熟知（非专利文献3）。然而，该大环内酯化合物没有被分离，该化合物是否确实具有香味、或该化合物散发哪种香味也还未知。

[0008] 非专利文献

[0009] 非专利文献1：I.B.Bersuker,et al.,New J.Chem.,Vol.15,p.307(1991)[0010] 非专利文献2：Abe Masami,Perfumes,No.96,September1970,p.19

[0011] 非专利文献3：L.Hinkamp,et al.,Liebigs Ann.Chem.(1992),559-563

发明内容

[0012] 1）本发明提供一种香料组合物，其含有以下述式（1）表示的大环内酯化合物作为有效成分。

[0013]

[0014] 式中，A表示亚乙烯基，R表示碳原子数为1～3的烷基，n表示1～6的整数。

[0015] 2）本发明还提供以下述式（2）表示的大环内酯化合物。

[0016]

[0017] 式中，R表示碳原子数为1～3的烷基，n表示1～6的整数。

[0018] 3）本发明还提供以式（1）表示的大环内酯化合物用于制造上述1）的香料组合物的用途。

具体实施方式

[0019] 本发明涉及一种具有优异麝香类香味的香料组合物。

[0020] 本发明者们对于大环内酯化合物进行了研究，其结果发现：以上述式（1）表示的大环内酯化合物具有优异的麝香类香味，从而作为香料成分是有用的。如下述实施例所示，以式（1）表示的大环内酯化合物具有优异的麝香类香味。因此，本发明的香料组合物作为用于化妆品和洗漱用品、卫生材料、杂货、食品、医疗辅助用品、医疗用品等的香料成分是有用的。

[0021] 其中，以式（2）表示的在6-位上具有顺式双键的大环内酯化合物是一种新型化合物。如下述实施例所述，可以通过两个工序由天然生成的脂肪酸来制备该具有优异的麝香类香味的新型大环内酯化合物。因此，该新型大环内酯化合物作为用于化妆品和洗漱用品、卫生材料、杂货、食品、医疗用品等的香料成分是有用的。

[0022] 本发明的以式（1）表示的大环内酯化合物具有优异的麝香类香味。因此，本发明的香料组合物作为用于化妆品和洗漱用品、卫生材料、杂货、食品、医疗辅助用品、医疗用品等的香料成分是有用的。

[0023] 在式（1）中，当A为亚乙烯基时，R可以是甲基、乙基、正丙基或异丙基。从香味的观点考虑，优选为甲基、乙基或正丙基。

[0024] 在式（1）中，当A为亚乙基时，R可以是正丙基或异丙基。从香味的观点考虑，优选为正丙基。

[0025] 在式（1）中，从香味的观点考虑，n更优选为2～5的整数。当R为甲基且A为亚乙烯基时，n优选为5。当R为乙基且A为亚乙烯基时，n优选为4。当R为正丙基且A为亚乙烯基时，n优选为3。当R为正丙基且A为亚乙基时，n优选为3。

[0026] 在式（1）中，A可以是亚乙基或亚乙烯基，但是从原料供给的观点考虑，A优选为亚乙基。

[0027] 根据本发明，作为大环内酯化合物的具体例子，可以列举出15-甲基氧杂环十五碳-7烯-2酮、16-甲基氧杂环十六碳-7-烯-2-酮、17-甲基氧杂环十七碳-7-烯-2酮、18-甲基氧杂环十八碳-7-烯-2-酮、14-乙基氧杂环十四碳-7-烯-2-酮、15-乙基氧杂环十五碳-7-烯-2-酮、16-乙基氧杂环十六碳-7-烯-2-酮、17-乙基氧杂
环十七碳-7-烯-2-酮、13-正丙基氧杂环十三碳-7-烯-2-酮、14-正丙基氧杂环
十四碳-7-烯-2-酮、15-正丙基氧杂环十五碳-7-烯-2-酮、16-正丙基氧杂环十六
碳-7-烯-2-酮、14-正丙基氧杂环十四烷-2-酮等。其中，优选16-甲基氧杂环
十六碳-7-烯-2-酮、15-乙基氧杂环十五碳-7-烯-2-酮、14-正丙基氧杂环十四
碳-7-烯-2-酮和14-正丙基氧杂环十四烷-2-酮。

[0028] 以式（1）表示的大环内酯化合物在内酯环的ω-位上具有不对称碳原子，因而其以选自S-型和R-型的异构体的混合物存在。然而，根据本发明，内酯化合物可以是这些异构形式的任意一种或可以是外消旋体形式。

[0029] 根据本发明，大环内酯化合物可以通过公知的制备方法来制得。例如，大环内酯化合物可以由以下述式（3）表示的脂肪酸根据以下工序（A）和（B）方便地制备。

[0030]

[0031] 式中，R、A和n具有与上述相同的含义。

[0032] 工序（A）包括通过使以式（3）表示的脂肪酸与包含脂肪酸羟基化酶的生物催化剂作用，从而获得以式（4）表示的羟基脂肪酸的反应。

[0033] 以式（3）表示的脂肪酸可以是饱和脂肪酸、也可以是不饱和脂肪酸。所述不饱和脂肪酸可以是具有对应于以式（1）表示的目标化合物的R、A和n的不饱和脂肪酸，作为其具体例子可以列举出顺式-6-十二碳烯酸、顺式-6-十三碳烯酸、顺式-6-十四碳烯酸、顺式-6-十五碳烯酸、顺式-6-十六碳烯酸、顺式-6-十七碳烯酸、顺式-6-十八碳烯酸、顺式-6-十九碳烯酸等。所述饱和脂肪酸可以是具有对应于以式（1）表示的目标化合物的R、A和n的饱和脂肪酸，作为其具体例子可以列举出棕榈酸。上述脂肪酸可以单独使用或2种以上并用。

[0034] 作为原料的以式（3）表示的脂肪酸可以通过公知的方法（JP-B-2-6516）获得。特别是，顺式-6-十六碳烯酸的制备方法可以包括使用红球菌属（genus Rhodococcus）的微生物来制备所述酸的方法（JP-B-4-12718），从攀缘植物黑眼花（Black-eyed Susan vine，Thunbergia alata）中提取所述酸的方法或使用红球菌属的微生物由棕榈酸异丙酯制得所述酸的方法（JP-A-2005-65658）。然而，从以工业规模制得顺式-6-十六碳烯酸的观点考虑，优选使用红球菌属的微生物来制备所述酸的方法。

[0035] 在从黑眼花中提取所述酸的情况下，将黑眼花的全株、茎、花、叶或种子用适当的提取溶剂浸渍或加热回流，接着，将由此得到的产物适当地过滤、浓缩、冷冻干燥等从而得到浓缩提取物、干燥粉末或其它类似产物。作为提取溶剂的例子，可以列举出通常使用的有机溶剂例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、乙醚、乙二醇、丙二醇、丁二醇、石油醚、己烷、庚烷、环己烷、乙酸乙酯、丙酮、甲苯、二氯乙烷和氯仿，水等；上述溶剂可以单独使用或2种以上混合使用。可以按照常用方法进行提取处理，通常以大约3～100℃的温度进行几小时～几周，提取物可以通过凝胶过滤、柱层析、精馏等进行纯化后使用。

[0036] 脂肪酸羟基化酶是可以使脂肪酸的ω-亚端羟基化的酶。作为所述酶的具体例子，可以列举出CYP102A1（P450BM3）、CYP102A2、CYP102A3、CYP102A5、CYP505等。其中，从反应收率的观点考虑，优选为CYP102A1。上述酶可以多种组用使用。

[0037] 在工序（A）中，只要含有上述脂肪酸羟基化酶，可以以任意形式使用生物催化剂。作为含有上述酶的生物催化剂的例子，可以列举出可以产生本发明的酶的动物细胞或植物细胞、微生物细胞（活细胞、死细胞、休眠细胞、固定细胞等）等的生物细胞或其培养物，含有本发明的酶的细胞器（细胞器，cellular organelle），上述生物细胞或细胞器的均质物或提取物，粗酶，纯化酶等。

[0038] 可以产生上述本发明的酶的生物细胞等可以是天然细胞、也可以是通过包括基因操作的各种方法进行改性的变异体。上述生物催化剂可以单独使用、也可以2种以上组合使用。另外，上述生物催化剂可以直接使用，但是也可以以液体状使用例如溶液或悬浮液，或以固定于任意固体载体的形式使用。

[0039] 固定于固体载体的生物催化剂可以根据公知方法通过在任意水不溶性固体载体上固定上述生物催化剂从而制得。当生物催化剂被固定于固体载体时，在间歇式反应中促进了催化剂的回收和循环使用、并且在半连续式和连续式反应中也可以容易地使用生物催化剂。因此，得到了可以长期反复使用的固定化生物催化剂。

[0040] 作为在载体上固体酶的方法，可以列举出在专利文献JP-A-11-192096中记载的物理吸附法、离子键法、共价键法、交联法、包埋法或上述方法的组合。作为固定时使用的载体，可以列举出活性碳、多孔玻璃、酸性白粘土、漂白粘土、高岭石、矾土、硅胶、膨润土、羟基磷灰石、磷酸钙和金属氧化物等无机材料，淀粉和谷蛋白等天然聚合物，多孔合成树脂，陶瓷，由超滤膜或超滤膜制成的中空纤维，具有疏水基团的丁基-葡聚糖或己基-葡聚糖，具有单宁酸作为配体的纤维素衍生物，具有离子交换基团的多糖（DEAE-葡聚糖），离子交换树脂，天然或合成聚合物的凝胶或微囊等。

[0041] 在工序（A）中，除了上述脂肪酸羟基化酶以外，如果必要也可以使用酶、辅酶或其+它可以促进羟基化的物质。例如，当需要NAD(P)H时，可以适当使用NAD(P)、葡萄糖脱氢酶、葡萄糖等。另外，如果必要的化，可以根据需要使用原血红素、5-氨基乙酰丙酸和金属离子
2+ 3+
（Fe 、Fe 等）。从生物催化剂含有羟基化时所需的酶类或辅酶类的观点考虑，更优选生物催化剂为上述动物细胞、植物细胞、微生物细胞、细胞器等。

[0042] 相比化学方法，使用上述生物催化剂制备以式（4）表示的羟基脂肪酸可以在温和的条件下进行。例如，通常使用缓冲液将pH值调节至酶的最适pH值（pH值5～9、优选pH值7～8）。反应温度为20～60℃、优选为25～30℃。反应时间为1分钟～48小时、优选为1～12小时。

[0043] 为了提高原料脂肪酸的溶解性，可以在反应体系中加入表面活性剂或有机溶剂。表面活性剂可以是非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂或两性表面活性剂等。作为有机溶剂，只要不抑制酶的活性并可以溶解棕榈酸，就可以使用任意溶剂。
作为其具体例子，可以列举出极性溶剂例如醇、酮和醚，含氮溶剂例如吡啶、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和喹啉，含硫溶剂例如二甲基亚砜，非极性溶剂例如芳香烃、饱和或不饱和烃等。然而，优选为丙酮。

[0044] 在使用生物细胞培养物作为生物催化剂的情况下，例如可以在培养物中加入原料脂肪酸。对于在羟基化反应中所需的辅酶等，可以使用细胞内生成物质。如果必要的话，可以在培养物中加入上述物质。当将加入了原料和适当物质的培养物在适当培养条件下保持一段时间时，培养物中本发明的酶和原料脂肪酸相互反应生成羟基脂肪酸。根据使用的细胞类型不同则适当的培养条件和时间不同，可以通过本领域技术人员的公知常识来适当确定。

[0045] 基质的浓度没有特别限定，但是优选为0.001～20%、更优选为0.05～1%。可以分批或连续地在反应体系中加入脂肪酸。

[0046] 可以通过公知的方法分离由工序（A）得到的羟基脂肪酸、也可以不分离直接用于工序（B）中。然而，优选使用分离后的羟基脂肪酸。

[0047] 可以通过进行有机溶剂提取等从反应溶液中分离和回收以式（4）表示的羟基脂肪酸。两性烃基溶剂例如正己烷，不溶于水的有机溶剂例如乙酸乙酯和氯仿，醇例如2-丙醇等可以用于提取。

[0048] 工序（B）包括通过使以式（4）表示的羟基脂肪酸进行环化反应从而得到以式（1）表示的大环内酯化合物的反应。

[0049] 以式（4）表示的羟基脂肪酸可以是不饱和羟基脂肪酸或饱和羟基脂肪酸。不饱和羟基脂肪酸优选为在6-位上具有顺式双键的不饱和羟基脂肪酸，饱和羟基脂肪酸优选为13羟基棕榈酸。

[0050] 在6-位上具有顺式双键的不饱和羟基脂肪酸可以是具有对应于以式（1）表示的化合物的R、A和n的不饱和羟基脂肪酸，例如可以列举出11-羟基-顺式-6-十二碳烯酸，11-羟基-顺式-6-十三碳烯酸、12-羟基-顺式-6-十三碳烯酸，11-羟基-顺式-6-十四碳烯酸、12-羟基-顺式-6-十四碳烯酸、13-羟基-顺式-6-十四碳烯酸，12-羟基-顺式-6-十五碳烯酸、13-羟基-顺式-6-十五碳烯酸、14-羟基-顺式-6-十五碳烯酸，13-羟基-顺式-6-十六碳烯酸、14-羟基-顺式-6-十六碳烯酸、15-羟基-顺式-6-十六碳烯酸，
14-羟基-顺式-6-十七碳烯酸、15-羟基-顺式-6-十七碳烯酸、16-羟基-顺式-6-十七碳烯酸，15-羟基-顺式-6-十八碳烯酸、16-羟基-顺式-6-十八碳烯酸、17-羟基-顺式-6-十八碳烯酸，16-羟基-顺式-6-十九碳烯酸、17-羟基-顺式-6-十九碳烯酸和
18-羟基-顺式-6-十九碳烯酸。

[0051] 其中，优选为11-羟基-顺式-6-十四碳烯酸、12-羟基-顺式-6-十四碳烯酸、13-羟基-顺式-6-十四碳烯酸，12-羟基-顺式-6-十五碳烯酸、13-羟基-顺式-6-十五碳烯酸、14-羟基-顺式-6-十五碳烯酸，13-羟基-顺式-6-十六碳烯酸、14-羟基-顺式-6-十六碳烯酸和15-羟基-顺式-6-十六碳烯酸，更优选为13-羟基-顺式-6-十六碳烯酸、14-羟基-顺式-6-十六碳烯酸和15-羟基-顺式-6-十六碳烯酸。上述不饱和羟基脂肪酸可以单独使用或2种以上组合使用。

[0052] 工序（B）可以在环化催化剂存在下、或在没有该环化催化剂下进行，只要在环化反应中的常用条件下进行该工序既可。该工序优选在环化催化剂下进行，作为所述环化催化剂可以列举出二环己基碳二亚胺（以下，也称为“DCC”）和4-二甲基氨基吡啶（以下，也称为“DMAP”）的混合物（以下，也称为“DCC/DMAP”），镁化合物例如氧化镁或氯化镁，苯磺酸、对甲苯磺酸、羧酸活化剂（例如，三氟乙酸酐、N,N’-羰基咪唑、二（2-吡啶基）硫醚和三苯基膦的混合物）、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯的混合物、或叔戊醇钠。另外，在使用DCC/DMAP作为环化催化剂的情况下，除了DCC/DMAP以外，还优选使用4-二甲基氨基吡啶盐酸盐（以下，也称为“DMAP·HCl”）。

[0053] 当在工序（B）中使用DCC/DMAP时，优选在溶剂的存在下进行该工序。所述溶剂没有特别限定，例如可以列举出氯仿、二氯甲烷，优选为氯仿。

[0054] 即，作为环化反应的具体适当的例子，可以列举出在DCC、DMAP和DMAP·HCl的氯仿溶液中溶解羟基脂肪酸、加热溶液回流的方法（凯克大环内酯化法，Keck macrolactonization method）。

[0055] 在工序（B）中使用DCC/DMAP的情况下，DCC、DMAP和DMAP·HCl的使用量，可以适当选择不拖延反应时间或降低反应效率的量，但优选相对于以式（4）表示的羟基脂肪酸分别以1.5～10当量、1.5～10当量、1.5～10当量的量来使用上述混合物。

[0056] 在工序（B）中使用DCC/DMAP的情况下，反应体系通常在30～100℃下振荡并搅拌大约10～24小时。优选在50～70℃下振荡并搅拌大约15～20小时来进行该工序。

[0057] 可以通过适当的组合常用技术从反应体系中分离和纯化化合物从而分离得到目标化合物。作为常用技术可以列举出过滤、洗净、干燥、重结晶、离心、用各种溶剂进行的提取和色谱法。

[0058] 如后述实施例所述，本发明的化合物具有优异的麝香香味。因此，本发明的化合物可以作为香料组合物的有效成分来使用，也可以用于制造香料组合物。

[0059] 从香味的观点考虑，本发明的化合物加入香料组合物的含量优选为0.01～50重量%、更优选为0.1～20重量%。

[0060] 本发明的香料组合物可以仅仅含有本发明的化合物，但是在不削弱本发明的化合物的香味的范围内，组合物也可以含有其它香味物质，可以列举出表面活性剂，例如聚氧乙烯月桂基硫酸醚；溶剂，例如二丙二醇、邻苯二甲酸二乙酯、乙二醇、丙二醇、肉豆蔻酸甲酯、柠檬酸三乙酯；烃类，例如柠檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、松油烯、柏木烯、长叶烯（longifolene）、巴伦西亚桔烯（valencene）；醇类，例如芳樟醇、香茅醇、香叶醇、橙花醇、松油醇、二氢月桂烯醇（dihydromyrcenol）、乙基芳樟醇、金合欢醇、橙花叔醇、顺式-3-己烯醇、雪松醇、薄荷醇、龙脑、β-苯乙醇、苄醇、苯己醇、2,2,6-三甲基环己基-3-己醇、1-(2-叔丁基环己氧基)-2-丁醇、4-异丙基环己烷甲醇、4-甲基-2-(2-甲基丙基)四氢-2H-吡喃-4-醇、2-甲基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇、2-乙基-4-(2,2,3-三甲基-3-环戊烯-1-基)-2-丁烯-1-醇、异莰基环己醇（isocamphylcyclohexanol）、3,7-二甲基-7-甲氧基辛烷-2-醇；

[0061] 酚类，例如丁香酚、麝香草酚、香草酚；酯类，例如甲酸芳樟酯、甲酸香茅酯、甲酸香叶酯、乙酸正己酯、乙酸顺式-3-己烯酯、乙酸芳樟酯、乙酸香茅酯、乙酸香叶酯、乙酸橙花酯、乙酸松油酯、乙酸诺卜酯（nopyl acetate）、乙酸龙脑酯、乙酸异龙脑酯、乙酸邻叔丁基环己酯、乙酸对叔丁基环己酯、乙酸三环癸烯酯、乙酸苄酯、乙酸苏合香酯、乙酸肉桂酯（cinnamyl acetate）、乙酸二甲基苄基原酯、3-戊基四氢吡喃-4-基乙酸酯、丙酸香茅酯、丙酸三环癸烯酯、环己基丙酸烯丙酯、2-环己基丙酸乙酯、丙酸苄酯、丁酸香茅酯、正丁酸二甲基苄基原酯、异丁酸三环癸烯酯、2-壬烯酸甲酯、苯甲酸甲酯、苯甲酸苄酯、肉桂酸甲酯、水杨酸甲酯、水杨酸正己酯、水杨酸顺式-3-己烯酯、惕各酸香叶酯（geranyl tiglate）、惕各酸顺式-3-己烯酯（cis-3-hexenyl tiglate）、茉莉酮酸甲酯、二氢茉莉酮酸甲酯、甲基-2,4-二羟基-3,6-二甲基苯甲酸酯、甲基苯基缩水甘油酸乙酯、邻氨基苯甲酸甲酯（methyl anthranilate）、果香酯（fruitate）；

[0062] 醛类，例如正辛醛、正癸醛、正十二醛、2-甲基十一醛、10-十一烯醛、香茅醛、柠檬醛、羟基香茅醛、二甲基四氢安息香醛、4(3)-(4-羟基-4-甲基戊基)-3-环己烯-1-甲醛、2-环己基丙醛、对叔丁基-α-甲基氢化肉桂醛、对异丙基-α-甲基氢化肉桂醛、对乙基-α,α-二甲基氢化肉桂醛、α-戊基肉桂醛、α-己基肉桂醛、胡椒醛、α-甲基-3,4-甲烯二氧基氢化肉桂醛；酮类，例如甲基庚烯酮、4-亚甲基-3,5,6,6-四甲基-2-庚酮、戊基环戊酮、3-甲基-2-(顺式-2-戊烯-1-基)-2-环戊烯-1-酮、甲基环戊烯醇酮、玫瑰酮、γ-甲基紫罗兰酮、α-紫罗兰酮、香芹酮、薄荷酮、樟脑、香柏酮（nootkatone）、苄基丙酮、大茴香基丙酮、甲基β-萘基酮、2,5-二甲基-4-羟基-3(2H)-呋喃酮、麦芽酚（maltol）、7-乙酰基-1,2,3,4,5,6,7,8-八氢-1,1,6,7-四甲基萘、麝香酮、灵猫酮（civetone）、环十五烷酮、环十六烯酮；

[0063] 缩 醛 类 或 缩 酮 类，例 如 乙 醛 乙 基 苯 基 丙 基 缩 醛（acetaldehyde ethylphenylpropyl acetal）、柠檬醛二乙缩醛、苯乙醛甘油缩醛、乙基乙酰乙酸乙二醇缩酮；醚类，例如茴香脑、β-萘基甲基醚、β-萘基乙基醚、氧化柠檬烯（limonene oxide）、玫瑰醚（rose oxide）、1,8-桉叶素、外消旋或旋光性十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃；腈类，例如香茅腈（citronellylnitrile）；

[0064] 除了本发明的化合物的其它内酯类，例如γ-壬内酯、γ-十一内酯、δ-癸内酯、γ-茉莉内酯、香豆素、环十五内酯、环十六内酯、黄葵内酯（ambrettolide）、巴西酸乙二醇环酯（ethylene brassylate）、11-氧杂十六内酯，包括天然精油或天然提取物的其它香味物质，例如橙、柠檬、佛手柑、柑橘、薄荷、留兰香、薰衣草、甘菊、迷迭香、桉树、鼠尾草、罗勒、玫瑰、天竺葵、茉莉、伊兰树、茴芹、丁香、姜、肉豆蔻、豆蔻、雪松、柏树、香根草、广藿香、岩蔷薇（labdanum）等。上述其它成分可以单独加入或2种以上混合加入。

[0065] 为了散发出高度偏好的优异味道、或提高目标混合物的气味，以式（1）表示的大环内酯化合物可以作为香料成分用于各种产品中，例如化妆品和洗漱用品、卫生材料、杂货、食品、医疗辅助用品和医疗用品。

[0066] 例如，本发明的大环内酯化合物可以作为香料成分用于香料产品中，作为所述香料产品可以列举出香水和古龙水，香波、润丝（hair rinse）、护发素（hair tonic）、发乳、摩丝、发胶、发油、喷雾和其它头发化妆品，皮肤化妆品材料例如洁肤液、精华液、护肤霜、乳液、面膜、粉底、扑面粉、唇膏和各种化妆品产品，肥皂、餐具洗涤剂、洗衣剂、柔软剂、消毒清洁剂、除臭剂、室内香水、家具护理剂、玻璃清洁剂、地板清洁剂、杀菌剂、杀虫剂、漂白剂和其它各种卫生清洁剂，牙膏，医药辅助用品例如漱口水、沐浴剂、止汗剂和烫发液，杂货例如卫生纸和面巾纸，医疗用品，食品等。

[0067] 以式（1）表示的大环内酯化合物计，加入本发明的香水组合物的制品的量优选为0.001～50重量%、更优选为0.01～20重量%。

[0068] 实施例

[0069] 以下，通过实施例来详细地说明本发明。

[0070] 参考例1：P450BM3的表达

[0071] （ⅰ）P450BM3和GDH共表达大肠杆菌（Escherichia coli）的构建

[0072] 将大肠杆菌BL21Star（DE3）（Invitrogen,Inc.生产）用作蛋白质生产的宿主。将pET21a（Novagene,Inc.生产）用作高表达载体的质体。将大肠杆菌株HB101（Takara Bio,Inc.生产）用作基因亚克隆的大肠杆菌宿主。

[0073] 将巨大芽孢杆菌（Bacillus megaterium）株ATCC14581用作P450BM3（序列编号：1）的基因来源。将枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）株168（ATCC23857）用作葡萄糖脱氢酶（GDH）（序列编号：2）的基因来源。

[0074] pETBM3-gdh是高度表达P450BM3和GDH的载体，通过在pET21a的多克隆点插入BM3基因，然后在BM3基因的下游插入GDH基因来构建所述pETBM3-gdh。通过将巨大芽孢杆菌株ATCC14581的基因组用作模板、将BM3/BamHI FW和BM3/EcoRI RV用作引物（序列编号：3和4）来进行BM3基因的扩增。在PCR过程中使用Pyrobest DNA聚合酶（Takara Bio,Inc.生产）。根据附加的规程来确定PCR的组成和反应条件。

[0075] 用Bam HI和Eco RI来处理长度为3.2kbp的扩增DNA片段，将其插入pET21a的Bam HI和Eco RI的位置，从而构建pETBM3。通过将枯草杆菌株168用作模板、将BSgdh/EcoRI f1和BSgdh/Xho I r1（序列编号：5和6）用作引物来进行GDH基因的扩增。用Eco RI和Xho I来处理长度约为0.8kbp的扩增DNA片段，将其插入pETBM3的Eco RI和Xho I位置，从而构建pETBM3-gdh。

[0076] 对于基因序列的确定，使用ABI PRISMTM3100Genetic Analyzer（Applied TMBiosystems,Inc.制造）作为DNA序列分析仪，通过使用Big Dye Terminator v3.1Cycle Sequencing Ready Reaction（Applied Biosystems,Inc.制造）、并将质体用作模板，根据附加规程来制备样品。

[0077] 通过感受态细胞法将构建的表达载体引入大肠杆菌。将适当量的质体DNA加入在冰上解冻的40μL大肠杆菌HB101感受态细胞或40μL大肠杆菌BL21Star（DE3）感受态细胞中，将混合物在冰上培养30分钟。将混合物在42℃下培养45秒，并立刻放在冰上静置2分钟。将360μL预先在37℃下培养的SOC培养基（Takara Bio,Inc.生产）加入混合物中，接着，37℃下以150rpm将混合物振荡60分钟。将每个转化液放入含有100ppm氨苄西林钠（ampicillin sodium salt）的LB板中，将该板在37℃下培养16小时。将成长的细菌作为转化体分离。

[0078] 通过在LB板上划线将分离的转化体进行接种，然后在30℃下培养16小时。成长的细菌悬浮于0.5mL20%无菌甘油中，将该悬浮液在-80℃下冷冻保存，作为冷冻保存的细菌细胞来使用。

[0079] （ⅱ）目标蛋白质的表达以及酶溶液的制备

[0080] 大肠杆菌的生长条件和蛋白质的表达如下进行。挑选转化体，并将其在37℃下在5mL含有100ppm氨苄西林钠的LB培养基中以250rpm培养8小时。使用1mL上述培养液来给新的含有100ppm氨苄西林钠的LB培养基接种。将由此得到的产物在37℃下以120rpm进行培养，直至OD600达到0.4（大约2.5小时）。通过加入0.5mM IPTG、1mM5-氨基乙酰丙酸和0.001%FeCl3·6H2O（作为最终浓度）来诱导培养，并在25℃下培养16小时。使用前将所有试剂进行过滤。以8000rpm将培养液离心10分钟从而得到细菌细胞，用50mM Tris-HCl缓冲液（pH值8.0）对该细胞洗涤1次。

[0081] 使从100mL培养液中得到的细菌细胞悬浮于2mL50mM Tris-HCl（pH值8.0），每50mL Tris-HCl含有一块Complete EDTA Free（Roche,Ltd.生产）。根据附加的规程，将细菌悬浮液送入Lysing Matrix B（Q-Biogene,Inc.制造），并使用FastPre（p Q-Biogene,Inc.制造）来分解细菌细胞。如果培养液超过1L，则以与上述同样的比例来制备细菌细胞悬浮液，以15000psi、100滴/分钟的速率使该悬浮液一次通过FRENCH PRESS（Thermo Spectronic Co.制造）。以15000rpm将该分解的细胞液离心10分钟，并收集上层清液。在上层清液中加入等量甘油，并在-30℃下保存该混合物。将该保存的液体用作酶溶液。

[0082] 实施例1：脂肪酸的羟基化反应

[0083] 使用上述参考例1中制得的酶溶液来进行棕榈酸（Sigma-Aldrich Company生产，纯度99%）的羟基化。如下进行酶促反应。

[0084] 在500mL Sakaguchi烧瓶中制备30组200mL反应液，使其含有100mM磷酸钾缓冲液（pH值8.0）、0.5g/L棕榈酸、5mM葡萄糖和50mL/L细菌细胞提取物，上述都为最终浓度，+并将反应液在25℃下培养2分钟。在每个培养溶液中加入最终浓度为0.05mM的NADP，将溶液在25℃下以120rpm培养14小时。在反应液中加入2%（v/v）浓盐酸，接着用50%（v/v）己烷提取该混合物。通过真空干燥使提取物干燥，从而得到1.70g己烷提取物。用甲醇中14%的三氟化硼-甲醇溶液（Wako chemical生产）对己烷提取物中所含的羟基脂肪酸进行甲基化，再用N-三甲基硅咪唑（N-trimethylsilimidazole，Wako chemical生产）进行三甲基硅烷化。

[0085] 在毛细管气相色谱仪-质谱仪（HP6890/5973GC-MS（Agilent,Inc.制造））中用30m×200μm×0.25μm DB-1MS（J&W Scientific,Inc.制造）来分析1μL该溶液。使用高纯氦作为移动相以1mL/min的流速来进行分析。使用的升温程序为1分钟100℃，以20℃/分钟的升温梯度升温至300℃，并在300℃恒温5分钟。将16-羟基棕榈酸作为羟基脂肪酸的标准。

[0086] 得到13-羟基棕榈酸，反应收率为0.8%。

[0087] 13-羟基棕榈酸、14-羟基棕榈酸和15-羟基棕榈酸的总量为120mg，羟基化位置的比率分别为：ω-1位32.9%、ω-2位47.1%、ω-3位20.0%。

[0088] 实施例2：羟基脂肪酸的分子内环化反应

[0089] 在294.92g氯仿中加入2.72g二环己基碳二亚胺、2.42g4-二甲基氨基吡啶、2.09g4-二甲基氨基吡啶盐酸盐。回流下使用注射泵16小时内在氯仿溶液中滴加含有
1.70g实施例1中得到的产物39.6mLTHF。在回流下将混合物搅拌30分钟，再冷却至室温。
减压下蒸馏溶剂，再用乙醚稀释残留物。通过过滤分离不溶物。

[0090] 通过将过滤的溶剂真空蒸馏得到2.77g粗产物。用柱层析（硅胶，1.6%THF-己烷）来纯化粗产物，从而内酯化产物为0.98g（异构体的总纯度为4.8%）。

[0091] 实施例3：大环内酯化合物的结构确认以及感官评价

[0092] 由于得到的产物含有不纯物例如二环己基碳二亚胺，因而通过制备级气相色谱法来分离大环内酯化合物。

[0093] 首先，在乙醇溶液中溶解0.1g实施例2中得到的产物配制成10%的浓度，通过不分流进样注入5μL该溶液，从而得到色谱图。注射后，只是在保留时间内将主要产物引入制备级馏分收集器（Gerstel GmbH制造），该操作重复80次从而得到主要成分的浓缩物。用0.5ml乙醇洗脱该浓缩物，为了增加保留时间，通过常用气相色谱以7.3%、53.9%和38.8%分别分离三种成分。通过质量碎片来鉴定三种成分，为14-正丙基氧杂环十四烷-2-酮,15-乙基氧杂环十五烷-2-酮和16-甲基氧杂环十六烷-2-酮。通过感官评价确定三种成分的混合物具有舒适且出色的麝香香味，这表明为麝香酊（musk tincture）。相比市售得到的具有相同分子量的环十六内酯，本发明的产物特征在于具有强烈的甜香味，因此，可以推测支链烷基带来了更接近麝香酮散发出来的天然气味的味道。

[0094] 通过闻气相色谱（GC-嗅觉测定法）也可以确认14-正丙基氧杂环十四烷-2-酮具有麝香香味。

[0095] 16-甲基氧杂环十六烷-2-酮

[0096] MS ：254(4,M+),237(10,M+-CH3),236(51,M+-H2O),210(27,M+-HCOCH3),98(48),97(61),96(44),84(41),83(59),69(64),55(100),41(66)

[0097] 15-乙基氧杂环十五烷-2-酮

[0098] MS：254(4,M+),236(47,M+-H2O),225(41,M+-C2H5),196(29,M+-HCOC2H5),98(48),97(66),96(41),95(42),83(60),69(68),55(100),41(69)

[0099] 14-正丙基氧杂环十四烷-2-酮

[0100] MS：254(3,M+),236(41,M+-H2O),211(55,M+-C3H7),182(46,M+-HCOC3H7),111(41),98(63),97(53),83(57),69(52),55(100),43(46),41(72)

[0101] 实施例4：用于织物洗涤剂的香料组合物

[0102] 将85重量份具有如表1所述组成的香料组合物加入15重量份实施例2中得到的内酯化产物，从而可以得到用于织物洗涤剂的香料组合物，所述香料组合物的特征在于具有像花般清新感的香醇麝香香味。

[0103] 表1：

[0104]

[0105] 实施例5：顺式-6-十六碳烯酸的羟基化反应

[0106] 使用上述参考例1中制得的酶溶液来进行顺式-6-十六碳烯酸的羟基化。根据现有技术文献（非专利文献：Biosci.Biotechnol.Biochem.(2000)64,1064）中所述的方法，通过用红球菌KSM-T645菌株（P-18182）的发酵生产和纯化制得反应中使用的顺式-6-十六碳烯酸。使用纯化的顺式-6-十六碳烯酸（纯度93.3%，基于GC峰比率计算），如下进行酶促反应。

[0107] 在500mL Sakaguchi烧瓶中制备15组200mL反应液，使其含有100mM磷酸钾缓冲液（pH值8.0）、0.5g/L顺式-6-十六碳烯酸、5mM葡萄糖和50mL/L细菌细胞提取物，上述都为最终浓度，并将反应液在25℃下培养2分钟。在每个培养溶液中加入最终浓度为0.05mM+的NADP，将溶液在25℃下以120rpm培养14小时。在反应液中加入2%（v/v）浓盐酸，接着用50%（v/v）己烷提取该混合物。通过真空干燥使由此得到的提取物干燥，从而得到1.02g己烷提取物。用甲醇中14%的三氟化硼-甲醇溶液对己烷提取物中所含的羟基脂肪酸进行甲基化，再用N-三甲基硅咪唑进行三甲基硅烷化。

[0108] 如上述实施例1中在GC-MS上分析1μL该溶液。

[0109] 通过反应得到的15-羟基-6-十六碳烯酸、14-羟基-6-十六碳烯酸和13-羟基-6-十六碳烯酸的总量为460mg，各自比例为：15-羟基-6-十六碳烯酸51.3%、14-羟基-6-十六碳烯酸35.5%、13-羟基-6-十六碳烯酸13.2%。

[0110] 实施例6：羟基脂肪酸的分子内环化反应

[0111] 在170.91g氯仿中加入1.58g二环己基碳二亚胺、1.40g4-二甲基氨基吡啶、1.21g4-二甲基氨基吡啶盐酸盐。回流下使用注射泵在约15小时内在氯仿溶液中滴加含有
1.00g实施例5中得到的产物的23.0mLTHF。滴加完成后，在回流下将混合物搅拌30分钟，再冷却至室温。减压下蒸馏除去溶剂，再用乙醚稀释残留物。通过过滤分离不溶物。

[0112] 通过将过滤的溶剂真空蒸馏得到3.07g粗产物。用柱层析（硅胶，1.6%THF-己烷）来纯化粗产物，从而内酯化产物为0.89g（异构体的总纯度为47.6%）。

[0113] 实施例7：新型大环内酯化合物的结构确认以及感官评价

[0114] 由于得到的产物含有不纯物例如二环己基碳二亚胺，因而通过制备级气相色谱法来分离大环内酯化合物。

[0115] 首先，在乙醇溶液中溶解0.08g实施例6中得到的产物配制成10%的浓度，通过不分流进样注入5μL该溶液，从而得到色谱图。注射后，只是在保留时间将主要产物引入制备级馏分收集器（Gerstel GmbH制造），该操作重复80次从而得到主要成分的浓缩物。用0.1ml乙醇洗脱该浓缩物，为了增加保留时间，通过常用气相色谱以48%（两种成分重叠）和52%的比例得到三种成分的混合物。通过质量碎片来鉴定三种成分，为14-正丙基氧杂环十四碳-7-烯-2-酮,15-乙基氧杂环十五碳-7-烯-2-酮和16-甲基氧杂环十六碳-7-烯-2-酮。通过评价也可以确定三种成分的混合物具有带甜味的麝香香味，这表明是环十五内酯。

[0116] 通过闻气相色谱（GC-嗅觉测定法）也可以确认三种成分都具有麝香香味。这三种成分为新型化合物。

[0117] 得到的新型大环内酯化合物的质量碎片数据如下所示。

[0118] 16-甲基氧杂环十六碳-7-烯-2-酮

[0119] MS：252(45,M+),237(4),234(2),96(71),95(78),94(44),82(88),81(100),80(75),67(88),55(70),41(62)

[0120] 15-乙基氧杂环十五碳-7-烯-2-酮

[0121] MS：252(38,M+),234(2),223(9),96(66),95(78),94(46),82(85),81(100),80(69),79(41),67(90),55(71),41(61)