涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法和使用其的磁共振成像造影剂

摘要

本发明涉及通过用亲水材料涂覆氧化铁纳米颗粒以制备生物相容的氧化铁纳米颗粒的方法，以及包括由此制备的氧化铁纳米颗粒的磁共振成像(MRI)造影剂，所述氧化铁纳米颗粒通过使用盐粒进行退火处理而磁性提高。在亲水材料中，羧甲基葡聚糖(CM‑葡聚糖)对稳定退火的氧化铁纳米颗粒和显示造影效果而言是最有效的。

权利要求

1.涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其包括：

a)对含有磁性氧化铁纳米颗粒和盐粒的粉末混合物实施退火，所述磁性氧化铁纳米颗粒用疏水有机材料进行了表面处理，因此获得了不具有有机材料的氧化铁纳米颗粒；和b)用亲水材料涂覆所述不具有有机材料的氧化铁纳米颗粒的表面；

在b)中，涂覆所述亲水材料和移除所述盐同时进行；涂覆有亲水材料的所述氧化铁纳米颗粒具有磁性和造影效果；

附着至a)中所述氧化铁纳米颗粒的所述疏水有机材料为选自下组的至少一种：C4～C25脂肪酸、C4～C25脂肪醇和C4～C25脂肪胺；

a)中所述盐粒为选自下组的至少一种：硫酸钠(Na2SO4)、碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢钾(KHCO3)、碳酸氢钙(Ca(HCO3)2)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)和氯化钙(CaCl2)；

a)中所述氧化铁纳米颗粒和盐粒的重量比为1：10至1：1000；

通过于400～600℃在空气气氛下加热1～10hr来进行a)中所述退火；

b)中的所述亲水材料为二乙氨乙基-葡聚糖(DEAE-葡聚糖)、葡聚糖硫酸盐(DS)、羧甲基葡聚糖(CM-葡聚糖)、聚丙烯酸、淀粉、二氧化硅、聚乙二醇(PEG)或PEG-磷酸盐(PO-PEGs)。

2.如权利要求1所述方法，其中，附着至a)中所述氧化铁纳米颗粒的所述脂肪酸为油酸。

3.如权利要求1所述的方法，其中，a)中所述盐粒的直径为1～500μm。

4.如权利要求1所述的方法，其中，通过将铁络合物与C4～C25脂肪酸反应而获得a)中所述氧化铁纳米颗粒，所述铁络合物含有作为中心原子的铁和与其连接作为配位体的C4～C25有机酸基团。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述铁络合物为油酸铁。

6.如权利要求4所述的方法，其中，所述脂肪酸为油酸。

7.如权利要求1所述的方法，其中，a)中所述氧化铁纳米颗粒的直径为1～100nm。

说明书

涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法和使用其的磁

共振成像造影剂

技术领域

[0001] 本发明涉及涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其中，涂覆有机材料的单分散氧化铁纳米颗粒是亲水的，本发明还涉及包括该纳米颗粒的磁共振成像造影剂。更具体而言，本发明涉及涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其包括将涂覆有机材料的氧化铁纳米颗粒附着至盐粒上，在高温下对其进行退火以将有机材料从纳米颗粒的表面移除，并将纳米颗粒与亲水材料的水溶液混合，由此获得其表面已涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒，还涉及包括由此形成的纳米颗粒的造影剂。

背景技术

[0002] 磁性纳米颗粒已广泛用于比如细胞标记、磁共振成像(MRI)、药物递送和过热症这样的生物医学领域。在各种磁性纳米颗粒中，基于超顺磁氧化铁的纳米颗粒作为T2 MRI造影剂已得到广泛研究，因为其具有高磁化率和超顺磁性能。目前商业上可获得的T2 MRI造影剂，比如Feridex、Resovist和Combidex，是使用氯化铁还原和在亲水聚合物水溶液中共沉淀制造的(C.W.Jung,et.al.Magn.Reson.Imaging 1995,13,661)。

[0003] 然而，由此制造的氧化铁纳米颗粒具有一些缺点。因为其在水溶液中合成，因此难于进行100℃或以上的高温反应，并由于低结晶度而使磁性下降。最近，为了克服如此这些缺陷，正在对怎样改善材料磁性并开发新的T2 MRI造影剂进行深入研究。在过去十年中开发了具有一致性和高结晶度的氧化铁纳米颗粒的合成方法并且其大量生产已成为可能(J.Park,et.al.Nat.Mater.2004,3,891)。例如，据报道，锰铁氧体(MnFe2O4)纳米颗粒具有很高的磁性，因此显示了出色的T2造影效果(contrast effects)(J.-H.Lee,et.al.Nat.Med.2007,13,95)。

[0004] 然而，不同于商业上可获得的T2 MRI造影剂，在100℃或以上的高温下合成的磁性纳米颗粒不分散于水溶液中，因为其涂覆有疏水性表面活性剂。对于生物医药用途，这类疏水性磁性纳米颗粒应涂覆有生物相容的和亲水的材料，如葡聚糖、淀粉、聚乙二醇(PEG)或二氧化硅。目前，涂覆有葡聚糖的氧化铁纳米颗粒在医学上被批准为T2 MRI造影剂并被使用。然而，因为亲水的葡聚糖只分散在水溶液中，所以难于直接对涂覆有疏水性表面活性剂的纳米颗粒进行涂覆。因此，已进行了很多尝试来实现其他改变，以使得亲水的葡聚糖分散在有机溶剂中，或者在用葡聚糖涂覆之前将纳米颗粒分散在水溶液中，但是这类方法很复杂并且产量低。

[0005] 为了改变材料的结构或提高性能，从而解决上述问题，利用了退火处理。然而，在纳米颗粒的情况下，高温退火处理导致颗粒结块，由此失去了纳米颗粒的固有性能。为了避免这一副作用，最近发明了包裹-烧硬-剥落方法(wrap-bake-peel,Y.Piao,et.al.Nat.Mater.2008,7,242)，使得纳米颗粒涂覆有二氧化硅，以避免纳米颗粒在退火处理时结块。

[0006] 提出了另一种使用盐粒避免颗粒在退火处理过程中结块的方法。将具有面心四方(FCT)结构的铂-铁(Pt-Fe)纳米颗粒与过量氯化钠(NaCl)混合，随后进行高温退火处理，由此形成具有面心立方(FCC)结构的Pt-Fe纳米颗粒(D.Li,et.al.J.Appl.Phys.2006,99,08E911)。高温退火处理改变了颗粒的晶体结构并由此提高了磁性。

[0007] 在最近的方法中，移除NaCl，随后纳米颗粒分散在水溶液中，然后以半胱氨酸涂覆，从而获得非常稳定的纳米颗粒的水溶液(A.Delattre,et.al.Small 2010,6,932)。

[0008] 发明概述

[0009] 技术问题

[0010] 本发明旨在提供一种通过使用盐粒进行退火处理的新颖的亲水材料涂覆方法，目的是解决传统技术的问题，其涉及直接用亲水材料对涂覆有疏水表面活性剂的纳米颗粒进行涂覆。

[0011] 具体而言，本发明的目的是提供一种稳定性和生物相容性增加的氧化铁纳米颗粒的制备方法，其中，涂覆有机材料的氧化铁纳米颗粒经退火处理后磁性得到提高(图1)，并且经退火的氧化铁纳米颗粒涂覆有亲水材料。

[0012] 本发明的另一个目的是提供涂覆有亲水材料的、磁性和生物相容性提高的氧化铁纳米颗粒。

[0013] 本发明的又一个目的是提供含有磁性和生物相容性提高的纳米颗粒的磁共振成像(MRI)造影剂。

[0014] 技术方案

[0015] 可以通过使含有作为中心原子的铁和与其连接的作为配位体的C4～C25有机酸基团(羧酸盐)的铁络合物、C4～C25脂肪酸、C4～C25脂肪醇或C4～C25脂肪胺在150～350℃下发生反应以制备氧化铁纳米颗粒。

[0016] 制备氧化铁纳米颗粒时，可使用的铁前体优选地以连接于铁原子的C10～C22脂肪酸配位体的形式提供，且更优选的前体为油酸铁。

[0017] 制备氧化铁纳米颗粒时，同样可使用的脂肪酸和脂肪醇(或脂肪胺)优选地可包括C10～C22脂肪酸和脂肪醇(或脂肪胺)。更优选地，脂肪酸和脂肪醇可分别包括油酸和油醇，并且在脂肪胺的情况下，可使用油胺。

[0018] 氧化铁纳米颗粒制备的实施可通过从室温以至少5℃/min的加热速率来加热反应材料，例如铁络合物、脂肪酸和脂肪醇(或脂肪胺)至200～310℃，使得其在200～310℃下反应5～60min。由此制备的氧化铁纳米颗粒的尺寸可以通过调整加入的反应材料，即C4～C25脂肪酸和C4～C25脂肪醇(或脂肪胺)的摩尔比率来控制。

[0019] 另外，氧化铁纳米颗粒的制备可包括使含有铁中心原子和与其连接、作为配位体的C4～C25有机酸基团(羧酸盐)的铁络合物与C4～C25脂肪酸于290～320℃以3～3.5℃/min的加热速率反应。或者，含有铁中心原子和与其连接、作为配位体的C4～C25有机酸基团(羧酸盐)的铁络合物与C4～C25脂肪酸可首先在265～275℃下反应，然后在315～325℃下反应，从而制备氧化铁纳米颗粒。由此制备的氧化铁纳米颗粒的直径为1～100nm，且优选为2～20nm。附着至所制备的氧化铁纳米颗粒表面的疏水有机材料的种类不限于但可优选地包括选自C4～C25脂肪酸、C4～C25脂肪醇和C4～C25脂肪胺中的至少一种，且作为疏水有机材料的脂肪酸优选为油酸。

[0020] 由此制备的氧化铁纳米颗粒和盐粒的混合物在空气条件下退火，且使用蒸馏水将过量的盐从其中移除。如此，在盐被移除前，温度可以下降至室温。盐的种类不限于但可优选地包括硫酸钠(Na2SO4)、氯化钠(NaCl)、氯化钾(KCl)、氯化钙(CaCl2)、碳酸氢钠(NaHCO3)、碳酸氢钾(KHCO3)和碳酸氢钙(Ca(HCO3)2)。盐粒的平均直径为1～500μm，且优选为150μm或更少。氧化铁纳米颗粒与盐的重量比，可以就氧化铁纳米颗粒和盐粒的直径进行调整，但可优选为1：10～1：1000。包含氧化铁纳米颗粒和盐的混合物的退火处理，即使在惰性气体流，比如氮气、氩气或氖气中也是可能的，但最优选在空气中进行。在惰性气体气氛中的退火处理存在问题，因为不能很好地保持纳米颗粒的原始形状和尺寸，并且在空气下有可能有效地以二氧化碳形式从纳米颗粒表面移除疏水有机材料。退火处理的温度和空气条件的应用时间可以调整，但是优选地设置为400～600℃和1～10hr。盐的移除过程没有限制，但优选地包括可以在各种条件下进行的离心分离，例如在约13,000rpm下持续约30min。

[0021] 在退火处理和移除盐后，氧化铁纳米颗粒分散在水溶液中，这因其表面上的羟基而是可能的。随着水溶液的pH值增大，可以观察到氧化铁纳米颗粒中ζ电位(zeta potential)的变化。

[0022] 同样，为了制备在水溶液中更稳定和生物可相容的氧化铁纳米颗粒，用亲水材料作为表面涂覆材料。亲水材料的实例可包括葡聚糖衍生物、聚丙烯酸、淀粉、二氧化硅、聚乙二醇(PEG)和PEG-磷酸盐(PO-PEGs)。为了避免颗粒在移除盐的过程中结块，涂覆亲水材料和盐粒的移除同时进行(图1)。将经退火的纳米颗粒和盐粉末的混合物添加到亲水材料的水溶液中。当盐溶解在亲水材料的水溶液中同时，纳米颗粒涂覆了亲水材料。涂覆有亲水材料的纳米颗粒经离心分离而收集，且将盐的移除和涂覆亲水材料重复几次。为了在亲水材料中确定适合于稳定经退火的纳米颗粒的葡聚糖衍生物，可用各种商业上可获得的葡聚糖衍生物涂覆颗粒。涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒可用透射电子显微镜(TEM)和动态光散射(DLS)来分析。

[0023] 涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的胶体稳定性，可以根据pH、NaCl浓度和耐热性来测量。对于生物医药应用，在预定的pH下，存在预定量NaCl的条件下，纳米颗粒应是稳定的。通过测量纳米颗粒表面和涂覆材料之间的结合力，确定耐热性。稳定性试验可以用DLS从尺寸变化中观察。

[0024] 而且，可以进行涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的细胞毒性试验，并且可应用利用MDA-MB-231作为乳腺癌细胞的MTT方法。

[0025] 另外，作为磁共振成像(MRI)造影剂的涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的适用性可通过动物MRI测试确定。

[0026] 有益效果

[0027] 根据本发明，高温退火处理能够增大纳米颗粒的结晶度，以提高氧化铁纳米颗粒的磁性。同样，用亲水材料涂覆氧化铁纳米颗粒，从而确保高稳定性和生物相容性，并且在各种亲水材料中，带负电的羧甲基葡聚糖(CM-葡聚糖)对于涂覆纳米颗粒从而使其稳定而言是非常有效的。由于其磁性提高和在涂覆过程中用葡聚糖壳体涂覆一个或多个纳米颗粒，涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的造影效果是出众的。

附图说明

[0028] 根据结合所附附图给出的优选实施方案的描述，本发明的以上和其他目的、特点和优势将变得显而易见，其中：

[0029] 图1示出了包括使用盐粒对氧化铁纳米颗粒退火和另外用亲水材料对其涂覆的过程；

[0030] 图2示出了10nm大小的氧化铁纳米颗粒的TEM图像；

[0031] 图3示出了退火处理之前和之后的氧化铁纳米颗粒的TEM图像，其中，左图示出了退火处理之前的氧化铁纳米颗粒，右图示出了退火处理之后的氧化铁纳米颗粒；

[0032] 图4示出了退火处理之前和之后的氧化铁纳米颗粒的X-射线衍射(XRD)数据；

[0033] 图5示出了退火处理之前和之后的氧化铁纳米颗粒的颜色；

[0034] 图6为示出退火处理之前和之后的氧化铁纳米颗粒的磁性数据的曲线图；

[0035] 图7示出了涂覆有葡聚糖硫酸盐(DS)的氧化铁纳米颗粒的TEM图像和示出其流体力学直径的曲线图；

[0036] 图8示出了涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的TEM图像和示出其流体力学直径的曲线图；

[0037] 图9为示出涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒的稳定性测试结果的曲线图；

[0038] 图10为示出涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的稳定性测试结果的曲线图；

[0039] 图11示出了涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒关于pH值变化的样品照片和示出其ζ电位的曲线图；

[0040] 图12示出了涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒关于NaCl浓度变化的样品照片；

[0041] 图13示出了涂覆有聚丙烯酸的氧化铁纳米颗粒的TEM图像；

[0042] 图14示出了涂覆有PEG-磷酸盐(PO-PEGs)的氧化铁纳米颗粒的TEM图像和示出其流体力学直径的曲线图；

[0043] 图15为涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒和涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的细胞毒性实验结果曲线图；

[0044] 图16示出了使用涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的MRI结果；

[0045] 图17为示出了涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的磁测数据的曲线图；和[0046] 图18示出了使用涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的动物试验MRI结果。

具体实施方式

[0047] 下文中，将参考所附附图给出本发明优选实施方案的详细说明。

[0048] 下面所描述的实施例旨在说明本发明但不应解释为是对本发明的限制，其可以提供对本发明的更好理解，并且可以由本领域技术人员在本发明保护范围内进行适当修改或变化。

[0049] 因此，本发明旨在涵盖由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的所有修改、等效物和替代方案。

[0050] 使用Jeol EM-2010显微镜进行透射电子显微检查(TEM)，并且使用Rigaku D/Max-3C衍射仪进行X-射线衍射(XRD)。使用粒度分析仪(ELS-Z2,Otsuka)测量流体力学直径和ζ电位，并且使用振动样品磁强计(VSM,Quantum Design PPMS)确定M-H曲线。

[0051] (制备实施例)

[0052] 氧化铁纳米颗粒的合成

[0053] 根据J.Park et al.Nat.Mater.2004,4,891中公开的方法，由在100L试验工厂中制备的油酸铁络合物合成氧化铁纳米颗粒。该油酸铁络合物通过使油酸钠与六水合氯化铁(FeCl36H2O)反应获得。具体而言，将1.08kg六水合氯化铁与3.65kg油酸钠与溶剂混合物混合，该溶剂混合物含有6L水、8L乙醇和14L己烷，并在约60℃下剧烈搅拌反应1hr。透明下层从分离的两层中移除，将剩下的褐色有机层与水混合，其后水层再次被移除，从而移除剩下的盐溶液。这一水洗过程被重复三次。己烷溶剂从净化的络合物溶液中蒸发，从而获得油酸铁络合物。

[0054] 将由此获得的3.6kg(4mol)油酸铁络合物和0.57kg(2mol)油酸与20kg的1-十八烯混合，其后将得到的混合物以10℃/min的加热速率加热至310℃，使得其在310℃下反应60min，冷却至室温，从而用己烷与丙酮比率为1:4的溶液混合物使其沉淀，然后进行离心，产生氧化铁纳米颗粒。使用TEM的合成氧化铁纳米颗粒分析显示了10nm的直径(图2)。

[0055] (实施例1)

[0056] 通过对包含氧化铁纳米颗粒和盐粒的混合物进行退火处理制备不具有有机材料的氧化铁纳米颗粒，并测量不具有有机材料的氧化铁纳米颗粒的磁性和流体力学直径[0057] 将由此合成的50mg氧化铁纳米颗粒和25g硫酸钠(Na2SO4)(平均粒径为150μm)以1:500的重量比在己烷中搅拌。温度上升的同时，己烷缓慢蒸发。其后，在空气条件下将纳米颗粒的粉末混合物和盐在500℃下加热5hr。在退火处理后，将过量的盐溶解在蒸馏水中，并经过在13,000rpm下离心30min而被移除。为了充分移除盐，重复若干次使用蒸馏水的冲洗和离心。

[0058] 对通过使用盐粒进行退火处理移除了有机材料的氧化铁纳米颗粒的物理性能变化进行了分析。没有观察到在退火处理时由于颗粒结块使粒径增大(图3)。通过XRD对退火的纳米颗粒的晶体结构进行了分析(图4)。所合成的氧化铁纳米颗粒的XRD图样与磁铁矿(Fe3O4,JCPDS 19-0629)的XRD图样一致。如此，JCPDS(粉末衍射标准联合委员会,Joint Committee on Powder Diffraction Standwards)为从1969年起收集和分类的材料的衍射数据的文档，其中每个衍射图样记录在每个卡片上，因此用作根据测量的XRD图样确定材料的晶体结构的参考。在退火处理后的纳米颗粒的XRD图样与退火处理前的纳米颗粒的XRD图样相似。因为小的纳米颗粒具有增大XRD峰宽度的趋向，具有相似XRD图样的磁铁矿和磁赤铁矿(γ-Fe2O3,JCPDS 25-1402)通过XRD分析难于清楚地彼此区别。通常，当磁铁矿在空气条件下退火时，其可能通过额外氧化变成磁赤铁矿或赤铁矿(α-Fe2O3)。然而，赤铁矿(JCPDS 24-0072)的XRD图样显然与磁铁矿或磁赤铁矿的XRD图样不同。退火处理后的氧化铁纳米颗粒是褐色的，而退火处理前的氧化铁纳米颗粒是黑色的(图5)。经退火的氧化铁纳米颗粒通过额外氧化以磁赤铁矿出现。为了分析退火处理前和退火处理后的磁性变化，使用VSM测量样品的磁性。在退火处理前，饱和磁化为78emu/g[Fe]，在退火处理后为103emu/g[Fe](图6)。这被认为是因为经过高温退火处理颗粒的结晶度增加，由此影响磁性增加。

[0059] 经退火的氧化铁纳米颗粒分散在水溶液中，从而增加水溶液的pH值，使得观察到氧化铁纳米颗粒的ζ电位从正电荷向负电荷变化，因此流体力学直径也发生改变(表1)。在pH 7时，经退火的纳米颗粒的ζ电位较小，并且因为不存在用于稳定其表面的表面活性剂，颗粒具有结块和下沉的趋向。不同于在酸性或碱性条件下，在pH 7时测量的纳米颗粒的流体力学直径，观察到超过了1μm(表1)。

[0060] 表1

[0061] [表1]

[0062]pH 流体力学直径(nm) ζ电位(mV)
3 39.2 38.6
7 1555.9 -10.73
10 76.5 -34.99

[0063] (实施例2)

[0064] 通过对包含氧化铁纳米颗粒和盐粒的混合物进行退火处理制备涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒，并测量涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的流体力学直径和稳定性[0065] 除了氧化铁纳米颗粒涂覆有亲水材料之外，含有氧化铁纳米颗粒和盐粒的混合物以与实施例1相同的方式退火。具体而言，将1g亲水材料(表2)溶解在250ml蒸馏水中。搅拌亲水材料的水溶液同时，将12.5g退火的氧化铁纳米颗粒和盐粉末以1:12.5的重量比缓慢加入。涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒以13,000rpm离心30min进行分离。使用亲水材料的水溶液进行额外清洗并离心，再重复两次。

[0066] 表2

[0067] [表2]

[0068]种类 分子量
羧甲基葡聚糖钠盐(CM-葡聚糖) ～12,000
葡聚糖 ～1,500
二乙氨乙基-葡聚糖盐酸盐(DEAE-葡聚糖) ～500,000
葡聚糖硫酸盐钠盐(DS) ～4,000
聚丙烯酸 1,800
PEG 2,805
PO-PEGs 2,000(mPEG)

[0069] 为了测量涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的形状和直径，进行了TEM和DLS分析。涂覆有带正电荷的DEAE-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒有效地分散在水溶液中，且其流体力学直径为84.3nm(表3)。然而，因为分子量较大，商业上可获得的DEAE-葡聚糖的涂覆效率较低。在带负电荷的葡聚糖衍生物中，用DS和CM-葡聚糖涂覆纳米颗粒，并且涂覆的氧化铁纳米颗粒在水溶液中经过1个月以上也是稳定的。TEM图像显示，在用DS和CM-葡聚糖涂覆的过程中，颗粒没有结块(图7和8)。涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒的流体力学直径为36.8nm(表3)，其类似于涂覆有PEG-磷脂的氧化铁纳米颗粒的值(28.7nm)(表3)。然而，涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的流体力学直径为66.4nm，其远大于涂覆有DS或涂覆有PEG-磷脂的氧化铁纳米颗粒的流体力学直径(表3)。因此，在CM-葡聚糖的情况下，一个或更多的纳米颗粒被认为是一起涂覆。为了比较，用无电荷的葡聚糖涂覆纳米颗粒。被涂覆的颗粒的流体力学直径超过了100nm(表3)，且观察到该颗粒易于随着时间下沉。由此，纳米颗粒和涂覆材料之间的静电作用被认为影响了颗粒的涂覆效率和稳定性。在各种葡聚糖衍生物中，带负电荷的葡聚糖对于涂覆是有效的，并且特别是涂覆有DS的纳米颗粒代表了最小的流体力学直径。

[0070] 为了验证涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的胶体稳定性，观察一旦pH值变化和一旦加热时氧化铁纳米颗粒的直径变化。涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒在pH4-11范围内是稳定的(图9)。同样，涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒在100℃下经过4hr没有尺寸的变化。然而，涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒在NaCl溶液中不稳定，因此观察到下沉。涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒在pH4-13范围内是稳定的，但是纳米颗粒在pH3处变得不稳定并观察到快速下沉(图10和11)。测量ζ电位表明，已经稳定的纳米颗粒具有-23.74～-36.88mV的值，但是在pH3处电位值为1.81mV(图11)。这些结果显示，约pH3被认为是等电位点，且ζ电位下降，由此纳米颗粒变得不稳定。因此，可见静电作用(排斥力)对纳米颗粒的稳定性作出贡献。涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒在100℃下经过4hr也没有尺寸变化。这类纳米颗粒是稳定的，直到NaCl浓度为0.15M(图10和12)。由此，可见涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒的稳定性适合于医药应用。涂覆有DS的纳米颗粒在NaCl溶液中不稳定，因此不适合于医药应用。

[0071] 因为聚丙烯酸(Mw 1,800)溶液是酸性的，所以涂覆有聚丙烯酸的氧化铁纳米颗粒在盐被移除后立刻在水溶液中具有低的分散性。由于通过加入氢氧化钠(NaOH)而pH增大，提高了分散性，减小了流体力学直径(表4)。这是因为形成聚丙烯酸的羧酸在碱性条件下是带负电荷的。在酸性条件下流体力学直径为91.9nm，在中性条件下为59.4nm，而在碱性条件下为39.9nm。如TEM图像所示，当涂覆聚丙烯酸时，颗粒不结块(图13)。

[0072] 涂覆有PEG-磷酸盐(PO-PEGs)的氧化铁纳米颗粒在水溶液中能很好地分散。如TEM图像所示，在涂覆PO-PEGs时，颗粒不结块，并且其流体力学直径为69.2nm(图14)。

[0073] (实施例3)

[0074] 通过使用小盐粒进行退火处理制备涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒

[0075] 涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒以与实施例2相同的方式制备，除了盐的粒径为13μm之外。涂覆有DS的氧化铁纳米颗粒的流体力学直径为31.03nm(表3)。

[0076] 表3

[0077] [表3]

[0078]  亲水材料 流体力学直径(nm)
例2 DEAE-葡聚糖 84.3
例2 DS 36.8
例2 葡聚糖 157.0
例2 CM-葡聚糖 66.4
例2 PEG-磷脂 28.7
例3 DS(盐粒尺寸：13μm) 31.03

[0079] 表4

[0080] [表4]

[0081]pH 流体力学直径(nm)
2 91.9
8 59.4
12 39.9

[0082] (实施例4)

[0083] 涂覆有葡聚糖衍生物的氧化铁纳米颗粒的细胞毒性试验

[0084] 使用MTT方法测量涂覆有DS和涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒。将不同浓度下的氧化铁纳米颗粒在细胞中培养48hr，其后测量细胞的存活率。结果，几乎所有细胞在高达200μg[Fe]/ml的浓度下是存活的(图15)。

[0085] (实施例5)

[0086] 涂覆有葡聚糖衍生物的氧化铁纳米颗粒作为MRI造影剂的适用性试验[0087] 因为出众的稳定性，使用CM-葡聚糖替代DS涂覆氧化铁纳米颗粒。分散在水溶液中的纳米颗粒的T2 MRI图像显示，信号下降与铁离子浓度的增加成比例(图16)。为了评估造影效果，计算r2驰豫率，其为相对于造影剂浓度的T2驰豫时间倒数的斜率。这是显示T2驰豫时间依赖于造影剂浓度的变化有多敏感变化的指标。r2驰豫率由1/T2＝1/T20+r2*C计算，其中T2为T2驰豫时间，T20为初始T2驰豫时间，且C为造影剂浓度。n为绘制点，其中包括涂覆有亲水材料的氧化铁纳米颗粒的造影剂浓度设定在x-轴上，且在上述浓度下测量的1/T2设定在y-轴上，r2由斜率导出，其中r2表示r2驰豫率。未经过退火处理的涂覆有PEG-磷脂的氧-1 -1化铁纳米颗粒的驰豫率为124.46mM s ，而涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒在退火处理后的驰豫率为358.9mM-1s-1，其增大2.9倍。这样的高驰豫率是基于在退火处理期间结晶度增大，以及在用CM-葡聚糖涂覆的过程中用单个葡聚糖外壳涂覆多个颗粒。如实施例1所述，因为额外的结晶化，退火处理后的饱和磁化强度增大。即使在用CM-葡聚糖涂覆后，饱和磁化(106emu/g[Fe])也类似于退火处理后(图17)。当分散的超顺磁的纳米颗粒结块时，据报道，r2驰豫率的增大以磁性驰豫转换为基础(J.M.Perez,et.al.Chem.Bio.Chem.2004,5,
261)。当以这种方式使用具有高造影效果的材料时，在体内引入的纳米颗粒的量可以降低，因此降低了毒性作用。所以，确定涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒被可用作具有高造影效果的生物可相容的MRI造影剂。

[0088] 将涂覆有CM-葡聚糖的氧化铁纳米颗粒用于动物MRI试验。纳米颗粒(每kg的老鼠体重为2.5mg[Fe])经由老鼠的尾静脉被注入。在注入纳米颗粒之前和之后的MRI结果显示，纳米颗粒积聚在肝脏和脾脏中，因此获得了有效的对比度(图18)。经证实，这些纳米颗粒适于体内应用。