一种乳清蛋白膜及其制备方法

摘要

本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种乳清蛋白膜及其制备方法。该乳清蛋白膜是通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油制得成膜液，成膜液于45-50℃水浴加热0.5-2h，冷却至室温后，加入重组脂肪氧合酶及亚油酸，超声脱气后,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，室温（20-25℃）反应2-3h，50-55℃干燥36-48h揭膜。本发明以乳清蛋白为基料，以甘油为增塑剂，通过添加重组鱼腥藻脂肪氧合酶作为交联剂所制备的乳清蛋白膜，绿色可食用，拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性均表现出良好的性质。

权利要求

1.一种乳清蛋白膜的制备方法，其特征在于通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油制得成膜液，成膜液于45-50℃水浴加热0.5-2h，冷却至20-25℃后，加入重组脂肪氧合酶及亚油酸，超声脱气后, 倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中， 20-25℃反应2-3h，50-55℃干燥

36-48h揭膜；所述的重组脂肪氧合酶通过如下方法制备：

（1）以鱼腥藻基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.5的ana-Lox -F和序列为SEQ ID NO.6的ana-Lox -R为引物合成含有SacI 和XhoI 酶切位点的脂肪氧合酶基因序列；

（2）将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI 双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有ana-Lox基因的表达质粒pET-23a-ana-Lox；

（3） 将含有ana-Lox表达质粒pET-23a-ana-Lox转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃ 180rpm振荡2-3小时至OD600为0.6时加IPTG 100μg/ml诱导，5小时后离心收集菌体；

（4）将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4 ℃，10

000×g离心10 min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化。

2.根据权利要求1所述的乳清蛋白膜的制备方法，其特征在于成膜液中乳清蛋白的质量百分含量为8%-12%，甘油与乳清蛋白质量比例为1:4-1:5，重组脂肪氧合酶添加量为90U/g-110 U/g成膜液，亚油酸浓度为0.8μmol/g-1.2μmol/g成膜液，成膜液pH为

5.5-6.5。

3.根据权利要求2所述的乳清蛋白膜的制备方法，其特征在于所述的重组脂肪氧合酶为重组鱼腥藻脂肪氧合酶，该重组鱼腥藻脂肪氧合酶通过如下方法制备：（1）以鱼腥藻基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.5的ana-Lox -F和序列为SEQ ID NO.6的ana-Lox -R为引物合成含有SacI 和XhoI 酶切位点的脂肪氧合酶基因序列；

（2）将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI 双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有ana-Lox基因的表达质粒pET-23a-ana-Lox；

（3） 将含有ana-Lox表达质粒pET-23a-ana-Lox转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm 30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃ 180rpm振荡2-3小时至OD600为0.6时加IPTG 100μg/ml诱导，5小时后离心收集菌体；

（4）将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4 ℃，10

000×g离心10 min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化。

4.权利要求1~3中任一项所述的制备方法制备的乳清蛋白膜。

说明书

一种乳清蛋白膜及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于食品工业生物技术领域，涉及一种乳清蛋白膜及其制备方法。

背景技术

[0002] 塑料制品自产生以来给社会带来巨大方便的同时，它也给人类生存环境带来极大威胁。这种用高分子化学聚合材料制成的包装不仅难以降解，还会因燃烧产生污染气体。随着人们对环保意识的增强，采用天然绿色材料来制备可食用的包装膜成为许多研究者的焦点。可食性包装材料是以天然可食性物质，如蛋白质、多糖（淀粉、纤维素）等为原料，通过分子间相互交联作用形成的具有多孔网状的结构，可食用、易降解，并具有一定包装保护功能。

[0003] 但是目前可食用包装膜应用并不广泛，无法取代塑料的使用，究其原因，主要是制备的可食用膜性能无法同化学聚合物塑料相比，例如拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性、软产品（包装膜）多硬产品（包装盒）少；另外成本问题也是制约其发展的一个因素。造成上述两方面的问题的原因正是可食性包装材料的核心问题之一是仍未寻找到良好的起到分子间相互交联作用的交联剂。目前早期在有关交联剂、增塑剂的研究方面以无机试剂为主，如氨水、CMC-Na、聚醇环氧氯丙烷、二元羧酸、NaH2PO4等。上述研究结果，虽然在一定程度上提高了食品包装材料的性能，但是仍不能与化学材料媲美。另外，所采用的无机试剂交联剂也给“绿色”蒙上了阴影。酶制剂作为一种纯天然生物制品，具有催化效率高的本质，其本身就是蛋白质，经食品加工后，变性为无毒无害的食品组分，酶制剂是标准的绿色食品添加剂。因此，利用酶催化蛋白、多糖的交联作用，以酶制剂作为可食性包装材料的交联剂将是必然趋势。近年来，因LOX(Lipoxygenase,EC1.13.11.12,LOX)能够催化大豆蛋白强烈的聚集作用，而引起已国内外学者的广泛关注。

[0004] LOX属于氧化还原酶，广泛存在于植物体中，它的结构中含有非血红素铁，能专一催化含顺，顺－1，4－戊二烯的多不饱和脂肪酸及酯，通过分子加氢，形成具有共扼双键的氢过氧化衍生物，这些氢过氧化物性质活泼，是重要的化学反应中间体。LOX对于它作用的底物具有特异性的要求，需要含有顺，顺－1，4－戊二烯的直链脂肪酸、脂肪酸酯和醇等。例如，LOX通过与其天然底物亚油酸作用，是处于未活化状态的酶中的还原态的Fe变成氧化态的Fe，从而使酶激活，活化态的酶通过催化亚油酸诱导蛋白聚集的机理主要包括以下几个方面：一是中间产物自由基导致蛋白质分子的聚合，即亚油酸过氧化初级产物主要是氢过氧化物的裂解产生脂质自由基，脂质自由基作为引发剂通过抽氢使蛋白质分子变成自由基，后者引发聚合式链反应，导致蛋白质分子的聚合；二是亚油酸氧化的次生产物等导致蛋白质分子的交联，即亚油酸过氧化次生产物中的醛类化合物可与蛋白质分子的氨基等侧链基团发生作用导致多肽链的链内交联和链间交联；三是蛋白质分子的重新组装，即在脂质自由基和脂质过氧化的醛类产物进攻下参与反应的蛋白质，进一步通过疏水相互作用、静电相互作用和氢键等的作用，形成高分子的蛋白质聚集体。以上说明重组ana-LOX具有作为交联剂制备包装膜的潜力，而目前这方面的研究还未有报道。

发明内容

[0005] 本发明的目的是针对现有技术的上述，提供一种乳清蛋白膜的制备方法。

[0006] 本发明的目的可通过如下技术方案实现：

[0007] 一种乳清蛋白膜，其特征在于该乳清蛋白膜是通过在纯水中加入乳清蛋白、甘油制得成膜液，成膜液于45-50℃水浴加热0.5-2h，调节pH值，冷却至室温后，加入ana-LOX及亚油酸，超声脱气后,倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，室温（20-25℃）反应2-3h，50-55℃干燥36-48h揭膜。

[0008] 其中，所述的成膜液中乳清蛋白的质量百分含量为8%-12%，甘油与乳清蛋白质量比例为1:4-1:5，重组ana-LOX酶量为90U/g-110U/g成膜液，亚油酸浓度为0.8μmol/g-1.2μmol/g成膜液，成膜液pH为5.5-6.5，反应温度为20-25℃，反应时间为2-3h，50-55℃干燥36-48h揭膜。

[0009] 所述的LOX为重组鱼腥藻ana-LOX，该重组鱼腥藻ana-LOX通过如下方法制备：

[0010] （1）以鱼腥藻基因组DNA为模板，序列为SEQ ID NO.3的ana-LOX-F和序列为SEQ ID NO.4的ana-LOX-R为引物合成含有SacI和XhoI酶切位点的LOX基因序列；

[0011] （2）将上一步纯化的PCR产物经SacI、XhoI双酶切后插入载体pET-23a的SacI/XhoI酶切位点之间，获得含有ana-LOX基因的表达质粒pET-23a-ana-LOX；

[0012] （3）将含有ana-LOX表达质粒pET-23a-ana-LOX转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS，在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100mlLB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导，5小时后离心收集菌体；

[0013] （4）将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液重悬菌体，超声波破碎菌体，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液，将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书进行纯化。

[0014] 所述的成膜液中乳清蛋白的质量百分含量10%，甘油与乳清蛋白比例进一步优选1:4，重组ana-LOX酶量进一步优选100U/g成膜液，亚油酸浓度进一步优选1μmol/g成膜液，成膜液pH进一步优选6。

[0015] 所述的制备乳清蛋白膜的方法进一步优化为：称取乳清蛋白粉溶于超纯水中配制成质量百分含量10%，甘油与乳清蛋白比例进一步优选1:4于搅拌过程中缓慢加入获得成膜液，磁力搅拌使其充分溶解后用NaOH或HCl溶液调节pH至6，将成膜液至于45℃恒温水域中加热1h，待成膜液冷却后，加入重组ana-LOX，酶量优选100U/g成膜液，亚油酸浓度优选1μmol/g成膜液，超声波脱气处理，倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，室温20℃反应2h，55℃干燥36h揭膜。

[0016] 有益效果：

[0017] 本发明以乳清蛋白为基料，以甘油为增塑剂，通过添加重组鱼腥藻脂肪氧合酶作为交联剂所制备的乳清蛋白膜，绿色可食用，拉伸强度、透光性、吸水度、可塑性均表现出良好的性质，性能优于利用商品大豆脂肪氧合酶和未用酶处理的对照组，具有重要的应用价值。

附图说明

[0018] 图1不添加亚油酸，不添加酶的乳清蛋白成膜效果

[0019] 图2添加重组重组ana-LOX的乳清蛋白成膜效果，

[0020] 图3添加亚油酸的乳清蛋白成膜效果

[0021] 图4添加重组ana-LOX、亚油酸的乳清蛋白成膜效果。

具体实施方式

[0022] 实施例1：鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)LOX基因克隆

[0023] 离心收集鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)菌体，用上海生工基因组DNA提取试剂盒提取鱼腥藻的基因组DNA。

[0024] 根据NCBI公布的基因组序列（NC_003267）设计出两个引物:

[0025] 上游引物：5′-GGAGTGTCTGGTGCC-3′(SEQ ID NO.3)

[0026] 下游引物：5′-CTAAATGTTGATACTCATCAT-3′(SEQ ID NO.4)

[0027] 在50μl体系中，引物终浓度各为1μM，dNTPs终浓度为0.2mM,鱼腥藻基因组DNA 10ng，2U Pfu DNA聚合酶。扩增程序为94℃ 3min；30×(94℃ 30s,59℃ 50s,72℃40s)；72℃ 10min。琼脂糖凝胶电泳，切胶，采用上海生工试剂盒回收，将回收的PCR产物与TaKaRa pMD19-T vector连接，转化E.coli DH5α，涂于含有IPTG、X-gal、氨苄青霉素的LB平板，37℃培养13-14小时，挑白色菌落，振荡培养，提取质粒，确定连接成功后送到上海生工测序。用计算机软件DNAMAN分析测序结果，得到一个1368bp的ORF，即鱼腥藻脂肪氧合酶基因ana-Lox，序列为SEQ ID NO.1，编码一个由455个氨基酸组成的蛋白质，序列为SEQ ID NO.2。

[0028] 实施例2：鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)ana-LOX基因表达载体的构建[0029] 根据获得的LOX基因序列，设计两个引物，上游引物加上SacI识别序列，下游引物加上XhoI识别序列(下划线部分为限制酶识别序列):

[0030] 上游引物ana-LOX-F：5′-CGCGAGCTCGGAGTGTCTGGTGCC-3′(SEQ ID NO.5)[0031] 下游 引物 ana-LOX-R：5 ′-CCGCTCGAGCTAAATGTTGATACTCATCAT-3′ (SEQ ID NO.6)

[0032] 按照下列PCR体系加入各成分，扩增LOX基因:

[0033]

[0034] PCR程序为94℃ 2min；30×(94℃ 45s;58℃ 50s；72℃ 4min)；72℃ 10min。

[0035] 用上海生工PCR产物纯化试剂盒纯化PCR产物，加SacI、XhoI双酶切，灭活，乙醇沉淀，ddH2O重溶，与适量的用相同限制酶消化的载体pET-23a连接，转化大肠杆菌DH5α。从转化平板上随机挑取几个菌落，接入LB液体培养基，振荡培养，小量提取质粒，电泳，以电泳滞后的质粒为模板进行PCR验证，确定连接成功后送到上海生工测序。

[0036] 实施例3：鱼腥藻(Anabaena sp.PCC 7120)LOX基因在大肠杆菌中的表达[0037] 将含有ana-LOX表达质粒pET-23a-ana-LOX转化大肠杆菌表达宿主菌株BL21(DE3)pLysS（购自Novagen公司），在37℃培养10-11小时后挑取小菌落,接入含有氨苄青霉素的50ml LB液体培养基，70-90rpm30℃培养过夜,按照1:40的体积比取种子液加入到含有氨苄青霉素的100ml LB液体培养基,35℃180rpm振荡2-3小时至OD600约为0.6时加IPTG(终浓度100μg/ml)诱导。5小时后离心收集菌体。

[0038] 实施例4：重组ana-LOX的分离纯化

[0039] 将诱导表达收集到的菌体，用磷酸缓冲液(50mmol/L PBS+0.3mol/L NaCl+0.5％ TritonX-100)重悬菌体，超声波破碎菌体(400W，超声5s，间歇10s，共超声15min)，4℃，10000×g离心10min，收集上清液作为粗酶液。将处理得到的粗酶液按照Ni-NTA His Tag Kit说明书依次用含不同浓度咪唑(50mmol/L、100mmol/L、150mmol/L、200mmol/L)的洗脱液洗脱Ni-NTA柱，收集洗脱峰，测定重组ana-LOX活性。

[0040] 实施例5：重组ana-LOX活力测定

[0041] 重组ana-LOX活性分析用亚油酸钠作为底物。酶反应体系中含有：pH6.0的磷酸缓冲液2.79mL，酶液10μL，亚油酸钠200μL，混匀后放入35℃水浴中并开始计时，反应3min后测定吸光度。酶活单位定义：在上述条件下以1min内3mL反应体系在234nm的吸光度增3
加0.001作为一个酶活力单位U。经Ni-NTA柱分离纯化的酶活为：13.72U×10/mg。

[0042] 实施例6：乳清蛋白包装膜的制备流程

[0043] 称取10g乳清蛋白粉（WPC，蛋白质含量80%）溶于100ml的超纯水中，并缓慢搅拌加入相当于乳清蛋白质量的1/5的甘油（甘油，分析纯），磁力搅拌使材料充分溶解后用2mol/L的NaOH或HCl溶液调节pH，将成膜液置于45℃恒温水浴锅中加热1h，待成膜液冷却至室温后，加入重组ana-LOX和亚油酸，加入的重组ana-LOX酶量为100U/g成膜液，亚油酸浓度为1μmol/g成膜液，超声波脱气处理，倒入铺有塑封膜的玻璃培养皿中，20℃反应2h，
55℃干燥36h揭膜。

[0044] 实施例7：乳清蛋白膜性能的测定

[0045] 膜感官指标的测定：感官评定膜的颜色，表面光滑度以及膜的黏性，是否易揭膜。

[0046] 膜厚度（mm）的测定：在被测膜上随机（除膜的最边缘）取五个点，用电子数显卡尺测量其厚度，取其平均值并记录。

[0047] 膜折痕(FM)的测定：将膜对折，依据折痕程度来判断膜的折痕，用0-4作为指标，0表示无折痕，1表示折痕轻微，2表示膜折痕明显，3表示膜对折后部分断裂，4表示膜对折的部分全部断裂。

[0048] 透光率的测定：将试样裁成一定规格(0.8mm*4.5cm)的长方形，贴入比色皿的内光滑面，在500nm的波长下测定其透射比即透光率，以空比色皿作为对照。每个试样做2个平行。

[0049] 膜水溶性测定：将膜样(2cm×2cm)在105℃条件下干燥至恒重,称重后根据干、湿重之差计算水分含量.将测定完水分含量的膜放入盛有30mL水的烧杯中,在室温下溶解24h,再将膜在105℃条件下干燥至恒重,称重,根据两次干重之差计算水溶性.[0050] 水蒸气透过率测定:取直径3cm、深4cm的圆形敞口塑料杯,加入3g干燥的CaC12,将裁切成直径7cm的膜样品,盖住杯口,膜与杯之间的接口用石蜡封住。而后将各杯置于底部加入1000mL的蒸馏水的干燥器中(25℃,相对湿度100%)。每12h称量1次,持续1周。通过杯重的增加量确定水蒸气的透过量。按ASTM方法(E96-93,1993)计算水蒸气转移速率(WVTR)和水蒸气透过率(WVP)。

[0051] 机械性能测定：将薄膜裁剪成4cm*2cm规格的长条，并固定于物性仪上测定。设置物性仪两夹具的初始距离为20mm，速度为1mm/sec。测定结束后，记录膜拉断瞬间的力(g)和膜断裂时两夹具的距离L。每个试样取三个平行样品测定。

[0052] 拉伸强度TS(g)：用膜拉断时瞬间的力表示拉伸强度。

[0053] 断裂伸长率E(%)按下式计算：

[0054] E＝(L1－L0)/L0

[0055] 式中：E—膜的断裂伸长率(%)；

[0056] L1—膜断裂时两夹夹具的距离(mm)；

[0057] L0—两夹具初始时的距离(mm)。

[0058] 按照上述方法，对重组ana-LOX、大豆脂肪氧合酶（sigma公司产品，100U/g成膜液，制备方法同实施例7）、未加酶对照三种方法制备的乳清蛋白膜性能指标对比如表1：

[0059] 表1不同处理制备的乳清蛋白膜性能

[0060]