一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法

摘要

本发明提供了一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法，是将处于增殖后期，具有中性脂累积代谢能力的微藻处于400-550nm光波条件下进行中性脂累积培养。本发明的方法在获得第一步细胞增殖培养至最大生物量的前提下，通过对藻液的降温以及光照条件的协同作用，使微藻中性脂代谢短期快速响应，实现促进和提高中性脂累积效率和累积量的目的。所述蓝色滤光膜为塑料胶片，可规模化应用与改装。所述氮限制胁迫条件是通过氮磷比逆转调节，不需要微藻和介质的分离过程即可实现。可简化规模化生产中的工艺流程。

权利要求

1.一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法，其特征在于，是将处于增殖后期，具有中性脂累积代谢能力的假微型海链藻处于400-550nm光波条件下进行中性脂累积培养；其具体步骤如下：首先进行第一步细胞增殖培养：将藻接种于海水培养液中，在温度为22-30℃，光照条件为2000-6000lx的条件下培养，培养至平台期最大密度2-3天时，进行第二步培养；

第二步中性脂累积培养：将培养至平台期最大密度的藻液转移至温度为10-20℃、以蓝色滤光膜滤光获得波长为400-550nm、2000-6000lx照度、光暗比12:12的条件下进行中性脂累积培养，同时在培养液中以1:1000的比例添加浓度为5g/L的磷酸二氢钠溶液，继续培养5-7天采收；所述的海水培养液的组成如下：KNO3100mg/L、K2HPO410mg/L、MnSO40.25mg/L、FeC6H5O72.5mg/L、Na2EDTA 20mg/L、VB120.5mg/L、VB15mg/L。

2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的400-550nm光波条件，是用蓝色材质的透光材料或容器形成的。

3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于所述的蓝色材质的透光材料为蓝色滤光膜。

说明书

一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于富油微藻培养技术领域,具体涉及一种促进自养微藻中性脂累积的培养方法。

背景技术

[0002] 在全球能源危机的冲击下，人类寻找环境生态友好的新型可再生能源的研究已经广泛开展起来。自养单细胞微型藻类以其生长快、生物量高、协同生态效应优异等特点，成为新能源的重要材料。其中，微藻细胞中，中性脂贮藏总量超过干重20% 的微藻，是具有开发潜力的产油微藻。

[0003] 微藻的中性脂累积代谢是在藻类增殖后期受多种条件因子的胁迫影响而进行累积的，因此，细胞增殖培养与中性脂累积的条件往往是相互矛盾的。目前生产培养过程通常分别采用营养细胞增殖培养以及中性脂累积培养的两步法进行，第一步中提供微藻增殖的最优化条件，确保获取微藻最高效最大生物量；第二步则提供抑制营养生长但促进中性脂累积的条件，在最优化维持高生物量的条件下，进一步提高单位细胞中性脂的累积。

[0004] 研究发现多种环境因子可调控能源微藻生物量的增加以及油脂的积累，包括营养盐、温度、CO2浓度、光照等。其中，光照是最重要的因子之一，光照强度、周期以及有效辐射等对藻类光合作用的效率、细胞生长、物质代谢途径等方面具有显著的调控作用。为了实现微藻进行新能源的开发利用，各国对巨大的微藻资源进行了多方面的研究，包括种质筛选及检测方法、大量培养条件、大量富集油脂的条件、收集方法及装置、提取方法及装置等等。例如专利公开号为CN103146582A的发明专利“一种富油微藻的高通量筛选方法”，就公开了一种对微藻种质的筛选方法。专利公开号为CN103163113A的发明专利“一种超声辅助荧光染色检测微藻油脂含量的方法”，就公开了一种对微藻油脂含量的测定方法。专利公开号为CN103052706A的发明专利“生产作为生物柴油原料的富油微藻的方法”，就公开了一种生产富油脂微藻的培养方法和诱导中性脂累积方法。专利公开号为CN102268377A的发明专利“用兼养和富氮-缺氮两阶段培养策略提高产油微藻生物量和油脂累积的方法”，就公开了一种通过调节营养盐及营养方式进行中性脂累积的诱导方法。但是迄今为止，尚没有利用滤光膜过滤光进行促进微藻提高中性脂累积的方法。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种促进自养微藻中性脂累积的给光方法，即一种简单易行、可大规模操作的促进微藻中性脂累积的给光方法，从而提高效率，减少投入，降低生产运行成本，提高经济效益。

[0006] 本发明促进自养微藻中性脂累积的培养方法，是将处于增殖后期，具有中性脂累积代谢能力的微藻处于400-550nm光波条件下进行中性脂累积培养。

[0007] 其中400-550nm光波条件，是用蓝色材质的透光材料或容器形成的。

[0008] 所述的蓝色材质的透光材料为蓝色滤光膜。

[0009] 本发明的一种培养方法，是将处于增殖后期的微藻液，转入以蓝色滤光膜覆盖的大棚池中进行中性脂累积培养；具体如下：

[0010] 首先进行第一步细胞增殖培养：将藻接种于海水培养液中，在温度为22-30℃，光照条件为2000-6000lx的条件下培养，培养至平台期最大密度2-3天时，进行第二步培养；

[0011] 第二步中性脂累积培养：将培养至平台期最大密度的藻液转移至温度为10-20℃、以蓝色滤光膜滤光获得波长为400-550nm、2000-6000lx照度、光暗比12:12的条件下进行中性脂累积培养，同时在培养液中以1:1000的比例添加浓度为5g/L的磷酸二氢钠溶液，继续培养5-7天采收。

[0012] 所述的海水培养液的组成如下：KNO3 100 mg/L、K2HPO4 10 mg/L、MnSO4 0.25 mg/L、FeC6H5O7 2.5 mg/L、Na2EDTA 20 mg/L、VB12 0.5 mg/L、VB1 5 mg/L。

[0013] 本发明的另一种具体培养方法，是将光生物反应器培养增殖至后期处于最大生物量的微藻液，转入以蓝色滤光膜覆盖的容器，或者转入蓝色塑料袋、或者转入用使透过光在400-550nm波段的材料制成的光生物反应器中，将培养温度降低进行中性脂累积培养。

[0014] 本发明的方法在获得第一步细胞增殖培养至最大生物量的前提下，通过对藻液的降温以及光照条件的协同作用，使微藻中性脂代谢短期快速响应，实现促进和提高中性脂累积效率和累积量的目的。所述蓝色滤光膜为塑料胶片，可规模化应用与改装。所述氮限制胁迫条件是通过氮磷比逆转调节，不需要微藻和介质的分离过程即可实现。可简化规模化生产中的工艺流程。

附图说明

[0015] 图1：假微型海链藻富油品系NMBguh005的增殖曲线，其中TNL为加入胁迫条件的中性脂累积培养阶段细胞数变化，control为对照；

[0016] 图2：假微型海链藻富油品系NMBguh005两个条件下的中性脂累积培养图；其中TNL为胁迫组，Control为对照组。

具体实施方式

[0017] 下面结合具体实施例对本发明的方法进行详细的描述。

[0018] 实施例1：对假微型海链藻富油品系NMBguh005进行中性脂累积培养[0019] 1、细胞增殖培养：

[0020] 取自然海水过滤消毒，分别添加KNO3 100 mg/L、K2HPO4 10 mg/L、MnSO4 0.25 mg/L、FeC6H5O7 2.5 mg/L、Na2EDTA 20 mg/L、VB12 0.5 mg/L、VB1 5 mg/L各物质形成微藻培养液。接种假微型海链藻到上述培养液中进行细胞增殖培养。培养液盐度23‰，培养温度25℃，光照4000lx（D:L=12:12），培养环境由日光灯光源的光照培养箱获得。培养水体体积500mL，6平行。每天取样2mL 3重复进行显微计数跟踪生长周期。细胞增殖过程图如图
1（0-12d）所示。培养第12d时将6个平行平分各3瓶，分别进行中性脂累积培养的对照培养。

[0021] 对于培养液的组成与配比，是与后续的中性脂累积培养中光照的波长诱导相互协同的，从而保证微藻中获得最大的中性脂累计量。

[0022] 2、中性脂累积培养：

[0023] 细胞增殖培养至平台期最大生物量2-3天后，将3个培养瓶转入温度为20℃的培养箱中保证藻类的培养温度降低，另外3个培养瓶维持于原来培养箱中继续培养。新转入培养箱日光灯光源以蓝色塑料膜全部隔离，调节光照强度达到4000lx（D:L=12:12）。同时按照1:1000的比例添加浓度为5g/L的磷酸二氢钠溶液。继续培养5-7天。中性脂累积培养过程中同样跟踪细胞密度变化，同时取样1mL以尼罗红染色法检测中性脂的定量变化。中性脂累积培养5天。

[0024] 培养5天后，于降温、氮胁迫及滤光膜给光培养条件下，细胞数受胁迫平均下降7%。单位细胞的中性脂累积量，比对照组持续维持原培养条件下的显著提高（p＜0.05），最大达40%（图2）。

[0025] 上述结果表明，本发明的方法能够明显提高微藻中的中性脂的含量。