酸性橙Ⅱ人工抗原合成及酸性橙Ⅱ-IgY抗体制备方法

摘要

本发明公开了一种酸性橙Ⅱ人工抗原合成的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）称取酸性橙Ⅱ，加入丙酮溶解，再加入丁二酸酐、无水吡啶，加热回流24h；（2）旋蒸除去丙酮，干燥后可见蒸馏烧瓶底部一层橙色，加DMF溶解，再加入NHS、DCC，室温下在磁力搅拌器上搅拌，获得反应液，离心，去沉淀，制成酸性橙Ⅱ活化中间产物；（3）称取BSA或OVA，溶于PBS中，在磁力搅拌器上边搅拌边将酸性橙Ⅱ活化中间产物逐滴加入到BSA-PBS或OVA-PBS溶液中，搅拌过夜；（4）次日将搅拌过夜的反应液置于透析袋中，在冰箱内以PBS中透析72h，每8h换透析液一次；（5）透析结束后，将透析袋内液体离心，去沉淀，即得酸性橙Ⅱ人工抗原。

权利要求

1.基于酸性橙II人工合成抗原制备酸性橙II-IgY抗体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：步骤1酸性橙II人工抗原合成，其中，免疫抗原采用酸性橙II和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用酸性橙II和卵清白蛋白合成；

步骤2制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4℃保存；

步骤3提取IgY，其中，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述卵黄抗体；

步骤3.1将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照体积比

1∶2进行稀释；

步骤3.2向稀释液加入质量体积比为3.5％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；

步骤3.3将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；

步骤3.4将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12％的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物；

步骤3.5将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透析过夜，获得的IgY，并保存在-20℃备用。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300μg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为250μg/只。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述禽类为鸡。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述PBS的pH值为7.4。

说明书

酸性橙Ⅱ人工抗原合成及酸性橙Ⅱ-IgY抗体制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物医药领域中的特异性IgY的制备和应用，具体涉及一种酸性橙Ⅱ人工抗原的合成，以及酸性橙Ⅱ-IgY的制备方法。

背景技术

[0002] 酸性橙Ⅱ（Acid Orange）是一种偶氮类酸性工业染料，这是一种重要的精细化工产品，主要用于纺织品、皮革制品、塑料及木制品的染色。它是中等毒性致癌化合物，禁止在食品中使用。如果在食品加工中使用，可能会引起食物中毒，长期食用甚至会致癌。但是酸性橙Ⅱ色泽鲜艳、着色稳定和价格低廉的特点仍使得不法商贩在食品中违规添加酸性橙Ⅱ。受其污染的有卤制品、饮料、糖果、红壳瓜子等食品。在我国市售和出口的蜜饯、辣椒粉、豆制品、红瓜子和卤制品中均检出过含有酸性橙Ⅱ，对消费者的健康构成了巨大的威胁。

[0003] 目前对食品中酸性橙Ⅱ的检测在国家标准及行业标准中仍不健全。因此，及时准确判断食品中是否存在该非食用色素，建立一套快速、准确的食品中酸性橙Ⅱ的测定方法具有重要意义。现有技术中对于酸性橙Ⅱ的检测主要为高效液相色谱法（HPLC）、超高效液相色谱(UPLC)法等理化手段，这些方法虽然灵敏度较高，但是相应的成本也较高，对专业技术要求较高，并不适合大量样本的快速检测，而以ELISA为基础建立的检测方法操作简便、快速、灵敏、不需要专业人员操作，具有良好的发展前景。

[0004] 卵黄抗体（egg yolk antibody，IgY）抗体是通过对禽类（鸡）免疫注射特定抗原，从而在体内产生IgY，经血液由母体传递到卵黄内，在卵黄中富集，进而通过分离卵黄，获得的特异性多克隆抗体。相对于从哺乳动物血清中获得抗体，避免了常规的动物采血，减轻了动物的痛苦，同时通过卵黄获得抗体，产量大，制备简单，每枚蛋中可以提纯50～100mg的抗体，且母鸡易于饲养，费用低，便于大规模的生产特异性抗体，经济优势明显。

[0005] 与哺乳动物免疫球蛋白G（immunoglobulin G，IgG）相似，IgY的Fab片段包含抗原结合位点，Fc片段包含的位点有补体激活功能、调理素作用和致敏过敏反应作用等功能。但是其结构同哺乳动物有些不同，相对于IgG，IgY重链的氨基酸残基数量多于IgG，且重链恒定区(CH区)数量多于IgG，而轻链小于IgG。IgY理化特性及抗酶解特性等不同于IgG，使IgY相对于IgG更适合用于治疗制剂。IgY等电点（PI）在5.7～7.6之间，在pH4.0～
11.0时IgY稳定，比兔IgG对酸变性更为敏感，当pH值从4降到3时，IgY活性迅速丧失，而IgG对此只受到微小影响；IgY在低温下储存时性能较稳定，室温下可保持6个月的活性，4℃储存6～7年活性下降仅5％（Jaradat Z W,Marquardt R R.2000.Studies on the stability of chicken IgY in different sugars,complex carbohydrates and food materials.Food and Agricultural Immunology,12(4):263-272）；IgY抗胃蛋白酶消化的稳定性较牛IgG差，但抗胰蛋白酶和糜蛋白酶能力则较强（Shimizu M,Nagashima H,Sano K,et al.1992.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G.Biosci Biotechnol Biochem,56(2):270-274）。

[0006] 由于系统发生学距离造成哺乳动物和鸡抗体特异性的差异，相对于哺乳动物IgG，卵黄抗体应用于检测也具有多方面的优势如：卵黄抗体与风湿因子、人类抗鼠抗体（HAMA）没有交叉反应，无补体系统活性和异质性凝集素，且不结合蛋白A和蛋白G，可以避免交叉反应。此外，禽类针对保守性强的蛋白质往往能引发较哺乳动物抗体更强烈的抗体反应，成为有关抗体研发的重要选择因素。

发明内容

[0007] 鉴于现有技术的不足，本发明旨在于提供一种酸性橙Ⅱ的人工抗原的合成方法，以及酸性橙Ⅱ-IgY抗体的制备方法。

[0008] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

[0009] 一种酸性橙Ⅱ人工抗原合成的方法，所述方法包括以下步骤：

[0010] （1）称取酸性橙Ⅱ7mg，加入丙酮5ml溶解，再加入丁二酸酐4mg、无水吡啶1mg，60℃加热回流24h；

[0011] （2）旋蒸除去丙酮，干燥后可见蒸馏烧瓶底部一层橙色，加DMF2ml溶解，再加入NHS2mg、DCC8.3mg，室温下在磁力搅拌器上搅拌24h，获得反应液，将反应液以2000r/min离心10min，去沉淀，制成酸性橙Ⅱ活化中间产物；

[0012] （3）称取BSA13.3mg或OVA8.6mg，溶于2ml，pH为7.4的PBS中，在磁力搅拌器上边搅拌边将酸性橙Ⅱ活化中间产物逐滴加入到BSA-PBS或OVA-PBS溶液中，4℃搅拌过夜；

[0013] （4）次日将搅拌过夜的反应液置于的透析袋中，4℃冰箱内pH为7.4的PBS中透析72h，每8h换透析液一次；

[0014] （5）透析结束后，将透析袋内液体离心，去沉淀，即得酸性橙Ⅱ人工抗原。

[0015] 一种利用酸性橙Ⅱ人工合成抗原制备酸性橙Ⅱ-IgY抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

[0016] （1）酸性橙Ⅱ人工抗原合成，其中，免疫抗原采用酸性橙Ⅱ和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用酸性橙Ⅱ和卵清白蛋白合成；

[0017] （2）制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4℃保存；

[0018] （3）提取IgY，其中，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述卵黄抗体。

[0019] 需要说明的是，所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300μg/只，初次免疫21天之后，进行4次加强免疫，间隔时间为21天，免疫剂量为250μg/只。

[0020] 需要进一步说明的是，所述提取IgY的方法如下；

[0021] （1）将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS（pH7.4）按照体积比1：2进行稀释；

[0022] （2）向稀释液加入质量体积比为3.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；

[0023] （3）将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；

[0024] （4）将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物；

[0025] （5）将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透析过夜，获得的IgY，并保存在-20℃备用。

[0026] 需要说明的是，所述PBS的pH值为7.4。

[0027] 作为一种优选的方案，所述禽类为鸡。

[0028] 本发明有益效果在于，可有效增强抗体，具体是，抗酸性橙Ⅱ IgY在初免20天左右，开始产生抗体，在初免后90天左右，抗体滴度达到最高，即1：102400，停止加强免疫后，抗体效价仍能维持一个多月。

附图说明

[0029] 图1为本发明合成为酸性橙Ⅱ人工抗原的反应方程式；

[0030] 图2为紫外分光光谱图；

[0031] 图3为酸性橙Ⅱ-BSA的SDS-PAGE电泳图；

[0032] 图4为酸性橙Ⅱ-BSA的NAGE电泳图；

[0033] 图5为PEG-6000提纯酸性橙Ⅱ-IgY抗体SDS-PAGE电泳图；

[0034] 图6为酸性橙Ⅱ-IgY抗体效价动态监测。

具体实施方式

[0035] 下面将结合附图对本发明作进一步的描述。

[0036] 本发明为一种酸性橙Ⅱ人工抗原合成的方法，所述方法包括以下步骤：

[0037] （1）称取酸性橙Ⅱ7mg，加入丙酮5ml溶解，再加入丁二酸酐4mg、无水吡啶1mg，60℃加热回流24h；

[0038] （2）旋蒸除去丙酮，干燥后可见蒸馏烧瓶底部一层橙色，加DMF2ml溶解，再加入NHS2mg、DCC8.3mg，室温下在磁力搅拌器上搅拌24h，获得反应液，将反应液以2000r/min离心10min，去沉淀，制成酸性橙Ⅱ活化中间产物；

[0039] （3）称取BSA13.3mg或OVA8.6mg，溶于2ml，pH为7.4的PBS中，在磁力搅拌器上边搅拌边将酸性橙Ⅱ活化中间产物逐滴加入到BSA-PBS或OVA-PBS溶液中，4℃搅拌过夜；

[0040] （4）次日将搅拌过夜的反应液置于透析袋中，4℃冰箱内pH为7.4的PBS中透析72h，每8h换透析液一次；

[0041] （5）透析结束后，将透析袋内液体离心，去沉淀，即得酸性橙Ⅱ人工抗原。

[0042] 其具体反应方程如图1所示。

[0043] 进一步地，制备酸性橙Ⅱ-IgY抗体的方法，所述方法包括以下步骤：

[0044] （1）酸性橙Ⅱ人工抗原合成，其中，免疫抗原采用酸性橙Ⅱ和牛血清白蛋白合成，检测抗原采用酸性橙Ⅱ和卵清白蛋白合成；

[0045] （2）制备含抗体的免疫蛋，其中，向禽类注射所述免疫抗原，收集所述禽类所生产的蛋，并做标记于4℃保存；

[0046] （3）提取IgY，其中，从所述收集的蛋分离卵黄和卵清后，提取获得所述卵黄抗体。

[0047] 需要说明的是，所述制备免疫蛋方法如下：向20周龄禽类进行初次免疫注射，免疫剂量为300μg，初次免疫后21天进行二次免疫，免疫剂量为250μg，二次免疫后42天进行三次免疫，免疫剂量为250μg，三次免疫后63天进行四次免疫，免疫剂量为250μg，四次免疫后84天进行五次免疫，免疫剂量为250μg。

[0048] 需要说明的是，所述提取IgY的方法如下；

[0049] （1）将所述收集的蛋进行卵黄与卵清分离，收集卵黄，将卵黄使用PBS按照1：2进行稀释；

[0050] （2）向稀释液加入质量体积比为3.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；

[0051] （3）将混合液离心，收集上清，过滤，滤液加入质量体积比为8.5%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟；

[0052] （4）将经过搅拌后的混合液离心，弃去上清液，沉淀使用10毫升的PBS悬浮，加入质量体积比为12%的PEG-6000，充分搅拌，摇床上室温作用30分钟，再进行离心，获得沉淀物；

[0053] （5）将所述沉淀物使用1.2毫升PBS溶解后，使用透析带进行透析，使用PBS透析3次，获得的IgY，并保存在-20度备用。

[0054] 需要说明的是，所述PBS的pH值为7.4。

[0055] 作为一种优选的方案，所述禽类为鸡。

[0056] 如图2～6所示，为了进一步说明，对酸性橙Ⅱ-IgY抗体效价进行测定：

[0057] （1）包被酶标版：用CBS溶液配制蛋白浓度为5μg/mL的酸性橙Ⅱ-卵清蛋白溶液，50μL/孔加入96孔酶标板，37℃温育过夜，弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次5分钟；

[0058] （2）封闭：用5%脱脂奶粉，满孔封闭，37℃温育2h，弃去孔内液体，用PBST洗板3次，每次5分钟；

[0059] （3）加IgY提取液：首先每孔加入50μL PBS铺底，取出分离纯化得到的IgY溶液，恢复至室温后，用稀释液PBS1:100稀释，取50μL加入第一孔，吹吸混匀后吸取50μL加入第二孔，依次倍比稀释至1:102400。空白鸡蛋提取的IgY50μL为阴性对照（NC），PBS50μL为空白对照（BC），37℃温育1h，弃去孔内液体，洗板；

[0060] （4）加酶标二抗：辣根过氧化物酶标记的羊抗鸡IgY用PBS1:6000稀释，每孔加入50μL，37℃温育1h，弃去孔内液体，洗板；

[0061] （5）显色：加入新鲜配制的TMB-H2O2底物液50μL/孔，室温避光放置15～20分钟，弃去孔内液体，洗板；

[0062] （6）终止：最后加入50μL2mol/L的H2SO4终止反应，在450nm波长处用酶标仪测其OD值，每孔重复三次求平均值；

[0063] （7）结果判定：求样品孔OD450值（P）与阴性对照孔OD450值（N）的比值，当P/N≥2.1时，判断为阳性，所对应的抗体最大稀释倍数即为该抗体效价。

[0064] 结果显示，抗酸性橙Ⅱ-IgY在初免20天左右，开始产生抗体，在初免后90天左右，抗体滴度达到最高，即1：102400，停止加强免疫后，抗体效价仍能维持一个多月。

[0065] 需要说明的是，图2中a、b、c表示：

[0066] 图2a：酸性橙Ⅱ人工合成紫外分光光谱图；

[0067] 图2b：酸性橙Ⅱ-BSA人工偶联紫外分光光谱图；

[0068] 图2c：酸性橙Ⅱ-OVA人工偶联紫外分光光谱图。

[0069] 需要说明的是，图3中1、2、3表示：

[0070] 1：蛋白Marker；2：酸性橙Ⅱ-BSA；3：BSA。

[0071] 需要说明的是，图4中1、2表示：

[0072] 1：BSA；2：酸性橙Ⅱ-BSA。

[0073] 需要说明的是，图5中M、1表示：

[0074] M：蛋白Marker；1：IgY抗体。

[0075] 对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。