一种α-淀粉酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

摘要

本发明提供了本发明提供了一种新型α-淀粉酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其在制备芦笋膳食纤维中的应用。该α-淀粉酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码基因序列如SEQ ID NO.2所示，最适反应温度在70～75℃，最适pH范围在6.5～7.0之间，本发明的α-淀粉酶在芦笋膳食纤维的生产方面具有良好应用。

权利要求

1.一种α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.权利要求1所述α-淀粉酶的编码基因。

3.权利要求2所述的编码基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示。

4.含有权利要求2所示编码基因的重组载体。

5.含有权利要求3所示编码基因的重组载体。

6.一种用权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

7.一种用权利要求5所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

8.权利要求2或3所述基因在制备重组α-淀粉酶中的应用。

9.权利要求1所述的α-淀粉酶在制备芦笋膳食纤维中的应用。

说明书

一种α-淀粉酶、编码基因、载体、工程菌及其应用

（一）技术领域

[0001] 本发明涉及一种α-淀粉酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其应用。（二）背景技术

[0002] 淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，能够水解淀粉分子生成包括糊精在内的不同水解产物，并逐步生成由葡萄糖单位组成的聚合物。淀粉酶被广泛应用于淀粉液化糖化、纺织、烘焙、饲料、造纸、化工、果汁和食品加工等工业过程中，甚至扩展到医药和化学分析领域，是商品化生产最早、应用最早、用量最大的工业酶类之一，占据了酶制剂市场份额的25%～33%左右。因为α-淀粉酶的用途广泛,用量巨大，各国在对α-淀粉酶产生菌的筛选方面都做了大量的研究工作。
（三）发明内容

[0003] 本发明目的是提供一种α-淀粉酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其在制备芦笋膳食纤维中的应用。

[0004] 本发明采用的技术方案是：

[0005] 一种α-淀粉酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示：

[0006] 1Met Ser Ser Ser Trp Phe Arg Ser Lys Leu Gln Lys Val Glu Ser Arg Leu Asp Ser Leu[0007] 21Thr Lys Thr Ser Thr Ser Gly Gly Ala Pro Ala Val Gln Pro Ala Gln Thr Gly Lys Thr[0008] 41Gly Thr Pro Thr Pro Gln Asn Gln Thr Leu Leu Gln Ala Phe Glu Trp His Thr Pro Gly[0009] 61Asp His Trp Asn Arg Leu Ala Glu Val Val Gln Thr Leu Cys Asp Leu Gly Ile Thr Ser[0010] 81Leu Trp Leu Pro Pro Gly Cys Lys Ala Asn Ser Pro Gln Gly Asn Gly Tyr Asp Cys Tyr[0011] 101Asp Leu Trp Asp Leu Gly Glu Phe Asp Gln Lys Trp Thr Arg Ala Thr Lys Trp Gly Ser[0012] 121Arg Glu Glu Leu Asp Glu Met Met Ala Lys Ala Lys Ser Leu Gly Val Lys Val Ile Trp[0013] 141Asp Ala Val Leu Asn His Lys Thr Ala Gly Asp Ala Lys Glu Glu Cys Trp Ala Val Glu[0014] 161Val Asp Arg Gly Asp His Arg Ile Gln Thr Cys Ala Pro Lys Lys Ile Glu Pro Trp Ile[0015] 181His Tyr Tyr Phe Pro Gly Arg Gly Asp Arg Tyr Ser Ser Leu Lys Trp His Trp Gln His[0016] 201Phe Asn Gly Thr Asp Trp Asp Gln Arg Thr Glu Lys Asn Ala Val Tyr Lys Ile Val Asp[0017] 221Ala Pro Glu Thr Leu Pro Arg Pro Gly Ala Pro Val Asp Pro Asn Trp Arg Lys Lys Asp[0018] 241Trp Ala Thr Asp Val Asp Asp Cys Met Gly Asn Gly Asp Tyr Leu Met Phe Ser Asn Val[0019] 261Asp Tyr Thr Asn Ala Glu Val Arg Glu Asp Val Gln Lys Trp Gly Asp Trp Met Val Ser[0020] 281Glu Ile Gly Val Asp Gly Phe Arg Leu Asp Ala Val Pro His Phe Ser Trp Met Phe Thr[0021] 301His Glu Trp Ile Arg Ile Ala Lys Glu Ala Ala Lys Arg Gln His Arg Asp Leu Phe Ile[0022] 321Met Gly Glu Phe Tyr Ser Gly Asn Val Ser Lys Ile Leu Gln Trp Met Asp Arg Met Gly[0023] 341Gln Gly Val Tyr Ala Tyr Asp Ile Pro Leu Leu Gly Asn Phe Ala Lys Ile Ser Met Ala[0024] 361Lys Ser Lys Leu Asp Val Asp Leu Arg Lys Val Phe Lys Asn Ala Leu Ile Gln His Arg[0025] 381Pro Asn Asn Ala Val Thr Leu Val Thr Ser His Asp Thr Gln Pro Gly Gln Thr Val Glu[0026] 401Thr Pro Val Ala Pro Tyr Phe Lys Pro Leu Ala Tyr Ala Ile Met Leu Leu Arg Arg Glu[0027] 421Gly Leu Pro Cys Val Phe Trp Gly Asp Val Tyr Gly Ile Lys Gly Pro His Pro Ala Thr[0028] 441Ala Ala Cys Glu Gly Lys Leu Pro Thr Leu Val Leu Ser Arg Lys Leu Phe Ala Tyr Gly[0029] 461Glu Gln Thr Asp Tyr Leu Glu Ser Arg Thr Ser Ile Gly Trp Val Arg His Gly Thr Trp[0030] 481Asp Arg Ala Asp Gly Cys Ala Val Ile Met Ser Ile Gly Asn Ala Ala Lys Ser Ser Met[0031] 501Phe Val Gly Pro Ala Lys Val Gly Gln Thr Trp Thr Asp Val Leu Gly Asn Ser Gly His[0032] 521Thr Val Thr Ile Asp Glu Arg Gly Tyr Gly Val Phe Lys Cys Ala Asp Lys Ser Val Ser[0033] 541Val Tyr Val Arg Glu Asp Ala Pro Gly Arg Ala Asp Phe Gly Ala Cys His Pro Glu Lys[0034] 561Phe Val Ile

[0035] 由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90%以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

[0036] 本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的α-淀粉酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：（Ⅰ）一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基（优选的是保守氨基酸残基）取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；（Ⅱ）一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；（Ⅲ）成熟蛋白与另一种化合物（比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇）融合；（Ⅳ）附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列（如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列）。

[0037] 所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主（例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞）中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

[0038] 本发明还涉及所述α-淀粉酶的编码基因。

[0039] 具体的，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示：

[0040] 1 ATGTCCTCTT CTTGGTTCCG CAGCAAACTT CAAAAGGTCG AGAGTCGACT GGACTCTTTG[0041] 61 ACAAAGACAT CCACAAGCGG AGGCGCACCG GCGGTGCAAC CAGCACAAAC CGGCAAGACA[0042] 121 GGAACACCGA CACCTCAGAA CCAAACTCTC CTCCAAGCCT TTGAATGGCA CACGCCCGGC[0043] 181 GACCACTGGA ACCGTCTCGC AGAGGTCGTA CAAACACTGT GTGACCTCGG CATCACTTCA[0044] 241 CTATGGCTCC CGCCTGGCTG TAAGGCCAAC TCACCCCAGG GGAACGGGTA CGACTGCTAC[0045] 301 GATCTCTGGG ACCTCGGCGA ATTTGACCAG AAGTGGACAC GCGCAACAAA ATGGGGATCC[0046] 361 AGAGAAGAGC TAGACGAAAT GATGGCCAAG GCAAAGAGCT TGGGAGTCAA GGTCATCTGG[0047] 421 GACGCTGTTC TGAACCACAA GACTGCGGGA GACGCCAAAG AGGAGTGCTG GGCCGTTGAG[0048] 481 GTCGATCGTG GAGACCACAG AATCCAGACA TGCGCCCCCA AGAAGATCGA ACCCTGGATC[0049] 541 CACTACTACT TCCCTGGTCG CGGAGACCGC TACAGCAGCT TGAAGTGGCA CTGGCAGCAT[0050] 601 TTCAACGGCA CCGACTGGGA CCAGCGCACC GAGAAGAACG CCGTCTACAA GATTGTTGAT[0051] 661 GCACCGGAGA CACTTCCGCG CCCTGGTGCC CCCGTGGACC CCAACTGGCG CAAGAAGGAC[0052] 721 TGGGCTACCG ACGTGGACGA CTGCATGGGC AACGGAGACT ATCTCATGTT TTCCAACGTC[0053] 781 GACTACACCA ACGCCGAAGT CAGAGAAGAC GTCCAGAAAT GGGGCGATTG GATGGTGAGC[0054] 841 GAGATTGGCG TCGATGGCTT CAGACTGGAC GCCGTGCCTC ACTTCAGCTG GATGTTCACC[0055] 901 CATGAATGGA TCCGCATCGC AAAGGAGGCT GCCAAGCGCC AGCACCGCGA TCTCTTCATC[0056] 961 ATGGGCGAGT TCTATAGCGG GAACGTTTCC AAGATCCTCC AGTGGATGGA CAGAATGGGA[0057] 1021 CAAGGCGTCT ACGCTTACGA CATCCCGCTC CTGGGCAACT TTGCCAAAAT CTCAATGGCA[0058] 1081 AAGAGCAAGC TCGACGTCGA CTTGAGAAAG GTCTTTAAGA ACGCCTTGAT CCAGCACCGA[0059] 1141 CCCAACAATG CAGTCACTCT CGTAACCAGC CATGACACTC AGCCAGGTCA AACCGTTGAG[0060] 1201 ACTCCCGTCG CACCCTACTT CAAACCTCTG GCATACGCAA TCATGCTGTT GCGCCGTGAA[0061] 1261 GGCCTGCCTT GCGTCTTCTG GGGCGATGTC TACGGAATCA AGGGTCCCCA CCCCGCCACG[0062] 1321 GCAGCCTGCG AAGGCAAATT GCCCACTCTT GTCCTCAGCC GCAAACTCTT CGCTTACGGT[0063] 1381 GAGCAAACCG ACTATCTCGA GAGTAGAACT TCGATTGGTT GGGTTCGCCA CGGTACCTGG[0064] 1441 GACAGAGCTG ATGGCTGCGC TGTTATTATG AGCATCGGAA ATGCTGCTAA GAGCAGCATG[0065] 1501 TTCGTTGGTC CCGCTAAAGT TGGTCAGACT TGGACTGATG TGCTCGGAAA TTCTGGTCAC[0066] 1561 ACTGTCACCA TCGACGAGAG AGGCTATGGT GTCTTCAAGT GTGCTGACAA GAGCGTCAGC[0067] 1621 GTCTACGTGC GCGAGGATGC CCCCGGCAGA GCAGACTTTG GAGCATGCCA TCCTGAAAAG[0068] 1681 TTCGTCATCT AA

[0069] 由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70%以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以使生的等位变异体或非生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

[0070] 另外，可与SEQ ID NO.2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸（至少具有50%同源性，优选具有70%同源性），也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：（1）在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1%SDS，60℃；或（2）杂交时加用变性剂，如50%（v/v）甲酰胺，0.1%小牛血清，0.1%Ficoll，42℃；或（3）仅在两条序列之间的同源性至少在95%以上，更好是97%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO.1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

[0071] 编码本发明所述α-淀粉酶的多核苷酸序列能用多种方法获得。例如，用本领域熟知的杂交技术分离多核苷酸。这些技术包括但不局限于：（1）用探针与基因或cDNA文库杂交以检出同源性的多核苷酸序列和（2）表达文库的活性筛选以检出具有共同结构特征的克隆的多核苷酸片段，该表达文库可以包括环境宏基因组文库。本发明的DNA片段序列也能用下列方法获得：（1）从基因组DNA分离双链DNA序列；（2）化学合成DNA序列以获得所述蛋白的双链DNA。

[0072] 可用常规方法从这些cNDA文库中筛选本发明的基因。这些方法包括（但不限于）：（1）DNA-DNA或DNA-RNA杂交；（2）标志基因功能的出现或丧失；（3）通过测定生物学活性，来检测基因表达的蛋白产物。上述方法可单用，也可多种方法联合应用。

[0073] 如上所述得到的本发明的基因，或者各种DNA片段等的多核苷酸序列可用常规方法双脱氧链终止法测定。这类多核苷酸序列测定也可用商业测序试剂盒等。为了获得全长的cDNA序列测序需反复进行。有时需要测定多个克隆的cDNA序列，才能拼接全长的cDNA序列。

[0074] 本发明还涉及含有所述编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

[0075] 本发明中，编码α-淀粉酶的所核苷酸序列可插入到载体中，以构成含有本发明所述多核苷酸的重组载体。“载体”指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其它载体。在本发明中适用的载体还包括但不限于：在细菌中表达的基于T7启动子的表达载体；在哺乳动物细胞中表达的pcDNA3.1载体和在昆虫细胞中表达的来源于杆状病毒的载体。总之，只要能在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都可以用于构建重组表达载体，优选pET载体系列以其其它原核表达载体系列。表达载体一个重要特征是通常含有复制起始点、启动子、标记基因和翻译调控元件。

[0076] 本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含编码α-淀粉酶的DNA序列和合适的转录/翻译调控元件的表达载体。这些方法包括体外重组DNA序列、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子上，以指导mRNA的合成。这些启动子的代表性例子有：大肠杆菌的lac或trp启动子；噬菌体的PL启动子；真核启动子包括CMV早期启动子、HSV胸苷激酶启动子、早期和晚期SV40启动子、反转录病毒的LTRs和其它一些已知的可控制基因在原核细胞或真核细胞或其病毒中表达的启动子。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子等。在载体中插入增强子序列将会使其在高等真核细胞中的转录得到增强。增强子是DNA表达顺式作用因子，通常大约有10到300个碱基对，作用于启动子以增强基因的转录。可举的例子包括在复制起始点晚期一侧的100到270个碱基对的SV40增强子、在复制起始点晚期一侧的多瘤增强子以及腺病毒增强子等。

[0077] 此外，表达载体优选包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如真核细胞培养用的二氢叶酸还原酶、新霉素抗性以及绿色荧光蛋白，或用于大肠杆菌的卡那霉素或氨苄青霉素等。

[0078] 本发明中，编码α-淀粉酶的多核苷酸或含有该多核苷酸的重组载体可转化或转导入宿主细胞，以构成含有该核苷酸或重组载体的基因工程化宿主细胞。“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。

[0079] 用本发明所述的DNA序列或含有所述DNA序列的重组载体转化宿主细胞可用本领域技术熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的本领域众所周知，可供选择的是用MgCl2如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，或者常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。

[0080] 本发明还涉及所述编码基因在制备重组α-淀粉酶中的应用。

[0081] 过常规的重组DNA技术，利用本发明的多核苷酸序列可用来表达或生产重组的α-淀粉酶。一般来说有以下步骤：

[0082] （1）用本发明的编码α-淀粉酶的多核苷酸（或变异体），或用含有该多核苷酸的重组表达载体转化或转染合适的宿主细胞；

[0083] （2）在合适的培养基中培养宿主细胞；

[0084] （3）从培养基或细胞中分离、纯化蛋白质。

[0085] 在步骤（2）中，根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞的条件下进行培养。当宿主细胞生长在适当的细胞密度后，用合适的方法诱导选择的启动子，浆细胞再培养一段时间。

[0086] 在步骤（3）中，重组蛋白可包被于细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法包括但不限于：常规的复性处理、蛋白沉淀剂处理（盐析方法）、离心、渗透破菌、超声波处理、超离心、分子筛层析（凝胶过滤）、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析（HPLC）和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

[0087] 本发明还涉及所述的α-淀粉酶在制备芦笋膳食纤维中的应用。

[0088] 具体的，所述应用如下：芦笋老茎烘干后粉碎，过筛，制成芦笋粉；加入适量水后，依次加入α-淀粉酶，蛋白酶反应，过滤后得到滤渣1和滤液1；滤渣1加入适量水，加纤维素酶反应，过滤后得到滤渣2和滤液2；滤渣2后处理后得到非可溶性膳食纤维；滤液1和滤液2后处理后得到可溶性膳食纤维。

[0089] 优选的，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其编码基因如SEQ ID NO.4所示；所述纤维素酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，其编码基因如SEQ ID NO.6所示。

[0090] 本发明的要点在于提供了SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列和SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，在已知该氨基酸序列和核苷酸序列的情况下，该氨基酸序列和核苷酸序列的获得，以及相关载体、宿主细胞的获得，对于本领域技术人员来说均是显而易见的。

[0091] 本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种新型α-淀粉酶，编码该酶的基因，含有其编码基因的重组载体、基因工程菌及其在制备芦笋膳食纤维中的应用。该α-淀粉酶的最适反应温度在70～75℃，最适pH范围在6.5～7.0之间，本发明的α-淀粉酶在芦笋膳食纤维的生产方面具有良好应用。（四）附图说明

[0092] 图1为α-淀粉酶最适pH值的测定；

[0093] 图2为α-淀粉酶最适反应温度的测定。（五）具体实施方式

[0094] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

[0095] 筛选培养基:可溶性淀粉20g，酵母膏2g，蛋白胨2g，NaCl10g，琼脂20g，水1L，pH值6.5。

[0096] 筛选方法：采用平板透明圈法：将菌株稀释成10-3的悬浮液，吸取100μL稀释液，涂布于筛选平板培养基上，用涂布器涂匀，37℃培养24h，在长出的菌落上滴加碘液，菌落周围如有无色透明圈出现，说明淀粉被水解，即该菌株能产生淀粉酶。挑取能产透明圈的菌株，并记录透明圈直径。

[0097] 实施例1：

[0098] 构建土壤基因组文库。根据平板透明圈法筛选阳性克隆并构建亚文库，通过基因序列测定，分析得到α-淀粉酶基因的开放式阅读框（ORF）核苷酸序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点（这可视选用的载体而定），通过体外扩增技术获得SEQ ID NO.2所示的α-淀粉酶基因。连接pet28a载体，再将其转入E.Coil BL21中，获得重组菌株。

[0099] 实施例2：

[0100] 将实施例1获得的重组菌株在100mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，直到菌液OD600达到0.6～0.8，加入IPTG终浓度为0.1mM，37℃诱导20h后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7.4使其重悬浮，超声破碎。离心取上清，上镍柱亲和层析进行纯化，获得较纯的α-淀粉酶（经测序验证其氨基酸序列与SEQ ID NO.1一致），干燥，获得酶粉用蒸馏水配成1mg/ml的酶液（酶活力67U/ml），备用。

[0101] 酶活力单位定义：在70℃、pH=6.5条件下，一分钟水解1mg水溶性淀粉的酶量为一个酶活力单位（U）。

[0102] 酶活的测定：运用二硝基水杨酸测定还原糖生成量的方法（DNS法），测定可溶性淀粉水解产物还原型寡糖的含量。

[0103] LB液体培养基配制：胰蛋白胨（购自Qxoid公司）10g，酵母提取物（购自Qxoid公司）5g，NaCl10g，蒸馏水补足至1L，121℃灭菌20min。

[0104] 实施例3：

[0105] 将实施例2酶液置于不同pH的缓冲液中（3～8）30min，并在相应的ph下，DNS法测定α-淀粉酶活性，结果见图1。

[0106] 由图1可见，该α-淀粉酶的最适pH范围在6.5～7.0之间。

[0107] 实施例4：

[0108] 将实施例2酶液置于不同温度下（40～85℃）30min，并在相应的温度下，DNS法测定α-淀粉酶活性，结果见图2。

[0109] 由图2可见，该α-淀粉酶的最适反应温度在70～75℃之间。

[0110] 实施例5：蛋白酶制备

[0111] 将SEQ ID NO.4所示的蛋白酶基因连接pet28a载体，转入E.Coil BL21中，获得的重组菌株在含100mL50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，直到菌液OD600达到0.6～0.8，加入IPTG终浓度为0.1mM，37℃诱导20h后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7.4使其重悬浮，超声破碎。离心取上清，上镍柱亲和层析进行纯化，冷冻干燥，获得纯化后的蛋白酶粉（经测序验证其氨基酸序列与SEQ ID NO.3一致），用蒸馏水配成1mg/ml的酶液（酶活力46U/ml），备用。

[0112] 酶活力单位定义：在40℃、pH=7.0条件下，一分钟水解酪蛋白产生1mg酪氨酸作为1个酶活力单位（U）。

[0113] 酶活的测定：采用Folin-酚试剂显色法。

[0114] 实施例6：纤维素酶制备

[0115] 将SEQ ID NO.6所示的纤维素酶基因连接pet28a载体，再将其转入E.Coil BL21中，获得重组菌株，获得的重组菌株在含100mL50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中摇床过夜培养。将10ml过夜培养后的菌液倒入1L50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基培养，直到菌液OD600达到0.6～0.8，加入IPTG终浓度为0.1mM，37℃诱导20h后，离心收集菌体，菌体用25ml磷酸缓冲液pH7.4使其重悬浮，超声破碎。离心取上清，上镍柱亲和层析进行纯化，获得较纯的纤维素酶（经测序验证其氨基酸序列与SEQ ID NO.5一致），干燥，获得酶粉用蒸馏水配成1mg/ml的酶液（酶活力32U/ml），备用。

[0116] 酶活力单位定义：在40℃、pH=6.5条件下，一分钟水解羧甲基纤维素产生1mg还原型寡糖所需的酶量，即为1个酶活力单位（U）。

[0117] 酶活的测定：运用二硝基水杨酸测定还原糖生成量的方法（DNS法），测定羧甲基纤维素钠水解产物还原型寡糖的含量。

[0118] 实施例7：

[0119] 芦笋老茎100℃烘干至水分少于5%，粉碎机粉碎后过100目筛，制成芦笋粉。取芦笋粉5g，加入50ml水，加入0.1mol/L pH=7的磷酸缓冲液5ml，先加入0.1g/mlα-淀粉酶0.1ml（实施例2制备），70℃水浴震荡1小时。加入0.1g/ml蛋白酶0.1ml（实施例5制备），50℃水浴震荡1小时。

[0120] 取反应液过滤，并用少量水清洗，得到滤液1和滤渣1。

[0121] 取滤渣1，加入50ml水，加入0.1mol/L pH=6.5的磷酸缓冲液5ml。加入0.1/ml纤维素酶0.1ml（实施例6制备），35℃水浴震荡1小时，70℃水浴10min使纤维素酶失活。过滤反应液，并用少量水清洗，得到滤液2和滤渣2。

[0122] 合并滤液1和滤液2，加入终体积75%的预热60℃的无水乙醇，使可溶性膳食纤维沉淀。过滤，得到滤渣3。

[0123] 60℃真空干燥滤渣2得到非可溶性膳食纤维3.42g（纤维纯度为70.2%），60℃真空干燥滤渣3，得到可溶性膳食纤维0.20g。

[0124] 实施例8：

[0125] 芦笋老茎100℃烘干至水分少于5%，粉碎机粉碎后过100目筛，制成芦笋粉。取芦笋粉5g，加入50ml水，加入0.1mol/L pH=7的磷酸缓冲液5ml。加入0.1g/mlα-淀粉酶0.5ml（实施例2制备），70℃水浴震荡1小时。加入0.1g/ml蛋白酶0.5ml（实施例5制备），50℃水浴震荡1小时。

[0126] 取反应液过滤，并用少量水清洗，得到滤液1和滤渣1。

[0127] 取滤渣1，加入50ml水，加入0.1mol/L pH=6.5的磷酸缓冲液5ml。加入0.1/ml纤维素酶0.5ml（实施例6制备），35℃水浴震荡1小时，70℃水浴10min使纤维素酶失活。过滤反应液，并用少量水清洗，得到滤液2和滤渣2。

[0128] 合并滤液1和滤液2，加入终体积75%的预热60℃的无水乙醇，使可溶性膳食纤维沉淀。过滤，得到滤渣3。

[0129] 60℃真空干燥滤渣2，得到非可溶性膳食纤维2.81g（纤维纯度为85.4%），60℃真空干燥滤渣3，得到可溶性膳食纤维0.35g。