一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用

摘要

本发明提供了一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，该方法是在微生物发酵生产吡咯喹啉醌的过程中，通过基因敲除手段敲除吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的一个重要基因，使该生产菌株丧失了胞外多糖合成的能力，而不降低该生产菌株生产吡咯喹啉醌的能力。本发明通过双交换同源重组的方法，成功的将PQQ生产菌株Methylovorus sp.MP688的多糖合成基因簇中的重要基因mpq_1844进行了敲除，原始生产菌株的基因敲除菌不再合成胞外多糖，实现了微生物发酵生产吡咯喹啉醌过程中代谢副产物多糖的去除，从而达到了简化纯化工艺的目的，为工业化高效制备吡咯喹啉醌奠定了基础。

权利要求

1.一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，其特征在于，该方法是在微生物发酵生产吡咯喹啉醌的过程中，通过基因敲除手段敲除吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因，使该生产菌株丧失了胞外多糖合成的能力，而不降低该生产菌株生产吡咯喹啉醌的能力；所述生产菌株为甲基营养菌Methylovorus sp.MP688；所述多糖合成基因簇中的重要基因为磷酸转移酶类中的mpq_1844。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征用于，所述方法的具体步骤为：

(1)筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因；

(2)提取所述吡咯喹啉醌生产菌株的基因组DNA，并设计引物，以该基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增步骤(1)所述重要基因5’端和3’端的侧翼序列；

(3)将步骤(2)所得5’端侧翼序列和3’端的侧翼序列分别作双酶切处理，连接到基因敲除载体上；

(4)步骤(3)所述基因敲除载体通过常规电转化或者接合转移的方式导入所述吡咯喹啉醌生产菌株中，在含有氨苄青霉素的MP固体培养基上培养，挑取抗性单菌落在无筛选条件下传代2-4次，通过反筛标记筛选含有蔗糖的培养基平板上的阳性克隆，进而通过菌落PCR鉴定重要基因是否缺失；

(5)在摇瓶中进行基因缺失菌和原始生产菌株的吡咯喹啉醌发酵实验，分别取发酵液离心，观察菌体表面形态，鉴定细菌表面不溶性多糖的有无，测定上清液中可溶性胞外多糖的含量。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因的方法是在NCBI gene bank数据库中下载多糖合成途径中的重要基因序列，其中，所述重要基因为磷酸转移酶类mpq_1844及其侧翼序列，所述mpq_1844的核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.3所示。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述设计引物包括正向和反向两条引物，具体为：5’端侧翼序列正向引物UpF如SEQ.ID No.4所示，反向引物UpR如SEQ.ID No.5所示；3’端的侧翼序列正向引物DwF如SEQ.ID No.6所示，反向引物DwR如SEQ.ID No.7所示。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(3)中所述双酶切处理，具体为：5’端侧翼序列用ApaI和BamHI双酶切处理；3’端的侧翼序列用SpeI和NotI双酶切处理；所述的基因敲除载体为质粒pWM91。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(4)中所述的氨苄青霉素的终浓度为

50μg/mL；所述反筛标记为sacB；所述培养基中所使用的蔗糖浓度为0.01～0.05g/mL。

7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤(5)中所述可溶性多糖测定方法为苯酚-硫酸法；所述的离心转速和时间，具体为10000-12000转/分、5-10分钟。

8.权利要求1所述方法在微生物发酵生产吡咯喹啉醌过程中的应用。

说明书

一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及

其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物发酵技术和基因工程技术领域，具体的涉及一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法及其应用。

背景技术

[0002] 吡咯喹啉醌（Pyrroloquinoline quinone，PQQ）是由第三类氧化还原酶的辅酶，具有多种生理功能和潜在的药用价值。文献报道，甲基营养菌PQQ合成水平较高，且具有清洁低碳、温和可控、成本低廉等优势，是一种极具潜力的生产菌株。然而多数甲基营养菌具有合成胞外多糖的能力，限制了微生物发酵生产PQQ大规模应用，多糖的主要不利因素有：（1）细菌分泌可溶性多糖不仅造成纯化柱堵塞影响纯化效率，而且会缩短纯化介质的使用寿命；（2）发酵液的粘度增大影响发酵过程中的氧传递效率；（3）不溶性多糖附着在细菌表面使发酵液胞外组分和菌体的分离效果不佳，增加动力成本。

[0003] 细菌中多糖的合成包括一系列生化反应，编码这些反应的酶的基因一般以基因簇的形式存在，因此阻断细菌多糖合成途径的方法之一就是对多糖合成的重要基因进行敲除，达到在不影响细菌生长和目标代谢产物合成的前提下，在一定水平上降低或者去除多糖的目的。截至目前，通过这种遗传改造消除细菌发酵中产生的多糖的方法和应用未见报道。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明的目的是提供一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，为简化利用微生物大规模生产PQQ的纯化工艺奠定了基础。

[0005] 本发明的另一目的提供上述方法在微生物发酵生产辅酶或维生素过程中的应用。

[0006] 为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：

[0007] 一种发酵生产吡咯喹啉醌过程中消除副产物多糖的方法，该方法是在微生物发酵生产吡咯喹啉醌的过程中，通过基因敲除手段敲除吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因，使该生产菌株丧失了胞外多糖合成的能力，而不降低该生产菌株生产吡咯喹啉醌的能力。

[0008] 优选的，所述生产菌株为甲基营养菌Methylovorus sp.MP688。该菌已于2010年8月20日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCCNo.4096。

[0009] 优选的，所述多糖合成基因簇中的重要基因为磷酸转移酶类的基因，如mpq_1844。

[0010] 上述的方法的优选的具体步骤为：

[0011] （1）筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因；

[0012] （2）提取所述PQQ生产菌株的基因组DNA，并设计引物，以该基因组DNA为模板，通过PCR方法扩增步骤（1）所述重要基因5’端和3’端的侧翼序列；

[0013] （3）将步骤（2）所得5’端侧翼序列和3’端的侧翼序列分别作双酶切处理，连接到基因敲除载体上；

[0014] （4）步骤（3）所述基因敲除载体通过常规电转化或者接合转移的方式导入所述PQQ生产菌株中，在含有氨苄青霉素的MP固体培养基上培养，挑取抗性单菌落在无筛选条件下传代2-4次，通过反筛标记筛选含有蔗糖的培养基平板上的阳性克隆，进而通过菌落PCR鉴定重要基因是否缺失；

[0015] （5）在摇瓶中进行基因缺失菌和原始生产菌株的PQQ发酵实验，分别取发酵液离心，观察菌体表面形态，鉴定细菌表面不溶性多糖的有无，测定上清液中可溶性多糖的含量。

[0016] 优选的，步骤（1）所述筛选吡咯喹啉醌生产菌株多糖合成基因簇中的重要基因的方法是在NCBI gene bank数据库中下载多糖合成途径中的重要基因序列（具体网址为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_014733.1?from=1899875&to=1901296&report=fasta），更优选为，磷酸转移酶类mpq_1844及其侧翼序列，所述mpq_1844的核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.3所示，所述的侧翼序列长度，优选1500-2500bp。

[0017] 其中，步骤（2）中所述设计引物包括正向和反向两条引物，具体为：5’端侧翼序列正向引物UpF如SEQ.ID No.4所示，反向引物UpR如SEQ.ID No.5所示；3’端的侧翼序列正向引物DwF如SEQ.ID No.6所示，反向引物DwR如SEQ.ID No.7所示。

[0018] 优选的，步骤（3）中所述双酶切处理，具体为：5’端侧翼序列用ApaI和BamHI双酶切处理（37℃，4-10小时）；3’端的侧翼序列用SpeI和NotI双酶切处理（37℃，4-10小时）；所述双酶切反应液体系如表3所示；所述的基因敲除载体优选为质粒pWM91，连接温度是16-25℃，1-6小时；所述连接体系如表4所示。

[0019] 优选的，步骤（4）中氨苄青霉素的终浓度为50μg/ml；所述的反筛标记为sacB；所述培养基中所使用的蔗糖浓度具体为0.01～0.05g/mL；所述的鉴定基因缺失的菌落PCR所用的引物为步骤（2）中的UpF和DwR；所述的基因缺失菌扩增结果为4000bp，具体如SEQ.ID No.8所示，生产菌株扩增结果为5422bp，具体如SEQ.ID No.9所示；

[0020] 所述常规电转化或者接合转移的方式及导入条件，参照Komeili A等人2004年的文献Magnetosome vesicles are present before magnetite formation,andMamA is required for their activation。

[0021] 优选的，步骤（5）中所述的可溶性多糖测定方法为苯酚-硫酸法，具体按照Dubois M.等人1956年文献Colorimetric method for determination of sugarsand related substancede报道的方法步骤；所述的离心转速和时间，具体为12000-12000转/分、5-10分钟。

[0022] 进一步地，本发明提供了上述方法在微生物发酵生产辅酶或维生素过程中的应用。所述辅酶优选为吡咯喹啉醌。

[0023] 本发明的有益效果如下：

[0024] 本发明通过双交换同源重组的方法，成功的将PQQ生产菌株Methylovorussp.MP688的多糖合成基因簇中的重要基因mpq_1844进行了敲除，原始生产菌株的基因敲除菌不再合成胞外多糖，在对细菌生长和PQQ的生产没有造成影响的前提下，大大降低了可溶性多糖和不溶性多糖的合成水平，实现了微生物发酵生产吡咯喹啉醌过程中代谢副产物多糖的去除，从而达到了简化纯化工艺的的目的，为工业化高效制备吡咯喹啉醌奠定了基础。

附图说明

[0025] 图1显示的mpq_1844基因敲除菌株的PCR验证图。从左到右分别是DNA分子量marker、以原始生产菌株基因组DNA为模板的扩增结果、为以mpq_1844基因敲除菌株基因组DNA为模板的扩增结果。

[0026] 图2显示的是mpq_1844基因敲除菌株和原始生产菌株在生长及胞外可溶性多糖方面的差别。▲是原始生产菌株可溶性多糖合成状况，■是基因敲除菌株可溶性多糖合成状况。

[0027] 图3显示的是mpq_1844基因敲除菌株和原始生产菌株荚膜多糖合成的差别。左图是原始生产菌株荚膜多糖合成状况，右图是基因敲除菌株荚膜多糖合成状况。

[0028] 图4显示的是mpq_1844基因敲除菌株和原始生产菌株PQQ生产能力的比较。▲是原始生产菌株PQQ合成状况，■是基因敲除菌株PQQ合成状况。

具体实施方式

[0029] 下面结合附图及其具体实施方式详细介绍本发明。但本发明的保护方位并不局限于以下实例，应包含权利要求书中的全部内容。

[0030] 以下实施例中所涉及的实验材料均可通过商业途径获得或者通过常规实验制备；所用内切酶、连接酶、PCR扩增酶均购自北京全式金生物技术有限公司；实验用仪器和设备均为生物实验室常规。

[0031] 实施例1mpq_1844基因及5’端和3’端的侧翼片段的获得及敲除质粒的构建[0032] 从NCBI gene bank数 据 库（具 体 网 址 为：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_014733.1?from=1899875&to=1901296&report=fasta）中输入mpq_1844，下载保存基因序列及5’端和3’端的侧翼序列；所述mpq_1844的核苷酸序列如SEQ.ID No.1所示，所述侧翼序列的核苷酸序列如SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.3。所示使用基因组提取试剂盒（Tiangen公司细菌基因组提取试剂盒）抽提PQQ生产菌株Methylovorus sp.MP688的基因组DNA，使用5’端侧翼序列正向引物UpF如SEQ.ID No.4所示（ATT GGG CCT GCC GAT GGG CGC TGA CC）和反向引物UpR如SEQ.ID No.5所示（CG GGA TCC GAGGCC CGT GGA GTC TGC）、3’端的侧翼序列正向引物DwF如SEQ.ID No.6所示（GG ACT AGT AGT AAA GGA GTC GTT CAT）和反向引物DwR如SEQ.ID No.7所示（GAA AAA AGC GGC CGC CCC GGA TGA CTGGGT TGG）扩增，扩增的侧翼序列各为2000bp，分别与下载的侧翼序列SEQ.ID No.2和SEQ.ID No.3一致。PCR扩增体系和条件如表1和表2所示：

[0033] 表1PCR50μl反应液中各物质含量

[0034]

[0035] 表2PCR反应条件

[0036]

[0037] 将5’端侧翼序列PCR产物用ApaI和BamHI双酶切处理，所述双酶切处理条件为37℃，4-10小时；3’端侧翼序列PCR产物用SpeI和NotI双酶切处理，所述双酶切处理条件为37℃，4-10小时；所述双酶切反应液体系如表3所示。载体pWM91依次同样处理后，将酶切后PCR产物顺次与酶切后的载体连接，连接温度是16-25℃，1-6小时；所述连接体系如表
4所示。最终得构建好的敲除质粒（即为基因敲除载体）。

[0038] 表3双酶切反应液体系

[0039]

[0040] 表4连接体系

[0041]

[0042] 实施例2敲除mpq_1844基因及鉴定

[0043] 通过常规电转化或者接合转移将实施例1得到的敲除质粒导入PQQ生产菌株Methylovorus sp.MP688中，导入条件参照Komeili A等人2004年的文献Magnetosome vesicles are present before magnetite formation,and MamA isrequired for their activation，将反应后的菌液涂布在含有50μg/ml的氨苄青霉素MP固体培养基上平板上，所述MP固体培养基成分为1升中含有MgSO4·7H2O：0.2g，(NH4)2SO4：3g，KH2PO4：1.4g，Na2HPO4·12H2O：3g，柠 檬 酸 铁：30mg，CaCl2：30mg；MnCl2·4H2O：5mg，ZnSO4·7H2O：5mg，CuSO4·5H2O：0.5mg，1%琼脂粉。30℃培养2天后随机挑取一个单菌落，接种到无任何筛选压力的液体培养基中，所述液体培养基配方同上，不添加琼脂粉，传代2-4次，吸取100μl涂布含有0.02g/mL蔗糖的平板，培养基配方同上，30℃培养2天后随机挑取100个单菌落，使用5’端侧翼序列正向引物UpF（ATT GGG CCTGCC GAT GGG CGC TGA CC）和3’端的侧翼序列反向引物DwR（GAA AAAAGC GGC CGC CCC GGA TGA CTG GGT TGG）做菌落PCR鉴定，扩增体系和程序见表5和表6：

[0044] 表550μl菌落PCR反应液中各物质含量

[0045]

[0046] 表6PCR反应条件

[0047]

[0048] 基因缺失菌扩增结果为4000bp，其核苷酸序列详见SEQ.ID No.8；生产菌株扩增结果为5422bp，其核苷酸序列详见SEQ.ID No.9，具体扩增结果详见图1。

[0049] 实施例3胞外多糖和吡咯喹啉醌含量的测定

[0050] 将筛选到的敲除菌株和原始生产菌株同时接种到含100ml的MP液体培养基（培养基配方同实施例3，不添加琼脂粉）的250ml三角瓶中，30℃，200rpm培养，按照Dubois M.等人1956年的文献Colorimetric method fordetermination of sugars and related substancede报道的苯酚-硫酸法测定可溶性多糖含量，基因缺失菌发酵液中测定的多糖含量在10mg/l以下，可以认为没有多糖，生产菌株60小时的发酵液中检测到多糖含量为700mg/l（详见图2）；原始生产菌株在离心后菌体表面有絮状物，而基因缺失菌无，说明胞外多糖合成能力已经丧失（详见图3）。分别取敲除菌株和原始生产菌株的发酵液，按照文献报道的葡萄糖脱氢酶方法测定吡咯喹啉醌的含量，具体文献参照GeigerO.等人1987年的文献Enzymatic determination of pyrroloquinoline quinoneusing crude membranes from Escherichia coli，结果显示两株菌在培养70小时后发酵液中吡咯喹啉醌的含量分别为41.5mg/l和39.5mg/l（详见图4）。这说明去除多糖后不影响吡咯喹啉醌的合成。

[0051] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。