仔猪乳糖消化性状的LCT基因多态性检测方法及其应用

摘要

仔猪乳糖消化性状的LCT基因多态性检测方法，主要步骤包括：从猪耳中提取组织DNA、设计引物、获得LCT基因5'UTR区序列，进行PCR产物克隆测序；PCR-SSCP和PCR产物直接测序进行多态性检测；多态性与仔猪乳糖不耐受性腹泻性状的相关分析。这些结果证实了LCT基因5'UTR多态性与仔猪乳糖不耐受性腹泻之间有显著相关。本发明还公开了用于扩增LCT基因5'UTR多态性的2对引物序列，以及该基因片段的3个碱基突变位点，以及该多态性在仔猪乳糖不耐受性腹泻性状上的检测、评价和应用。本发明为猪标记辅助选择和猪育种提供了一种新的分子标记。

权利要求

1.一种用于鉴定仔猪LCT基因5'UTR多态性的方法，其特征在于，野猪和地方猪中，利用引物SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5进行仔猪LCT基因增强子区PCR扩增，获得增强子-797bp位点基因型，利用引物SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7进行仔猪LCT基因5'UTR启动子区PCR扩增，获得启动子-308bp和-301bp位点基因型；当仔猪LCT基因5'UTR增强子-797bp位点为GG基因型，或启动子-308bp和-301bp位点为GAGA基因型，或增强子-797bp位点、启动子-308bp位点和启动子-301bp位点组成的单倍型为GGA时，均与仔猪乳糖不耐受性腹泻呈显著相关；当仔猪LCT基因5'UTR增强子-797bp、启动子-308bp和-301bp为其他基因型或单倍型时，均与仔猪乳糖不耐受性腹泻不显著相关。

说明书

仔猪乳糖消化性状的LCT基因多态性检测方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于动物基因工程技术领域，具体地说，本发明涉及猪乳糖酶（LCT）基因多态性位点及其在诊断和治疗猪乳糖不耐受性腹泻中的应用。

背景技术

[0002] 乳糖酶（lactase, LCT）又称β-半乳糖苷酶，在动植物和微生物中广泛存在，根据来源不同可分为胞外酶和胞内酶。在特定条件下乳糖酶能将乳糖水解为葡糖糖和半乳糖，进而被肠道吸收。在哺乳动物(特别是婴儿)，乳糖酶主要存在于小肠粘膜刷状缘，呈灶块状分布，以空肠内活性最高。大多数哺乳动物断奶后，乳糖不再是食物的主要来源，乳糖酶活性逐渐降低，但仍有部分人群乳糖酶活性持续到成年以后。正常情况下，乳糖被乳糖酶水解为半乳糖和葡萄糖才能被吸收利用。当乳糖酶缺乏时，未被吸收的乳糖停留在肠道内，使肠腔内渗透压升高，导致细胞外液水分流入肠道，肠腔内液体量增加，促进肠道蠕动，引起腹泻等症状。同时，未消化的乳糖到达结肠时，一部分被肠道细菌分解成乳酸、丙酸、丁酸等短链脂肪酸和氢气、甲烷、二氧化碳等气体，从而引起腹胀、腹鸣、腹痛等症状，称为乳糖不耐受(Lactase non-persistent, LNP )。

[0003] 研究表明，人的LCT基因在增强子区﹣13910bp处的C/T多态性与LNP有很好的相关性。在欧洲人群体内，位于LCT基因上游增强子区域内-13910*T的单核苷酸多样性能够影响乳糖酶启动子的激活，基因型C/C-13910与乳糖酶活性呈负相关，基因型C/T-13910和T/T-13910与乳糖酶活性呈正相关。而关于猪LCT 基因在该方面的研究则甚少。根据申请者现场试验发现，部分地方猪和野猪的仔猪腹泻，经抗细菌抗病毒等治疗措施无效后，通过食物中添加乳糖酶，其症状可得到缓解，甚至完全消失。该结果提示，猪中也存在LNP，其原因可能是由于LCT基因的多态性导致LCT表达过低而引起。因此，探讨猪LCT基因的多态性与乳糖不耐受性腹泻的关系具有重要意义，也为建立标记辅助选择技术（MAS）开展仔猪乳糖不耐受的抗病育种奠定基础。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供猪乳糖酶（LCT）基因及其多态性与仔猪乳糖不耐受性腹泻的相关性，及其在检测仔猪乳糖不耐受性腹泻方面的用途。

[0005] 本发明提供了一种检测猪乳糖酶（LCT）基因的多态性的方法，包括步骤：

[0006] a、确定LCT基因5’UTR区域-797bp、-308bp和-301bp处的核苷酸；

[0007] b、检测在所述位置是否存在单核苷酸多态性；

[0008] 所述单核苷酸多态性是在5’UTR区域-797bp存在G→A的多态性，即在对应于SEQ ID NO.1所示的序列第172位碱基处存在G→A的多态性；在5’UTR区域-308bp存在G→C的多态性，即在对应于SEQ ID NO.1所示的序列第661位碱基处存在G→C的多态性；在5’UTR区域-301bp存在A→G的多态性，即在对应于SEQ ID NO.1所示的序列第668位碱基处存在A→G的多态性。

[0009] 本发明还提供了一种分离核酸，它具有SEQ ID NO.1所示的序列，该序列的第172位为A；第661位为C；第668位为G。

[0010] 本发明还提供了一组用于PCR-SSCP的核酸引物，其特征在于，其扩增引物序列如SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5所示，且特异性地扩增出含LCT基因5'UTR区域的SEQ ID NO:1所示序列中第172位单核苷酸多态性的扩增产物。

[0011] 本发明还提供了一组用于PCR产物直接测序法的核酸引物，其特征在于，其扩增引物序列如SEQ ID NO:6和SEQ ID NO:7所示，且特异性地扩增出含LCT基因5'UTR区域的SEQ ID NO:1所示序列中第661位和第668位单核苷酸多态性的扩增产物。

[0012] 本发明还提供了一种用于检测乳糖不耐受性腹泻易感性的方法，该方法为抽提被测试猪的基因组DNA，检测被测试者的TCL基因5'UTR区域的SEQ ID NO:1所示序列中第172位、第661位和第668位的单核苷酸多态性位点的基因型，检测被测试者对乳糖不耐受性腹泻的易感性。若被测试者为地方猪或野猪，第172位为GG基因型或第661位和第668位为GAGA基因型，被测试者的乳糖不耐受性腹泻易感性高。

[0013] 本发明还提供了一种用于检测乳糖不耐受性腹泻易感性的方法，该方法为抽提被测试猪的基因组DNA，检测被测试者的TCL基因5'UTR区域的SEQ ID NO:1所示序列中第172位、第661位和第668位所构成的单倍型，检测被测试者对乳糖不耐受性腹泻的易感性。
若被测试者为地方猪或野猪，单倍型为GGA，被测试者的乳糖不耐受性腹泻易感性高；若其他单倍型，被测试者的乳糖不耐受性腹泻易感性较低。

[0014] 发明人的研究结果均表明LCT基因5'UTR的多态性位点与仔猪乳糖不耐受性腹泻相关，因此这一点可被作为乳糖不耐受性腹泻易感性的检测。通过标记辅助选择（MAS）技术选择LCT有利于乳糖消化性状的等位基因型或单倍型个体留种、淘汰引起乳糖不耐受性腹泻的基因型或单倍型个体，可以显著改善种群哺乳仔猪对乳糖的消化能力，降低乳糖不耐受所引起的腹泻，减少仔猪死亡率。

附图说明

[0015] 图1是本发明鉴别的猪LCT 基因5'UTR区域SNP G-797A突变位点的序列比对峰图；

[0016] 图2是本发明鉴别的猪LCT基因5'UTR区域SNP G-308C和A-301G突变位点的序列比对峰图；

[0017] 图3是LCT基因5'UTR区域SNP G-797A的基因型判定图，其中泳道3、5、6基因型为GG，泳道8、9、10、12基因型为AA，泳道1、2、4、7、11、13基因型为GA；

[0018] 图4是Caco-2细胞系中LCT基因5'UTR区域表达载体的荧光信号值比较。

具体实施方式

[0019] 以下结合具体实施例，对本发明作进一步的说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

[0020] 实施例1、样本的收集和DNA提取

[0021] 本发明所涉及引进猪种（大白、长白和杜洛克）仔猪样本采自沈阳正成原种猪场，地方猪和野猪（荷包猪、民猪、长白山野猪）仔猪样本采自辽宁圣野特种牧业公司。其中大白猪76头、长白猪73头、杜洛克75头、荷包猪87头、民猪73头、长白山野猪83头，共467头哺乳仔猪个体为试验动物。仔猪饲养到10-14日龄时，观察是否腹泻，并采集粪便。取2g新鲜粪便加入37℃ 5ml蒸馏水搅拌离心；取上清，加入醋酸铅0.3g，水浴煮沸1min；再加入2ml 7.14mol/L氢氧化铵，溶液立即变成乳白色；继续加热煮沸3min，静置。根据粉红色沉淀物多少进行乳糖半定量：无沉淀物，乳糖含量为－；可疑者记为±；微量粉红色沉淀，记为+；少量粉红色沉淀记为++；大量粉红色沉淀略带黄色沉淀记为+++。用精密pH试纸测定粪便pH。当粪便乳糖≥ + +，同时pH＜5.5时，确定该样品为乳糖不耐受腹泻。对于腹泻的仔猪个体，饲料中添加乳糖酶0.3g/头，每天一次，连续3天后观察是否腹泻并采集粪便，再次进行粪便乳糖含量和pH测定。若粪便正常，可以进一步确认为乳糖不耐受性腹泻。

[0022] 按常规的酚氯仿异戊醇方法从仔猪耳组织中提取基因组DNA，浓度校正至100ng/μl。

[0023] 实施例2、猪LCT 基因5'UTR区域核酸片段的获得及这些区域SNP位点的筛查[0024] 2.1、从NCBI网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）查询猪LCT 基因5'UTR序列（包括增强子和启动子）（GenBank: Y08677.1），应用Oligo6.71软件设计了一对引物，引物对1：F: 5'-TTC CTG AGT TCC AAA GAG TG-3'(SEQ ID NO:2)；R: 5'-TAG GAA CTG TTA GGA GGT ATG-3'(SEQ ID NO:3)（F表示正向引物，R表示反向引物），引物由上海生工公司合成。

[0025] 2.2、PCR的扩增

[0026] 测序筛查了6种国内外猪种（大白猪16头、长白猪14头、杜洛克16头、荷包猪18头和民猪14头、长白山野猪13头）的基因组DNA。PCR反应总体系为25μl，PCR反应组分2+
如下：10×LA PCR BufferⅡ（(Mg Plus）2μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)0.25μL，dNTP Mixture(各2.5 mM)4μL，引物（20 uM）各1μL，DNA模板50ng，加灭菌蒸馏水至25μL。

[0027] PCR扩增的反应程序为:94℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物的片段大小为976bp。

[0028] 2.3、PCR产物回收纯化后克隆、转化和DNA测序

[0029] 用PCR产物回收纯化试剂盒（AxyGen 生物公司）将PCR产物切胶回收纯化。将回收纯化的目的片段与pMD18-T载体连接，将连接过夜的产物加入到感受态细胞DH5a进行转化。将转化产物均匀涂于LB琼脂平板。挑取阳性单克隆菌落扩大培养并提取质粒DNA鉴定。将鉴定的质粒DNA送宝生物工程（大连）有限公司进行两端测序。

[0030] 对测序结果采用DNAMan软件比对分析，发现3个单核苷多态性位点，结果见表1及图1、2。3个单核苷多态性位点均具有SEQ ID NO:1所示的序列。

[0031] 表1：猪LCT基因5'UTR区三种SNP的分布及等位基因

[0032]SNP 分别区域 等位基因
G-797A 增强子 G/A
G-308C 启动子 G/C
A-301G 启动子 A/G

[0033] 经分析，SNP G-308C和A-301G呈紧密连锁的关系，即SNP G-308C为G时，SNP A-301G为A，而当SNP G-308C位为C时，SNP A-301G位为G，因此形成2种启动子多态性GA和CG。

[0034] 实施例3、试验猪群LCT 基因5'UTR区SNP G-797A的检测

[0035] 采用PCR-SSCP（single-strand conformation polymorphism, SSCP单链构象多态性）的方法。设计引物对2（F：5'-TAA ACA AAG CCA AGG ACA TT-3'(SEQ ID NO:4)；R：5'-CTG GGG TGT ATG TGC TTG TGG-3'(SEQ ID NO:5)）扩增个体基因组DNA。PCR扩增产物大小为147bp。将147bp的PCR产物95℃ 3min变性后，加样于12%的聚丙烯酰胺凝胶（30ml工作液的配制为：12ml 30%丙烯酰胺，3ml 50%甘油，3ml 10×TBE，210μl 10%过硫胺酸，12μl TEMED，加入12ml纯水），进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳（130V，电泳11-14小时），电泳结束后采用硝酸银染色，并拍照。具体判型方法如附图3所示。

[0036] 实施例4、试验猪群LCT 基因5'UTR区SNP G-308C和A-301G的检测[0037] 采用PCR产物直接测序的方法。设计引物对3（F：5'-AAA AAG TTT GGT AAG GAC CT-3'(SEQ ID NO:6)；R：5'-GGA ACT GTT AGG AGG TAT GTG-3'(SEQ ID NO:7)），通过热启动和梯度PCR反应进行DNA扩增，扩增产物长度316bp。采用96孔Millipore MultiScreen对PCR产物进行纯化。纯化后，利用ABI PRISM Big-Dye测序试剂盒，分别对PCR产物进行正反向测序反应。测序产物经乙醇纯化后在ABI3730自动测序仪进行毛细管电泳和序列测定，获得序列色谱图ABI文件。通过Phred-Phrap-PolyPHRED- Consed软件包进行测序峰图的多重比对和对多态性位点的判读。

[0038] 实施例5、猪LCT 基因5'UTR区多态性与乳糖不耐受性腹泻的相关分析[0039] 5.1、猪LCT 基因5'UTR区基因型与乳糖不耐受性腹泻的相关分析[0040] 采用上述PCR-SSCP和PCR产物直接测序法对467头仔猪个体进行SNP G-797A、G-308C和A-301G的基因型判定，结果见表2。

[0041] 表2 LCT基因多态性在试验猪群的基因和基因型频率

[0042]

[0043] 对引进猪种、地方猪及野猪的群体分别进行基因和基因型频率的Hardy–Weinberg平衡定律检验，除引进猪种的增强子位点外，均处于平衡状态。采用SPSS软件包（version17.0）的 检验统计模型分析基因型与乳糖不耐受性腹泻的相关关系，可见SNP G-797A的GG基因型、SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型分别与地方猪和野猪的乳糖不耐受性腹泻显著相关，其他基因型与野猪/地方猪或引进猪种中乳糖不耐受性腹泻性状相关不显著。因此，在种猪育种中，可以淘汰SNP G-797A的GG基因型或SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型个体，以降低乳糖不耐受性腹泻的发生率。

[0044] 5.2、猪LCT 基因5'UTR区单倍型与乳糖不耐受性腹泻的相关分析[0045] 通过人工方式计算出试验群体LCT基因5'UTR区的G-797A、G-308C和A-301G个体单倍型。由于启动子多态性位点G-308C和A-301G呈现完全紧密连锁，因此猪LCT基因多态性仅有4种单倍型；单倍型在试验群体的分布见表3；采用SPSS软件包（version17.0）的 检验统计模型分析单倍型与乳糖不耐受性腹泻的相关关系。

[0046] 表3 LCT基因5'UTR区单倍型与乳糖不耐症性腹泻的相关分析

[0047]

[0048] 由表3可以看到，在野猪和地方猪群体中，单倍型GGA与乳糖不耐受性腹泻性状极显著相关，其他3种单倍型相关不显著。在引进猪种中，仅有2种单倍型，且与乳糖不耐受性腹泻性状不相关。因此，种猪育种中，淘汰LCT基因单倍型GGA个体，保留其他单倍型个体，可以提高猪群健康状况，降低乳糖不耐受性腹泻发生率。

[0049] 根据表2、3试验结果，在进行地方猪或野猪的纯繁、以及地方猪或野猪与引进猪种的杂交育种过程中，通过标记辅助选择（MAS），淘汰SNP G-797A的GG基因型或SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型或单倍型GGA个体，可以避免后代出现LNP，显著提高猪群仔猪消化乳糖能力，减少由于LCT缺乏引起的仔猪腹泻，降低仔猪死亡率。

[0050] 实施例6、猪LCT 5'UTR区单倍型双荧光报告系统实验

[0051] 选取LCT基因5'UTR区G-797A、G-308C和A-301G位点纯合基因型个体DNA样本作为模板，采用引物对4（F: 5'-CTA GCT AGC AAA AAG TTT GGT AAG GAC CT-3'(SEQ ID NO:8)；R：5'-CGG AAG CTT GGA ACT GTT AGG AGG TAT GTG-3'(SEQ ID NO:9)）扩增SNP G-308C和SNP A-301G片段334bp，使G-308C和A-301G位点包含其中；采用引物对5（F:5'-TCG GGG TAC CGA TAT GCA GAA ATA AAG GTA G-3'(SEQ ID NO:10)；R：5'-TCG CGA GCT CTT TCA GTA TCT GCA AAA CAG T-3'(SEQ ID NO:11)）扩增SNP G-797A片段165bp，使G-797A位点包含其中。

[0052] PCR反应总体系为25μl，PCR反应组分如下：10×LA PCR BufferⅡ（(Mg2+ Plus）2μL，TaKaRa LA Taq(5 U/μL)0.25μL，dNTP Mixture(各2.5 mM)4μL，引物（20 uM）各
1μL,DNA模板50ng,加灭菌蒸馏水至25μL。

[0053] 启动子区SNP G-308C和SNP A-301G的PCR扩增反应程序为:94 ℃预变性5min；94℃变性30s；55℃退火30s，72℃延伸40s，共35个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存，PCR扩增产物的片段大小为316bp。

[0054] 增强子区SNP G-797A的PCR扩增的反应程序为:94℃预变性5min；94℃变性30s；50℃退火30s，72℃延伸30s，共30个循环，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR扩增产物的片段大小为145bp。

[0055] 分别扩增得到启动子SNP G-308C和SNP A-301G的ProGA和ProCG、增强子SNP G-797A的EnhG和EnhA的克隆片段，将2种不同启动子和4种增强子及启动子单倍型分别插入pGL3.0 Basic荧光素酶报告基因载体，克隆后经测序排除突变。除空白对照组外，构建6种重组质粒：ProGA-pGL3.0 Basic、ProCG-pGL3.0 Basic、EnhG-ProGA-pGL3.0 Basic、EnhG-ProCG-pGL3.0 Basic、EnhA-ProGA-pGL3.0 Basic和EnhA-ProCG-pGL3.0 Basic，分别®转染人结直肠腺癌细胞Caco-2细胞。采用Dual-Glo 萤光素酶检测系统用多功能酶标仪测量Firefly（F值）和Renilla（R值）的荧光信号值。F/R比值即代表增强子及启动子的活性。每个实验组取4个孔的平均值，实验数据采用SPSS软件包（version17.0）的LSD方法分析，结果见表4和图4。

[0056] 表4 Caco-2细胞系中LCT基因增强子和启动子的荧光信号值比较[0057]组别 N F/R比值（Mean±SEM）
pGL3.0Basic 4 0.2278±0.0417Cc
ProGA-pGL3.0Basic 4 0.4787±0.2137Bc
ProCG-pGL3.0Basic 4 1.5971±0.0648Aa
EnhA-ProGA-pGL3.0Basic 4 1.096±0.1701ABb
EnhA-ProCG-pGL3.0Basic 4 0.6089±0.1442Bc
EnhG-ProGA-pGL3.0Basic 4 0.2987±0.0816Cc
EnhG-ProCG-pGL3.0Basic 4 0.6229±0.1871BCc

[0058] 注：数字右上角大写字母不同，表示差异极显著（P ＜0.01）；小写字母不同，表示差异显著（P＜0.05）

[0059] 由表5可见：启动子SNP G-308C和SNP A-301G的GA和CG相比差异极显著（P =0.001），启动子CG强烈促进基因表达，而GA不能促进基因表达。增强子SNP G-797A的A，对于启动子GA来说，确实起到增强作用，使启动子GA活性显著增强（P﹤0.05）；对于启动子CG来说，却是抑制子，使启动子CG活性极显著降低(P ﹤0.01)。增强子SNP G-797A的G，无论是哪一种启动子，均起显著的抑制作用 (P﹤0.01)。猪LCT 5'UTR区增强子和启动子多态性位点组合形成的单倍型促进基因表达的作用从高到低顺序为：增强子A﹢启动子GA﹥增强子A/G﹢启动子CG﹥增强子G﹢启动子GA。这一结果与实施例5的研究结果一致，表明猪LCT基因5'UTR区增强子SNP G-797A和启动子SNP G-308C及SNP A-301G组合形成的单倍型与乳糖不耐症腹泻显著相关，可被用作猪遗传育种中乳糖不耐症的检测。

[0060] 本发明利用首次报道了猪LCT基因5'UTR的多态性位点与仔猪乳糖不耐受性腹泻的相关性。发明人通过对猪LCT 基因重要区域的测序，发现了3个SNPs。通过对6个品种仔猪群体的乳糖不耐受性腹泻个体和正常猪群的研究，同时应用双荧光报告系统在体外证实，在野猪和地方猪中，SNP G-797A的GG基因型或SNP G-308C和SNP A-301G的GAGA基因型或单倍型GGA均与乳糖不耐受性腹泻显著相关，因此这一结果可以在种猪遗传育种中作为一个分子标记用于分子标记辅助选择（MAS）。

[0061] 以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何形式上和实质上的限制，凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用以上所揭示的技术内容，而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对以上实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。