一种SHIV感染性克隆的构建及其应用转让专利
申请号 : CN201310150012.8
文献号 : CN103374550B
文献日 : 2015-03-11
发明人 : 杨荣阁 , 黄黎 , 草川茂 , 孙宾莲
申请人 : 中国科学院武汉病毒研究所
摘要 :
本发明先将嵌合B亚型env基因的毒株SHIV-KB9的全长基因组克隆到低拷贝数载体pBR322上，再以所得质粒SHIV-KB9/pBR322为基因组骨架，并用中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC的env基因对其相应基因片段进行替换，得到感染性克隆SHIV-KBQJ-12；所置换进去的env基因来源于HIV-1CRF08_BC的感染性克隆株QJ001，包括gp120和gp41的整个胞内区、跨膜区和部分胞外区，被置换进去的env基因的位置对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249；本发明操作简便，成功率高，在短时间内获得所述感染性克隆，用于建立SHIV/中国恒河猴感染模型。
权利要求 :
1.一种SHIV-KBQJ-12感染性克隆的构建方法，SHIV-KBQJ-12嵌合了中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC的env基因，其来源于HIV-1CRF08_BC的感染性克隆株QJ001，包括gp120和gp41的整个胞内区、跨膜区和部分胞外区，被置换进去的env基因的位置对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249；对QJ001的全长基因组序列进行进化分析显示QJ001属于CRF08_BC亚型，同样对被新置换入SHIV-KBQJ-12的env基因进行进化分析显示SHIV-KBQJ-12属于HIV-1 CRF08_BC亚型；
所述QJ001的保藏号为CCTCC NO：M2013066，所述SHIV-KBQJ-12的保藏号为CCTCC NO：M2013067。
2.根据权利要求1所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于所述的
SHIV-KBQJ-12感染性克隆的构建采用包括以下的步骤：
(1)采用具有低拷贝数的质粒pBR322作为载体，利用HIV/AIDS Reagent Program提供的3’-SHIV-KB9和5’-SHIV-KB9质粒扩增出SHIV-KB9的全长基因组，并连接入pBR322载体中，得到能在STBL3 E.coli中稳定复制的SHIV-KB9/pBR322感染性分子克隆，并以此作为构建SHIV-KBQJ-12的基因组骨架；
(2)利用重叠延伸PCR技术，以SHIV-KB9/pBR322和HIV-1 QJ001为模板，用相应的引物进行扩增并酶切回收得到Sph Ⅰ-PstⅠ和Pst Ⅰ-XhoⅠ两个基因片段，
1)为得到SphI-PstI片段，首先以SHIV-KB9/pBR322为模板，用引物tatSph_A和envSU_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为94℃2min；94℃15s，55℃15s，
72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min，
同时以QJ001为模板，用引物vpuPac_A和envCS_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min，然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物tatSph_A和envCS_B进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min，再用SphI和PstI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pGEM5Zf(-)中，得到亚克隆pKBQJ_SPs，
2)为得到PstI-XhoI片段，首先以SHIV-KB9/pBR322为模板，用引物envECD_A和SIVnef_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，
72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min，
同时以QJ001为模板，用引物envCS_A和envECD_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min，然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物envCS_A和SIVnef_B进行第二轮扩增，第二轮PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；
72℃10min；4℃15min，
再用PstI和XhoI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pBluescriptSK(-)中，得到亚克隆pKBQJ_PsX，
3)将得到的亚克隆pKBQJ_SPs和pKBQJ_PsX分别经测序验证正确后，用SphI和PstI、PstI和XhoI、SphI和XhoI分别双酶切pKBQJ_SPs、pKBQJ_PsX和SHIV-KB9/pBR322，胶回收所需基因片段后连接并转化STBL3E.coli感受态细胞，即可得到正确克隆SHIV-KBQJ-12，其中，引物的序列为：tatSph_A:5’-TTG GCA TGC TGT AGA GCA AGA AAT GGA GCC AGT AG-3’envSU_B:5’-CAG GTA CCC CAT AAT AGA CTG-3’vpuPac_A:5’-TGG TTA ATT AAA AGA ATT AGG GAA AGA GCA G-3’envCS_B:5’-GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC-3’envECD_A:5’-ATT CAT AAT GAT AGT AGG AGG-3’SIVnef_B:5’-AAG AGT CAC TGT CGC AGA TCT CC-3’envCS_A:5’-ATA TGA GGG ACA ATT GGA GAA GTG-3’envECD_B:5’-AAA GGT GAG TAT CCC TGC CTA ACT C-3’。
3.根据权利要求2所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于构建感染性分子克隆SHIV-KB9/pBR322时采用以下的步骤：(1)以载体pBR322为模板，利用引物EE_EcoA和引物EE_Eag_B进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
然后琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，再用EcoRI和EagI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物；
(2)以质粒5’-SHIV-KB9为模板，利用引物KB_U5Eco_A和引物KB_pbs_B进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；
4℃15min；然后琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，再用EcoRI和NarI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物；
(3)对质粒5’-SHIV-KB9用NarI和SphI进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物5.6Kb的基因片段；
同样，对质粒3’-SHIV-KB9用SphI和NotI进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物4Kb的基因片段；
(4)将上述回收的四个基因片段连接，转化STBL3E.coli感受态细胞，即可得到正确克隆SHIV-KB9/pBR322；
其中，引物的序列为：
EE_EcoA:5’-TGT GAA TTC GCA AAC CAA CCC TTG GCA G-3’EE_Eag_B:5’-AAA CGG CCG CGT GAT ACG CCT ATT-3’KB_U5Eco_A:5’-AGC GAA TTC TAG ACA TAT ACT TAG AAA AGG AAG-3’KB_pbs_B:5’-TGT TCA GGC GCC AAT CTG CTA G-3’。
4.根据权利要求1所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于制备
SHIV-KBQJ-12病毒时，使用Lipofectamine 2000转染试剂将核酸序列确认无误的SHIV-KBQJ-12质粒转染293T细胞，于转染48小时后收集病毒上清即可。
5.根据权利要求1所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于将SHIV-KBQJ-12病毒转染293T细胞系后，收集细胞制成超薄切片，在透射电镜下可以观察到SHIV-KBQJ-12在293T细胞中成功组装出完整的病毒颗粒，表明SHIV-KBQJ-12嵌合病毒各基因得到成功表达并正确发挥了功能。
6.根据权利要求1所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于利用
GHOST-CD4-CXCR4和GHOST-CD4-CCR5两种细胞系，通过流式细胞仪检测表达不同辅助受体的Ghost细胞中被激发表达GFP的细胞数量，从而测定出SHIV-KBQJ-12病毒是以CCR5作为辅助受体，具有巨噬细胞嗜性的特性。
7.根据权利要求1所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于采用以下检测方法判断SHIV-KBQJ-12病毒在人或恒河猴淋巴细胞中的复制能力：6
用500ng SHIV-KBQJ-12病毒感染用PHA刺激72小时的4×10 人或恒河猴的PBMC细胞，37℃，5％CO2孵育过夜，在第0天移去病毒上清液，并用含25U/ml IL-2及10％胎牛血清的1640培养基培养细胞，然后在感染第3、6、9、12、15、18、21天，收集上清样本，分装后6
于-80℃冻存以备检测SIV p27抗原使用，并调整细胞浓度为2×10 个/ml，用含25U/ml IL-2及10％胎牛血清的1640培养基继续培养；
通过测定在上述不同时间点收集的上清标本的p27蛋白表达量绘制感染曲线，可得知SHIV-KBQJ-12病毒在人和恒河猴的PBMC细胞中都能进行产毒性的复制。
8.根据权利要求1所述的SHIV感染性克隆的构建方法，其特征在于采用以下检测方法判断SHIV-KBQJ-12病毒在恒河猴体内的生物学特性：将6000ng的SHIV-KBQJ-12病毒以后肢静脉注射的方式接种两只健康中国恒河猴，然后按下述时间点采集恒河猴静脉EDTA抗凝血：第一个月每周采集2次，之后每周采集一次；
将上述在不同时间点采集的恒河猴静脉EDTA抗凝血中的基因组DNA提取出来，并对Gag区长度为477bp的特异性片段进行扩增，以确认SHIV-KBQJ-12病毒是否已经整合到恒河猴基因组中，是否在猴体内建立起产毒性感染；
接种病毒98天后，对上述两只恒河猴实行安乐死，采集各种组织，提取各组织中DNA和RNA，用PCR扩增的方法检测各组织中RNA和DNA的Gag区长度为477bp的特异性片段，以进一步证实SHIV-KBQJ-12病毒对恒河猴的感染性；
结果显示，上述两只恒河猴分别在第6天和第12天开始起即建立了稳定的产毒性感染，病毒基因组也整合到恒河猴基因组中；SHIV-KBQJ-12病毒主要分布在生殖系统、中枢神经系统和肠相关淋巴组织中。
9.保藏号为CCTCC NO：M2013067的SHIV-KBQJ-12感染性克隆，其在建立SHIV/中国恒河猴感染模型中的应用。
说明书 :
一种SHIV感染性克隆的构建及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及基因重组技术领域，具体涉及一株嵌合中国人免疫缺陷病毒Ⅰ型（Human immunodeficiency virus-1,HIV-1）主要流行毒株CRF08_BC env基因的新型嵌合猴/人免疫缺陷病毒（Chimeric simian/human immunodeficiency virus,SHIV）感染性克隆的构建方法，同时还涉及利用该SHIV感染性克隆建立SHIV/恒河猴感染模型。
[0002] 本发明是基于国际上广泛使用的高致病性强毒株SHIV-89.6P的分子克隆株SHIV-KB9和本实验室构建的HIV-1CRF08_BC的感染性分子克隆QJ001的研究成果。其中，由HIV/AIDS Reagent Program提供的3’-SHIV-KB9和5’-SHIV-KB9质粒可扩增出SHIV-KB9的全长基因组；感染性分子克隆QJ001保存于大肠杆菌STBL3中，该大肠杆菌命名为STBL3/QJ001（Escherichia coli STBL3/QJ001），由中国典型培养物保藏中心保藏（地址：中国，武汉大学生命科学学院，武汉市武昌区八一路299号，430072），保藏日期是2013年3月5日，保藏号是CCTCC NO：M2013066；本发明构建所得感染性分子克隆SHIV-KBQJ-12保存于大肠杆菌STBL3中，该大肠杆菌命名为STBL3/SHIV-KBQJ-12（Escherichia coli STBL3/SHIV-KBQJ-12），由中国典型培养物保藏中心保藏（地址：中国，武汉大学生命科学学院，武汉市武昌区八一路299号，430072），保藏日期是2013年3月5日，保藏号是CCTCC NO：M2013067。
背景技术
[0003] 人免疫缺陷病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）感染导致的艾滋病（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），由于其蔓延速度快、死亡率高，现已成为威胁全球公众健康最大的问题。
[0004] 研制安全、有效、价廉的HIV疫苗是遏制艾滋病蔓延最为有效的方法，但是在HIV疫苗开展临床研究之前，需要通过在动物模型上进行大规模的试验来评价疫苗的安全性、有效性和免疫策略。目前缺乏理想的HIV疫苗评价动物模型是限制研究疫苗取得突破性进展的主要因素之一。因此，我们迫切需要构建一个理想的动物模型来评价疫苗的安全性和有效性，并对疫苗的组合进行选择，对免疫策略进行优化。
[0005] 由于HIV-1仅能感染人和黑猩猩，而黑猩猩是十分濒危的动物，来源有限并且价格昂贵，不能大量使用，并且HIV-1病毒在黑猩猩体内复制的载量水平很低，也不表现出任何疾病症状，因此不适合作为实验动物；曾经被研究者们认为是研究HIV致病和预防机制“黄金标准”的猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus,SIV）/恒河猴模型，由于SIV与HIV在核苷酸和氨基酸水平上同源性较差，并且二者血清学交叉反应有限，因此，使用这个模型具有很大局限性。目前应用最为广泛的AIDS灵长类动物模型是SHIV/恒河猴模型。
[0006] SHIV，即SIV/HIV嵌合病毒，是利用基因重组技术，将SIV和HIV的相应基因进行置换而构建出来的重组嵌合病毒。其生物学特性兼具亲本株HIV和SIV的特性，所以其接种恒河猴后所诱发的猴AIDS模型更接近人类AIDS。
[0007] 传统的SHIV是在致病的SIVmac239基因框架上剔除其env、tat和rev基因，用HIV-1的相应基因片段替代而构建的重组病毒。SHIV病毒可以有效地感染恒河猴等灵长类动物，并且多次传代后得到的致病性SHIV强毒株可以在短时间内诱导被感染的动物发生AIDS疾病。SHIV/恒河猴模型在研究HIV-1包膜蛋白(envelope)的感染性和致病性以及针对HIV-1包膜蛋白设计的艾滋病疫苗免疫评价方面可以发挥重要作用；在研究特定的细胞嗜性、辅助受体的使用及免疫反应的主要靶位点等方面也是很好的工具。
[0008] 由于HIV各亚型毒株env包膜蛋白基因存在很大差异，因此需构建一系列携带HIV-1不同亚型、不同毒株env包膜蛋白基因的SHIV。目前构建成功的SHIV主要利用的包膜蛋白基因来源于HIV B亚型毒株。其中，最具代表性的是高致病性强毒株SHIV-89.6P和SHIV-KU1。SHIV-KB9是SHIV-89.6P的分子克隆株，在国际上已经被广泛应用，接种恒河猴+后可导致CD4 淋巴细胞快速耗竭并发生AIDS疾病，在本专利中被用作构建新型SHIV的基因组骨架。
[0009] 然而，B亚型在世界上并不占主导，在全球感染者中只占不足10%。因此，目前广泛利用的SHIV病毒不能反映HIV-1流行病学的遗传差异。中国疾病预防控制中心性病艾滋病预防控制中心（NCAIDS）分别于1996年和2002年在全国范围内进行了二次大规模的HIV分子流行病学调查，结果显示：目前中国流行的HIV-1毒株主要是B’、CRF_BC和CRF_AE亚型。并且在1999年到2002年这段时间内，CRF_BC亚型所占比例增幅比较大，到2002年时已跃居第一，达到50.2%左右。CRF_BC是B’亚型（泰国B）和C亚型重组产生的新的流行重组株，所以CRF_BC的env基因和C亚型的env基因虽然高度同源但也并不完全一样。CRF_BC包括CRF07_BC亚型和CRF08_BC亚型，是中国特有的亚型，可能获得了某种传播优势而有加速HIV流行的趋势。但截至目前，仅仅有4株基于C亚型env基因构建的SHIV毒株，包括SHIV-CHN19、SHIV-MJ4、SHIV-MCGP1.3和SHIV-1157ipd3N4，及3株基于CRF07_BC env基因构建的SHIV毒株，包括SHIV-XJ02170、SHIV-XJDC6431和SHIV-CN97001；但是这些毒株大部分都不能在猴体内引起猴AIDS疾病，仅仅只有SHIV-1157ipd3N4是目前唯一的一株C亚型致病性强毒株。并且，至今仍未见任何嵌合CRF08_BC env基因SHIV毒株的相关报道，因此出于CRF08_BC在我国感染者中所占的比例和该毒株表现出的传播优势考虑，我们迫切需要基于HIV-1CRF08_BC亚型构建一个嵌合了中国HIV主要流行毒株CRF08_BC env基因的新型SHIV感染性分子克隆，从而建立基于中国HIV流行株设计的SHIV/恒河猴模型并利用此模型对艾滋病候选疫苗及药物进行评价，这对于中国艾滋病的防治工作是具有比较深远的意义的。
[0010] 此外，由于一般仅能在HIV-1感染的早期检测到CCR5嗜性的毒株的存在，而随着艾滋病病程的进展才能逐渐检测到双嗜性和CXCR4嗜性的毒株。而目前世界上大多数具有致病性的SHIV嵌合病毒所利用的env基因都来源于CXCR4嗜性的HIV-1毒株（如NL432）或CXCR4和CCR5双嗜性的HIV-1毒株（如89.6），这种双嗜性HIV-1毒株也主要利用CXCR4+作为辅助受体。这些SHIV病毒感染宿主细胞后会引起CD4 淋巴细胞的持续下降，表现出更多HIV-1晚期感染的特征，不能很好地模拟HIV-1自然侵染所引起的宿主淋巴细胞缺失的动态变化。因此，构建一个具有CCR5嗜性的SHIV毒株也是很有必要的，这样能更好地模拟HIV-1早期感染的特征，并且其对中和抗体的抵抗力也使其能用于对艾滋病预防疫苗的评价中。
发明内容
[0011] 本发明的目的是在于提供一种简单的方法来构建嵌入来源于各种HIV毒株env基因的新型SHIV质粒，并可在短时间内迅速获得新的SHIV病毒，从而可以分析该病毒的生物学特性。
[0012] 本发明的另一个目的是在于提供一个嵌合了中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC env基因的新型SHIV感染性分子克隆，并利用该感染性分子克隆转染293T细胞后得到的SHIV病毒初步建立了SHIV/恒河猴模型。将此原代SHIV病毒在恒河猴体内进行连续性传代实验，可进一步提高其毒力和致病性，有望得到一株高致病性强毒株，可以用于研究HIV-1的致病机制并对针对HIV-1包膜蛋白设计的艾滋病疫苗和药物进行免疫评价。
[0013] 为达到以上目的，本发明采用以下的技术方案：
[0014] 本发明提供的SHIV感染性克隆的构建，其主要方法是：该SHIV感染性克隆SHIV-KBQJ-12嵌合了中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC的env基因，其来源于HIV-1CRF08_BC的感染性克隆株QJ001，包括gp120和gp41的整个胞内区、跨膜区和部分胞外区，被置换进去的env基因的位置对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249；对QJ001的全长基因组序列进行进化分析显示QJ001属于CRF08_BC亚型，同样对被新置换入SHIV-KBQJ-12的env基因进行进化分析显示SHIV-KBQJ-12属于HIV-1CRF08_BC亚型；
[0015] 所述感染性分子克隆QJ001（Escherichia coli STBL3/QJ001）保藏号为CCTCC NO：M2013066，所述感染性分子克隆SHIV-KBQJ-12（Escherichia coli STBL3/SHIV-KBQJ-12）保藏号为CCTCC NO：M2013067。
[0016] 本发明可以采用包括以下的步骤构建所述的SHIV-KBQJ-12感染性克隆：
[0017] （1）采用具有低拷贝数的质粒pBR322作为载体，利用HIV/AIDS Reagent Program提供的3’-SHIV-KB9和5’-SHIV-KB9质粒扩增出SHIV-KB9的全长基因组，并连接入pBR322载体中，得到能在STBL3E.coli中稳定复制的SHIV-KB9/pBR322感染性分子克隆，并以此作为构建SHIV-KBQJ-12的基因组骨架；
[0018] （2）利用重叠延伸PCR技术，以SHIV-KB9/pBR322和HIV-1QJ001为模板，用相应的引物进行扩增并酶切回收得到SphⅠ-PstⅠ和PstⅠ-XhoⅠ两个基因片段；再将SphⅠ-PstⅠ连接入载体pGEM5Zf(-)中得到亚克隆pKBQJ_SPs，将PstⅠ-XhoⅠ连接入载体pBluescriptSK(-)中得到亚克隆pKBQJ_PsX；最后将得到的亚隆pKBQJ_SPs和pKBQJ_PsX分别经测序验证正确后，用SphI和PstI、PstI和XhoI、SphI和XhoI分别双酶切pKBQJ_SPs、pKBQJ_PsX和SHIV-KB9/pBR322，胶回收所需基因片段后连接、转化STBL3E.coli挑取正确单克隆即可得到所述SHIV-KBQJ-12。
[0019] 本发明构建感染性分子克隆SHIV-KB9/pBR322时可以采用以下的步骤：
[0020] （1）以载体pBR322为模板，利用引物EE_EcoA和引物EE_Eag_B进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃15min；然后琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，再用EcoRI和EagI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物；
[0021] （2）以质粒5’-SHIV-KB9为模板，利用引物KB_U5Eco_A和引物KB_pbs_B进行PCR扩增，PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min；然后琼脂糖凝胶回收PCR扩增产物，再用EcoRI和NarI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切后琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物；
[0022] （3）对质粒5’-SHIV-KB9用NarI和SphI进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物约5.6Kb的基因片段；
[0023] 同样，对质粒3’-SHIV-KB9用SphI和NotI进行双酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物约4Kb的基因片段；
[0024] （4）将上述回收的四个基因片段连接，转化STBL3E.coli感受态细胞，即可得到正确克隆SHIV-KB9/pBR322；
[0025] 其中，引物的序列为：
[0026] EE_EcoA:5’-TGT GAA TTC GCA AAC CAA CCC TTG GCA G-3’
[0027] EE_Eag_B:5’-AAA CGG CCG CGT GAT ACG CCT ATT-3’
[0028] KB_U5Eco_A:5’-AGC GAA TTC TAG ACA TAT ACT TAG AAA AGG AAG-3’[0029] KB_pbs_B:5’-TGT TCA GGC GCC AAT CTG CTA G-3’。
[0030] 本发明在得到基因组骨架SHIV-KB9/pBR322之后，可以采用以下步骤构建SHIV-KBQJ-12感染性分子克隆：
[0031] （1）为得到SphI-PstI片段，首先以SHIV-KB9/pBR322为模板，用引物tatSph_A和envSU_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
[0032] 同时以QJ001为模板，用引物vpuPac_A和envCS_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
[0033] 然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物tatSph_A和envCS_B进行第二轮PCR扩增，第二轮PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
[0034] 再用SphI和PstI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pGEM5Zf(-)中，得到亚克隆pKBQJ_SPs；
[0035] （2）为得到PstI-XhoI片段，首先以SHIV-KB9/pBR322为模板，用引物envECD_A和SIVnef_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
[0036] 同时以QJ001为模板，用引物envCS_A和envECD_B进行第一轮PCR扩增，此PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
[0037] 然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物envCS_A和SIVnef_B进行第二轮扩增，第二轮PCR扩增反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min；
[0038] 再用PstI和XhoI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pBluescriptSK(-)中，得到亚克隆pKBQJ_PsX；
[0039] （3）将得到的亚克隆pKBQJ_SPs和pKBQJ_PsX分别经测序验证正确后，用SphI和PstI、PstI和XhoI、SphI和XhoI分别双酶切pKBQJ_SPs、pKBQJ_PsX和SHIV-KB9/pBR322，胶回收所需基因片段后连接并转化STBL3E.coli感受态细胞，即可得到正确克隆SHIV-KBQJ-12；
[0040] 其中，引物的序列为：
[0041] tatSph_A:5’-TTG GCA TGC TGT AGA GCA AGA AAT GGA GCC AGT AG-3’[0042] envSU_B:5’-CAG GTA CCC CAT AAT AGA CTG-3’
[0043] vpuPac_A:5’-TGG TTA ATT AAA AGA ATT AGG GAA AGA GCA G-3’[0044] envCS_B:5’-GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC-3’
[0045] envECD_A:5’-ATT CAT AAT GAT AGT AGG AGG-3’
[0046] SIVnef_B:5’-AAG AGT CAC TGT CGC AGA TCT CC-3’
[0047] envCS_A:5’-ATA TGA GGG ACA ATT GGA GAA GTG-3’
[0048] envECD_B:5’-AAA GGT GAG TAT CCC TGC CTA ACT C-3’。
[0049] 本发明制备SHIV-KBQJ-12病毒时，可以使用Lipofectamine2000转染试剂将核酸序列确认无误的SHIV-KBQJ-12质粒转染293T细胞，于转染48小时后收集病毒上清即可。
[0050] 本发明将SHIV-KBQJ-12病毒转染293T细胞系后，收集细胞制成超薄切片，在透射电镜下可以观察到SHIV-KBQJ-12在293T细胞中成功组装出完整的病毒颗粒，表明SHIV-KBQJ-12嵌合病毒各基因得到成功表达并正确发挥了功能。
[0051] 本发明可以利用GHOST-CD4-CXCR4和GHOST-CD4-CCR5两种细胞系，通过流式细胞仪检测表达不同辅助受体的Ghost细胞中被激发表达GFP的细胞数量，从而测定出SHIV-KBQJ-12病毒是以CCR5作为辅助受体，具有巨噬细胞嗜性的特性。
[0052] 本发明可以采用以下检测方法判断SHIV-KBQJ-12病毒在人或恒河猴淋巴细胞中的复制能力：
[0053] 用500ng SHIV-KBQJ-12病毒感染用PHA刺激72小时的4×106人或恒河猴的PBMC细胞，37℃，5%CO2孵育过夜，在第0天移去病毒上清液，并用含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基培养细胞，然后在感染第3、6、9、12、15、18、21天，收集上清样本，分装后6
于-80℃冻存以备检测SIV p27抗原使用，并调整细胞浓度为2×10 个/ml，用含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基继续培养；
于-80℃冻存以备检测SIV p27抗原使用，并调整细胞浓度为2×10 个/ml，用含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基继续培养；
[0054] 通过测定在上述不同时间点收集的上清标本的p27蛋白表达量绘制感染曲线，可得知SHIV-KBQJ-12病毒在人和恒河猴的PBMC细胞中都能进行产毒性的复制。
[0055] 本发明可以采用以下检测方法判断SHIV-KBQJ-12病毒在恒河猴体内的生物学特性：
[0056] 将6000ng的SHIV-KBQJ-12病毒以后肢静脉注射的方式接种两只健康中国恒河猴，然后按下述时间点采集恒河猴静脉EDTA抗凝血：第一个月每周采集2次，之后每周采集一次；将上述在不同时间点采集的恒河猴静脉EDTA抗凝血中的基因组DNA提取出来，并对Gag区长度为477bp的特异性片段进行扩增，以确认SHIV-KBQJ-12病毒是否已经整合到恒河猴基因组中，是否在猴体内建立起产毒性感染；
[0057] 接种病毒98天后，对上述两只恒河猴实行安乐死，采集各种组织，提取各组织中DNA和RNA，用PCR扩增的方法检测各组织中RNA和DNA的Gag区长度为477bp的特异性片段，以进一步证实SHIV-KBQJ-12病毒对恒河猴的感染性；
[0058] 结果显示，上述两只恒河猴分别在第6天和第12天开始起即建立了稳定的产毒性感染，病毒基因组也整合到恒河猴基因组中；SHIV-KBQJ-12病毒主要分布在生殖系统、中枢神经系统和肠相关淋巴组织中。
[0059] 本发明提供的上述SHIV-KBQJ-12感染性克隆，其用于建立SHIV/中国恒河猴感染模型。
[0060] 本发明与现有技术相比，具有以下的主要优点：
[0061] （1）本发明构建的SHIV-KBQJ-12感染性克隆嵌合了中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC的env基因，这是到目前为止报道的唯一一株嵌合CRF08_BC env基因的SHIV毒株，并且利用其获得的病毒在健康人和恒河猴的的PBMC中均有较好的复制能力，在健康的中国恒河猴体内也可以建立起稳定的产毒性感染，初步建立了SHIV-KBQJ-12/中国恒河猴模型，可用于对针对CRF08_BC env基因设计的AIDS候选疫苗的有效性和安全性进行评价。
[0062] （2）由于感染性克隆中的env基因生物学功能是确定的，而从临床毒株上扩增的大部分env基因都是没有生物活性的；而SHIV-KBQJ-12感染性克隆利用的env基因来源于HIV-1CRF08_BC的感染性克隆，不同于以前文献报道中利用的HIV-1临床毒株，因此获得新型SHIV的成功率有了明显提高。
[0063] （3）本发明克服了包含SHIV全长基因组的质粒不稳定的困难，将SHIV全长基因组克隆到pBR322载体上，并采用STBL3E.coli为宿主菌，在30℃、180rpm的特殊培养条件下，可以基本维持质粒的稳定性。实验结果表明，利用STBL3E.coli宿主菌对质粒SHIV-KB9/pBR322和SHIV-KBQJ12/pBR322进行大量扩增后，二者的长末端重复序列并没有发生任何缺失。
[0064] （4）本发明方法操作简便，成功率高，难度较小，可以成功构建嵌入不同HIV-1毒株env基因的新型SHIV质粒并可在短时间内迅速获得新的SHIV病毒进而分析该病毒的生物学特性。本次实验，从扩增env基因片段到转染细胞后收获病毒仅仅需要一周时间，可以较大地提高实验效率。
附图说明
[0065] 图1为HIV-1QJ001全长基因序列的进化分析
[0066] 图2为SHIV-KB9/pBR322的质粒图谱。
[0067] 图3为SHIV-KBQJ-12/pBR322的结构图。
[0068] 图4为SphⅠ和AvrⅡ双酶切质粒SHIV-KB9/pBR322和SHIV-KBQJ/pBR322的鉴定图谱。
[0069] 在图4中，0：质粒SHIV-KB9/pBR322双酶切 后产物；1-16：挑取的16 个SHIV-KBQJ/pBR322克隆的双酶切后产物；其中，12即为本发明中的SHIV-KBQJ-12/pBR322；M：最大分子量为15000bp的DNA Marker。
[0070] 图5为SHIV-KBQJ-12/pBR322的env基因序列(HXB2:6103-8249)的进化分析：
[0071] 图6为SHIV-KBQJ-12/pBR322转染293T细胞后的电镜照片。
[0072] 图7为SHIV-KBQJ-12病毒感染健康人PBMC的复制情况。
[0073] 图8为SHIV-KBQJ-12病毒感染健康恒河猴PBMC的复制情况。
[0074] 图9为3号恒河猴接种原代SHIV-KBQJ-12病毒后不同时间点全血中DNA PCR扩增图。
[0075] 在图9中，M：最大分子量为2000bp的DNA Marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3：病毒感染后第0天；4：病毒感染后第3天；5：病毒感染后第6天；6：病毒感染后第9天；7：
病毒感染后第12天；8：病毒感染后第16天；9：病毒感染后第19天。
病毒感染后第12天；8：病毒感染后第16天；9：病毒感染后第19天。
[0076] 图10为4号恒河猴接种原代SHIV-KBQJ-12病毒后不同时间点全血中DNA PCR扩增图。
[0077] 在图10中，M：最大分子量为2000bp的DNA Marker；1：阳性对照；2：阴性对照；3：病毒感染后第0天；4：病毒感染后第3天；5：病毒感染后第6天；6：病毒感染后第9天；7：
病毒感染后第12天；8：病毒感染后第16天；9：病毒感染后第19天。
病毒感染后第12天；8：病毒感染后第16天；9：病毒感染后第19天。
具体实施方式
[0078] 本发明提供的SHIV感染性克隆的构建及其应用，构建时首先将国际上广泛使用的嵌合B亚型env基因的高致病性强毒株SHIV-KB9的全长基因组克隆到低拷贝数载体pBR322上，得到稳定性较高的质粒SHIV-KB9/pBR322。然后以SHIV-KB9/pBR322为基因组骨架，用中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC的env基因对其相应基因片段进行替换，得到嵌合CRF08_BC env基因的感染性克隆SHIV-KBQJ-12。其中新置换进去的env基因来源于HIV-1CRF08_BC的感染性克隆株QJ001，包括gp120和gp41的整个胞内区、跨膜区和部分胞外区，被置换进去的env基因的位置对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249；本发明操作简便，成功率高，难度较小，可在短时间内迅速获得各种新的SHIV病毒进而分析该病毒的生物学特性，并可利用SHIV病毒建立SHIV/恒河猴模型，以研究HIV的致病机制和评价艾滋病候选疫苗。
[0079] 下面结合实施例和附图对本发明作详细说明，但不限定本发明。
[0080] 本发明提供的SHIV感染性克隆的构建，其主要方法是：该SHIV感染性克隆SHIV-KBQJ-12嵌合了中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC的env基因，其来源于HIV-1CRF08_BC的感染性克隆株QJ001，包括gp120和gp41的整个胞内区、跨膜区和部分胞外区，被置换进去的env基因的位置对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249；对QJ001的全长基因组序列进行进化分析显示QJ001属于CRF08_BC亚型，同样对被新置换入SHIV-KBQJ-12的env基因进行进化分析显示SHIV-KBQJ-12属于HIV-1CRF08_BC亚型；
[0081] 所述感染性分子克隆QJ001（Escherichia coli STBL3/QJ001）保藏号为CCTCC NO：M2013066，所述感染性分子克隆SHIV-KBQJ-12（Escherichia coli STBL3/SHIV-KBQJ-12）保藏号为CCTCC NO：M2013067。
[0082] 本发明提供的SHIV感染性克隆的构建，具体是采用以下的步骤：
[0083] 1.对HIV-1感染性克隆QJ001的全长基因组序列进行进化分析：
[0084] 由于被置换入SHIV-KBQJ-12的env基因来源于HIV-1的感染性克隆QJ001，因此用MEGA5.0软件对QJ001的全长基因组序列进行进化分析，相应的参考株序列来自Los Alamos National Laboratory HIV Database（http：//hiv-web.lanl.gov/），进化树结果(如图1所示)显示QJ001属于CRF08_BC亚型，并区别于C亚型和CRF07_BC亚型的毒株，这为后续SHIV-KBQJ-12的构建奠定了基础。
[0085] 2.构建SHIV-KB9/pBR322质粒：
[0086] 携带SHIV全长基因组的质粒因为其含有同向重复序列（5’LTR和3’LTR）而不稳定。由HIV/AIDS Reagent Program提供的SHIV-KB9质粒是由两个质粒组成的，其中一个质粒5’-SHIV-KB9包含5’LTR至vpr基因处所有部分，另一个质粒3’-SHIV-KB9包含tat基因至3’LTR处所有部分。如果想利用上述两个质粒获取病毒，人们必须利用位于vpr基因和tat基因之间的SphⅠ这个酶切位点，分别酶切这两个质粒后使二者连接，然后将所得连接产物直接转染允许细胞（如CEMx174）。因为所得连接产物不是闭合环形，再加上悬浮细胞的转染效率比较低，所以最终得到的转染效率非常的差，以至于我们在转染后不得不等待一个月或者更长的时间才能检测到病毒的产生。
[0087] 而我们建立的系统，采用了具有低拷贝数的质粒pBR322作为载体，利用HIV/AIDS Reagent Program提供的3’-SHIV-KB9和5’-SHIV-KB9质粒扩增出SHIV-KB9的全长基因组，并连接入pBR322载体中，转化STBL3E.coli后得到的SHIV-KB9/pBR322质粒稳定性较高，并且在转染293T细胞后几天内即可检测到病毒的产生。SHIV-KB9/pBR322基因组的结构如图2所示。
[0088] （1）以载体pBR322(购自Invitrogen公司)为模板，利用引物EE_EcoA:5‘-TGT GAA TTC GCA AAC CAA CCC TTG GCA G-3’和引物EE_Eag_B:5‘-AAA CGG CCG CGT GAT ACG CCT ATT-3’扩增其约3Kb的基因片段。在无菌PCR管中加入：10μl5×PrimeSTAR缓2+
冲液(含Mg )，4μl2.5mM dNTPs，10μM上游及下游引物各1μl，2μl模板DNA，0.5μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶（购自大连宝生物公司），加水至50μl总体积。反应条件为：
94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃15min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶（含10ng/ml EB）电泳核实后进行纯化回收，再用EcoRI和EagI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切，酶切反应参照限制性内切酶说明书进行操作，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。
冲液(含Mg )，4μl2.5mM dNTPs，10μM上游及下游引物各1μl，2μl模板DNA，0.5μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶（购自大连宝生物公司），加水至50μl总体积。反应条件为：
94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃3min，30个循环；72℃10min；4℃15min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶（含10ng/ml EB）电泳核实后进行纯化回收，再用EcoRI和EagI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切，酶切反应参照限制性内切酶说明书进行操作，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。
[0089] （2）以质粒5’-SHIV-KB9为模板，利用引物KB_U5Eco_A:5‘-AGC GAA TTC TAG ACA TAT ACT TAG AAA AGG AAG-3’和引物KB_pbs_B:5‘-TGT TCA GGC GCC AAT CTG CTA G-3’2+
扩增其约800bp的基因片段。在无菌PCR管中加入：10μl5×PrimeSTAR缓冲液(含Mg )，
4μl2.5mM dNTPs，10μM上游及下游引物各1μl，2μl模板DNA，0.5μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶（购自大连宝生物公司），加水至50μl总体积。反应条件为：94℃2min；94℃15s，
55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶（含
10ng/ml EB）电泳核实后进行纯化回收，再用EcoRI和NarI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切，酶切反应参照限制性内切酶说明书进行操作，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。
扩增其约800bp的基因片段。在无菌PCR管中加入：10μl5×PrimeSTAR缓冲液(含Mg )，
4μl2.5mM dNTPs，10μM上游及下游引物各1μl，2μl模板DNA，0.5μl PrimeSTAR HS DNA聚合酶（购自大连宝生物公司），加水至50μl总体积。反应条件为：94℃2min；94℃15s，
55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min。PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶（含
10ng/ml EB）电泳核实后进行纯化回收，再用EcoRI和NarI这两个酶对回收的基因产物进行双酶切，酶切反应参照限制性内切酶说明书进行操作，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分离酶切产物。
[0090] （3）参照限制性内切酶说明书对质粒5’-SHIV-KB9用NarI和SphI进行双酶切，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切产物约5.6Kb的基因片段
[0091] 同样，对质粒3’-SHIV-KB9用SphI和NotI进行双酶切，反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳分别分离酶切产物约4Kb的基因片段。
[0092] （4）将上述回收的四个基因片段连接，转化STBL3E.coli感受态细胞（购自Invitrogen公司），30℃平板培养18-20小时后，挑取单克隆接种到5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，180rpm震荡培养14小时左右后，提取质粒并用SphI和XhoⅠ双酶切鉴定所提取出的各个质粒，酶切后得到大小为11.7Kb和2.6Kb两个片段的质粒为正确克隆，并进一步测序以确定其序列的准确性。
[0093] 注：本部分中所涉及的琼脂糖凝胶回收、双酶切、连接和转化等步骤，均采用本领域的常规操作。
[0094] 3.SHIV-KBQJ-12感染性分子克隆的构建：
[0095] 构建SHIV-KBQJ-12感染性分子克隆时，以携带了HIV-1B亚型env基因的高致病性强毒株SHIV-89.6P的分子克隆株SHIV-KB9/pBR322为主要骨架，将从HIV-1CRF08_BC感染性克隆QJ001上扩增得到的env基因与其相应区域进行替换即可得SHIV-KBQJ-12。新置换进去的env基因包括gp120和gp41的整个胞内区、跨膜区和部分胞外区，对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249。SHIV-KBQJ-12的基因结构图如图3所示。
[0096] 由于酶切位点选择的局限性，不能直接将SphI-XhoI基因片段进行替换，而需要以SHIV-KB9/pBR322和QJ001为模板，用巢式PCR的方法分别扩增出两个重组基因片段SphI-PstI和PstI-XhoI，再将这两个片段连接入经SphI和XhoI双酶切后的SHIV-KB9/pBR322中。
[0097] （1）为得到SphI-PstI片段，首先以SHIV-KB9/pBR322为模板，用引物tatSph_A:TTG GCA TGC TGT AGA GCA AGA AAT GGA GCC AGT AG和envSU_B:CAG GTA CCC CAT AAT AGA CTG进行第一轮PCR扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min。；同时以QJ001分别为模板，用引物vpuPac_A:TGG TTA ATT AAA AGA ATT AGG GAA AGA GCA G和envCS_B:GCC CAT AGT GCT TCC TGC TGC TCC进行第一轮PCR扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min。然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物tatSph_A和envCS_B进行第二轮扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；
4℃15min。；；再用SphI和PstI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pGEM5Zf(-)(购自Promega公司)中,得到亚克隆pKBQJ_SPs。
4℃15min。；；再用SphI和PstI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pGEM5Zf(-)(购自Promega公司)中,得到亚克隆pKBQJ_SPs。
[0098] （2）为得到PstI-XhoI片段，同样首先以SHIV-KB9/pBR322为模板，用引物envECD_A:ATT CAT AAT GAT AGT AGG AGG和SIVnef_B:AAG AGT CAC TGT CGC AGA TCT CC进行第一轮PCR扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min。；同时以QJ001为模板，用引物envCS_A:ATA TGA GGG ACA ATT GGA GAA GTG和envECD_B:AAA GGT GAG TAT CCC TGC CTA ACT C分别进行第一轮PCR扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：
94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min。然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物envCS_A和SIVnef_B进行第二轮扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：
94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min。；再用PstI和XhoI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pBluescriptSK(-)(购自Stratagene公司)中,得到亚克隆pKBQJ_PsX。
94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃1min，30个循环；72℃10min；4℃15min。然后以第一轮的两个PCR扩增产物为模板，用引物envCS_A和SIVnef_B进行第二轮扩增，PCR扩增时使用大连宝生物公司的PrimeSTAR HS DNA聚合酶，严格按照说明书进行操作，反应条件为：
94℃2min；94℃15s，55℃15s，72℃2min，30个循环；72℃10min；4℃15min。；再用PstI和XhoI双酶切第二轮扩增产物，并连接入载体pBluescriptSK(-)(购自Stratagene公司)中,得到亚克隆pKBQJ_PsX。
[0099] （3）将得到的亚克隆pKBQJ_SPs和pKBQJ_PsX分别经测序验证正确后，用SphI和PstI、PstI和XhoI、SphI和XhoI分别双酶切pKBQJ_SPs、pKBQJ_PsX和SHIV-KB9/pBR322，胶回收所需基因片段后连接即可。将连接产物转化STBL3E.coli感受态细胞，30℃平板培养18-20小时后，挑取单克隆接种到5mL含有氨苄青霉素的LB液体培养基中，30℃，180rpm震荡培养14小时左右后，提取质粒并用SphI和AvrⅡ双酶切鉴定所提取出的各个质粒，酶切后得到大小为11.2Kb和2.2Kb两个片段的质粒为正确克隆，并进一步测序以确定其序列的准确性。电泳鉴定图如图4所示。
[0100] 注：本部分中所涉及的琼脂糖凝胶回收、双酶切、连接和转化等步骤，均采用本领域的常规操作。
[0101] 4.SHIV-KBQJ-12质粒的小量提取：
[0102] 按照所用质粒提取试剂盒中说明书中的要求进行即可，本实验室采用OMEGA公司TM的E.Z.N.A EndoFee Plasmid Mini KitⅠ，步骤如下：
[0103] （1）将带有质粒的STABLE3接种于5ml含氨苄抗生素的LB液体培养基中，30℃，180rpm摇床培养12-16h；
[0104] （2）取5ml菌液，室温下10000rpm离心1min收集菌体；
[0105] （3）倒弃培养基。加入250ul溶液Ⅰ/RNase A混合液，漩涡震荡使菌体完全悬浮。菌体的完全重悬对于获得高产量是十分重要的；
[0106] （4）往重悬混合液加入250ul溶液Ⅱ，轻轻颠倒混匀7-10次。避免剧烈混合裂解液，否则会使染色体DNA发生断裂，裂解反应不要超过5min；
[0107] （5）加入350ul溶液Ⅲ，并温和颠倒离心管数次至形成白色絮状沉淀，室温，12000rpm离心10min；
[0108] （6）取一个干净的HiBind柱放入一个2ml的收集管中。转移上清至柱子中，室温下10000×g，离心1分钟，使裂解液完全流过柱子，弃去收集管中的滤液；重复第6步至所有混合液都从柱子中滤出。
[0109] （7）将柱子放入一个新的2ml收集管中，加入500ul HB溶液，室温下10000×g离心1min，弃滤液；
[0110] （8）把柱子重新装回收集管，加入700ul DNA Wash Buffer，按上述条件离心，弃滤液。
[0111] 注意：浓缩的DNA Wash Buffer在使用之前必须按标签的提示使用乙醇稀释。
[0112] （9）重复步骤8一次。
[0113] （10）弃滤液，把柱子重新装回收集管，室温下10000×g离心空柱2min以甩干柱子基质。
[0114] 注意：不要忽略此步骤，这对从柱子上出去乙醇至关重要。
[0115] （11）把柱子装在干净的1.5ml离心管上，加入30-50ul预热的Endotoxin-free Elution Buffer到柱子基质上（所加的量取决于预期终产物浓度），室温下静置2min。≥10000×g离心2min，洗脱出DNA。
[0116] （12）分光光度计测定质粒DNA的浓度，分装后-20℃保存。
[0117] 5.SHIV-KBQJ-12质粒的大量提取：
[0118] 由于动物实验的需要，大量制备不含内毒素的SHIV质粒时，采用以下方法进行：
[0119] 将SHIV质粒转化STBL3菌株，30℃平板培养18-20小时后，挑取单克隆接种到3-5mL含有氨苄的LB液体培养基中，30℃，180rpm震荡培养12-14小时后，取1.5mL菌体培养液进行质粒小提，酶切鉴定无误后，取剩余的菌体培养液600μL接种到600mL含有氨苄的LB液体培养基中。30℃、180rpm震荡培养12小时后，取1.5mL菌体培养液再次进行小提，酶切鉴定无误后，参照MN（MACHEREY-NAGEL）公司的说明书，将1L的菌液用NucleoBond Xtra Maxi EF Kit进行质粒的大量制备。步骤如下：
[0120] （1）将菌液于4℃，4500-6000×g离心10min，彻底去除上清，将沉淀重悬于24ml已加了RNase A的RES-EF溶液中，用移液器吹打或用涡旋振荡器使沉淀充分震荡均匀，至无沉淀团块出现；
[0121] （2）加入24ml LYS-EF溶液，轻轻的颠倒离心管5次，室温（18℃-25℃）下静置5min；
[0122] 注意：使用LYS-EF溶液前，应观察该溶液中是否有白色沉淀物出现；如有，则应在30℃-40℃条件下加热该溶液直到所有白色沉淀物完全溶解，再使该溶液温度将至室温后方可使用。
[0123] （3）待裂解充分后加入24ml NEU-EF溶液，并立即轻轻的颠倒离心管10-15次，充分混匀后冰上静置5min；
[0124] （4）用35mL EQU-EF溶液平衡带有圆柱形滤膜的NucleoBond Xtra柱子；
[0125] 沿着圆柱形滤膜的边缘加入EQU-EF溶液，溶液在重力的作用下逐渐通过柱子，确保润湿整个圆柱形滤膜，并保证整个过程中圆柱形滤膜不会干燥。
[0126] （5）将混匀后的裂解产物直接倒入预先平衡好的带有圆柱形滤膜的NucleoBond Xtra柱子中，在重力的作用下过滤之。
[0127] （6）待裂解液完全通过柱子后，用10ml的FIL-EF洗脱液洗脱杂质。
[0128] 注意：应沿着圆柱形滤膜的边缘加入FIL-EF洗脱液，以确保滤膜上没有残留物，否则可能会降低质粒的产量。
[0129] （7）待洗脱液在重力的作用下全部过柱后，弃去圆柱形滤膜。
[0130] （8）加入90ml的ENDO-EF溶液，使其在重力作用下通过NucleoBond Xtra柱子。
[0131] （9）加入45ml的WASH-EF溶液，使其在重力作用下通过NucleoBond Xtra柱子。
[0132] （10）加入15ml的ELU-EF洗脱液洗脱质粒DNA，用15ml或50ml的离心管收集DNA洗脱液。
[0133] （11）加入10.5ml室温下的异丙醇，充分混匀后，于4℃，15000×g离心30分钟。
[0134] （12）小心倒去上清后，加入5ml不含内毒素的70%乙醇洗涤沉淀，室温下15000×g离心5分钟；小心弃去乙醇洗液，离心管倒置在纸巾上室温下自然干燥，大约15-30分钟。
[0135] （13）加入适量体积无内毒素的TE-EF或H2O-EF溶液溶解质粒DNA；
[0136] （14）分光光度计测定质粒DNA的浓度，分装后-20℃保存。
[0137] 6.对SHIV-KBQJ-12的env基因序列进行进化分析：
[0138] 同上述方法，对被新置换入SHIV-KBQJ-12的env基因进行进化分析，该env基因片段对应于标准参考株HXB2的核苷酸位置为6103-8249。进化树结果(如图5所示)显示SHIV-KBQJ-12的env基因属于HIV-1CRF08_BC亚型
[0139] 7.293T细胞的培养：
[0140] 293T传代细胞系为半贴壁细胞，生长较快，当细胞状态良好时，在含有10%胎牛血清的DMEM完全培养基中培养时，平均48小时就要传1代(l瓶传为3瓶)。
[0141] 当细胞长满瓶后，轻轻将培养基上清吸去，加入胰酶和EDTA的混合消化液(胰酶:EDTA=1:3)消化细胞，显微镜下观察，待细胞开始变圆时，迅速将消化液吸掉，加入新鲜的DMEM完全培养基轻轻将细胞吹散，将1瓶细胞分为3瓶。37℃5%CO2培养箱中培养。
[0142] 8.SHIV质粒转染293T细胞系：
[0143] 本次采用Lipofectamine2000转染试剂(购自Invitrogen公司)进行转染，完全按照其说明书进行操作，具体步骤如下：
[0144] （1）在转染前一天，用DMEM完全培养基（不含抗生素）将293T细胞以每孔～6×105个细胞的浓度铺入6孔板中，过夜培养，使细胞密度达到90-95%。
[0145] （2）分别在两个1.5ml EP管中加250μl OPTI MEM无血清培养基，然后分别在其中稀释4μg质粒和10μl Lipofectamine2000转染试剂，轻轻混匀后室温孵育5分钟。
[0146] （3）然后将稀释的质粒DNA和稀释的Lipofectamine2000混合（总体积为500ul），轻轻混匀，室温放置20min。
[0147] （4）将100ul混合液逐滴缓慢地加入到每个含有细胞和培养基的孔中，轻轻来回振荡培养板，使转染试剂分布均匀，于37℃5%CO2细胞培养箱中培养。
[0148] （5）转染4-6个小时后，每孔取2ml新鲜的DMEM完全培养基换液，于37℃5%CO2细胞培养箱继续培养至48小时。
[0149] （6）收集每孔上清，用0.45μM滤器过滤后，用SIV p27抗原检测试剂盒测定所得SHIV病毒滴度，并将病毒分装冻存于-80℃。
[0150] 9.SHIV-KBQJ-12病毒颗粒的电镜照片观察：
[0151] SHIV-KBQJ-12质粒转染293T细胞系24小时后，收集293T细胞。弃上清，向装有细胞的小皿中加入约1.5ml的2.5%戊二醛，轻轻晃动，将小皿置于冰上15分钟；用细胞刮将细胞刮下来，连同戊二醛一起转入EP管中，2500rpm速度下离心20分钟即可。样品送中国科学院武汉病毒研究所电镜室，制成超薄切片后用透射电镜观察病毒颗粒。
[0152] 结果显示，SHIV-KBQJ-12在293T细胞中成功组装出病毒颗粒，该颗粒呈球形，表面具有包膜结构，如图6所示。这表明SHIV-KBQJ-12嵌合病毒各基因得到成功表达并正确发挥了功能。
[0153] 10.SHIV病毒p27浓度测定
[0154] 用ABL公司的SIV p27ELISA检测试剂盒(Advanced Bioscience Laboratories公司)确定病毒的滴度，参照试剂盒中说明书进行操作，具体步骤如下：
[0155] （1）使用前确保所有试剂平衡至室温。特别需要注意观察试剂盒中的20×洗液里面是否有明显的盐结晶体，如果有，应将其放入37℃烘箱中直到盐结晶体完全溶解。
[0156] 将所有待测样品从-80℃冰箱中取出，37℃解冻待用。
[0157] （2）根据以下方法用DMEM完全培养基稀释SIV p27标准品：
[0158] ①将一瓶装有SIV p27标准品的瓶子的金属帽和橡胶塞移去。
[0159] ②根据瓶子上注明的体积，用适量的DMEM完全培养基充分溶解SIV p27标准品冻干粉，轻轻的涡漩大约10秒，上下颠倒5次，室温下静置5分钟后再上下颠倒5次，这样所得的SIV p27标准品原液浓度为10ng/ml。
[0160] ③按表1中方法将标准品稀释成62.5pg/ml至2000pg/ml范围内的6个浓度。
[0161] （3）往ELISA微孔板的待测孔中每孔加入25ul裂解缓冲液。
[0162] （4）每孔分别加入100ul系列稀释的SIV标准品及所有待测样品，建议采取复孔；应特别注意，有必要时可以将待测样品稀释成不同的倍数来测定，以确保测定结果在本次测定的有效范围（62.5pg/ml-2000pg/ml）内。
[0163] 留4个已加入裂解缓冲液的孔，往其中加入100ul的完全培养基以作为阴性对照孔。
[0164] （5）用封口膜封闭ELISA微孔板，37±0.5℃的条件下孵育60±2分钟。
[0165] （6）将20×洗液用蒸馏水稀释成1×洗液，然后用稀释好的1×洗液洗板4次。每次洗板时，吸出每孔中的液体，每孔加入300μl1×洗液，浸泡15秒后，将96孔板倒置在干净的吸水纸上轻拍，充分吸干里面的液体，尤其是最后一遍时，一定要拍干孔内所有液体。
[0166] （7）每孔加入100ul偶联剂。
[0167] （8）用封口膜封闭ELISA微孔板，37±0.5℃的条件下孵育60±2分钟。
[0168] （9）同步骤6洗板4次，最后一遍拍干孔内所有液体。
[0169] （10）每孔加入100ul已经平衡至室温的过氧化物酶底物，室温（19-23℃）孵育30±1分钟。
[0170] （11）每孔加入100ul终止液，20分钟内用酶标仪在450nm的波长测定各孔样品的吸收值。
[0171] （12）将不同稀释度的标准品吸收值与其浓度对应得到标准曲线，通过标准曲线计算各样品吸收值所对应的抗体滴度。
[0172] 11.Ghost系列细胞系的培养：
[0173] Ghost系列细胞系为贴壁细胞，贴壁非常紧密，该细胞生长速度较慢。当细胞长满瓶进行传代时，轻轻将培养基上清吸走，用胰酶将细胞全部消化下来，800rpm离心5分钟，彻底去除胰酶。用含有1μg/mL嘌呤、300μg/mL G418和15%胎牛血清的DMEM完全培养基将细胞重悬，轻轻吹散，分瓶。
[0174] 12.细胞嗜性测定：
[0175] 为确定新构建SHIV-KBQJ-12的细胞嗜性，选用了表达不同辅助受体的GHOST细胞系，来测定其利用辅助受体的情况，同时将SHIV-KB9作为阳性对照。GHOST细胞系包含GHOST-CD4-CXCR4和GHOST-CD4-CCR5两种细胞，二者均表达CD4受体，并分别表达CXCR4和CCR5两种辅助受体。该细胞系基因组中包含连接了HIV LTR绿色荧光蛋白(GFP)报告基因，并在HIV-1，SIV，SHIV等利用不同辅助受体进入细胞的病毒Tat蛋白激活报告基因表达，从而检测病毒辅助受体的利用情况。也就是说，具有某种细胞嗜性的细胞被具有同样嗜性或双嗜性的病毒感染后，在荧光显微镜下可以看到该种细胞发出绿色的光，从而可判断出病毒的嗜性。
[0176] 在感染前24小时将细胞以每孔2×105个细胞的浓度铺入24孔板中，再用待检测的SHIV病毒感染过夜，培养物换液后继续培养60小时，可用荧光显微镜观察细胞发荧光情况。进一步收集细胞，用含有2%的PBS洗涤并重悬，收集20，000个细胞进行流式检测。根据流式检测的结果即可分析出SHIV-KBQJ-12的嗜性。
[0177] 实验结果(如表4所示)表明病毒SHIV-KBQJ-12是使用CCR5辅助受体的嗜巨噬细胞的病毒，这样其可以更好地模拟HIV早期感染的特征。
[0178] 13.人外周血单核淋巴细胞（PBMC）的分离和培养：
[0179] 本次所用人淋巴细胞分离液为天津市灏洋生物制品科技有限责任公司的产品，货号LTS1077，完全按照其说明书进行操作，具体步骤如下：
[0180] 采集健康献血志愿者的50毫升EDTA抗凝全血，按以下方法进行PBMC的分离：
[0181] （1）用1×PBS将EDTA抗凝全血稀释2-3倍，轻轻混匀。
[0182] （2）在每个15ml离心管中先加入5ml Ficoll-Paque PLUS溶液，然后再轻轻加入5ml稀释的血液样品，使其置于Ficoll-Paque PLUS层上。应该特别注意加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PLUS分层，二者不得混合。
[0183] （3）在18-20℃温度下，以转速1500转/分（revolutions per minute，rpm）离心15分钟。应特别注意，加速度和减速度均需设置成最小。
[0184] （4）轻轻取出离心管，由上至下可见依次为血浆层、环状乳白色淋巴细胞层、透明分离液层、红细胞层。
[0185] 使用无菌的移液管抽出血浆层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。应注意别将淋巴细胞层搅乱。包含血浆的上层液体可储存好以被稍后使用。
[0186] （5）使用一无菌的移液管将淋巴细胞层（一层白膜）轻轻地移入一新的无菌离心管中。在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。
[0187] （6）向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的PBS溶液。
[0188] （7）用移液管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。
[0189] （8）在18-20℃下，以1500rpm速度离心10分钟。
[0190] （9）丢弃上清液，用移液管轻轻地将淋巴细胞吹吸，使其悬浮于6-8ml的PBS溶液中。
[0191] （10）在18-20℃下，以1000rpm速度离心5分钟。
[0192] （11）丢弃上清液，用1640完全培养基悬浮所分离出来的淋巴细胞，调整细胞浓度6
为2×10cells/ml，并加入PHA5ug/ml，分装到培养瓶中37℃培养即可。
为2×10cells/ml，并加入PHA5ug/ml，分装到培养瓶中37℃培养即可。
[0193] 14.猴外周血单核淋巴细胞（PBMC）的分离和培养：
[0194] 本次采用GE公司的Ficoll-Paque PLUS对恒河猴PBMC进行分离，具体步骤如下：
[0195] 采集健康恒河猴的50毫升抗凝全血，按以下方法进行PBMC的分离：
[0196] （1）将新鲜的EDTA抗凝血液和等量的平衡盐溶液混合均匀；
[0197] （2）在每个15ml离心管中先加入3ml Ficoll-Paque PLUS溶液，再轻轻加入4ml稀释的血液样品，使其置于Ficoll-Paque PREMIUM层上。应该特别注意加入稀释血液时，尽量使样品与Ficoll-Paque PREMIUM分层，二者不得混合。
[0198] （3）在18-20℃温度下，离心400×g30-40分钟。应特别注意，加速度和减速度均需设置成最小。
[0199] （4）轻轻取出离心管，由上而下可见依次为血浆层、淋巴细胞层、分离液层、红细胞层。
[0200] 使用无菌的移液管抽出血浆层液体，使淋巴细胞层在界面处保持原状。应注意别将淋巴细胞层搅乱。包含血浆的上层液体可储存好以被稍后使用。
[0201] （5）使用一无菌的移液管将淋巴细胞层（一层白膜）轻轻地移入一新的无菌离心管中。在最小量的情况下移出界面处所有的物质至关重要。移去多余的Ficoll-Paque PLUS会导致粒细胞污染；而移去多余的上清液则会引起血小板污染。
[0202] （6）向装有淋巴细胞的试管中加入至少3倍体积的平衡液溶液。
[0203] （7）用移液管轻轻地将细胞吹吸，使其悬浮。
[0204] （8）在18-20℃下，以60-100×g速度离心10分钟。
[0205] （9）丢弃上清液，用移液管轻轻地将淋巴细胞吹吸，使其悬浮于6-8ml的平衡盐溶液中。
[0206] （10）在18-20℃下，以60-100×g速度离心10分钟。
[0207] （11）丢弃上清液，用1640完全培养基悬浮所分离出来的淋巴细胞，调整细胞浓度6
为2×10cells/ml，并加入PHA5ug/ml，分装到培养瓶中37℃培养即可。
为2×10cells/ml，并加入PHA5ug/ml，分装到培养瓶中37℃培养即可。
[0208] 注：制备平衡盐溶液，将1份量的溶液A（表2）与9份量的溶液B（表3）混合即可。
[0209] 参见表2，将原液A溶于约950ml蒸馏水中，加入浓盐酸（HCl），使其pH值为7.6，然后调整其体积到1L即制成溶液A。
[0210] 15.SHIV病毒在人PBMC中复制能力的检测：
[0211] （1）将上述制备好的SHIV-KBQJ-12和SHIV-KB9病毒液分别在37℃解冻。
[0212] （2）将已经用PHA刺激3天的健康人PBMC按每管4×106个细胞分装后，1000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于0.5ml含10%胎牛血清的1640培养基中。
[0213] （3）将500ng的SHIV-KBQJ-12病毒液和SHIV-KB9病毒液分别与4×106人的PBMC混合，用含10%胎牛血清的1640培养基补足各管总体积至2ml，37℃，5%CO2孵育过夜。
[0214] （4）1000rpm、4℃离心5分钟，移去病毒上清液；用培养基洗细胞，离心，如此重复二遍，最后将沉淀重悬于含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基中并转入细胞培养瓶中，37℃，5%CO2培养，建立感染，记为第0天。
[0215] （5）在感染第3，6，9，12，15，18，21天，1000rpm、4℃离心5分钟，收集2ml上清样本，分装后-80℃冻存以备检测SIV p27抗原使用；再次用5ml左右的培养基洗细胞，离心并6
重悬于含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基中，调整细胞浓度为2×10 个/ml。
必要的时候需要补充适量的新鲜刺激的PBMC。
重悬于含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基中，调整细胞浓度为2×10 个/ml。
必要的时候需要补充适量的新鲜刺激的PBMC。
[0216] （6）将在不同时间点收集的上清样本进行SIV p27核心抗原检测，并对结果进行统计绘制出感染曲线，如图7所示。
[0217] 结果表明，用转染293T细胞后收集的病毒上清感染人PBMC时，在感染病毒后第9天，病毒滴度达到最高。SHIV-KB9最高达到198ng/ml，SHIV-KBQJ-12最高达到187ng/ml，仅略低于致病性强毒株SHIV-KB9。
[0218] 16.SHIV病毒在恒河猴PBMC中复制能力的检测：
[0219] （1）将上述制备好的SHIV-KBQJ-12和SHIV-KB9病毒液分别在37℃解冻。
[0220] （2）将已经用PHA刺激3天的健康人PBMC按每管4×106个细胞分装后，1000rpm离心5分钟，沉淀悬浮于0.5ml含10%胎牛血清的1640培养基中。
[0221] （3）将500ng的SHIV-KBQJ-12病毒液和SHIV-KB9病毒液分别与4×106人的PBMC混合，37℃，5%CO2孵育过夜。
[0222] （4）1000rpm、4℃离心5分钟，移去病毒上清液；用培养基洗细胞，离心，如此重复二遍，最后将沉淀重悬于含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基中并转入细胞培养瓶中，37℃，5%CO2培养，建立感染，记为第0天。
[0223] （5）在感染第3，6，9，12，15，18，21天，1000rpm、4℃离心5分钟，收集2ml上清样本，分装后-80℃冻存以备检测SIV p27抗原使用；再次用5ml左右的培养基洗细胞，离心并6
重悬于含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基中，调整细胞浓度为2×10 个/ml。
必要的时候需要补充适量的新鲜刺激的PBMC。
重悬于含25U/ml IL-2及10%胎牛血清的1640培养基中，调整细胞浓度为2×10 个/ml。
必要的时候需要补充适量的新鲜刺激的PBMC。
[0224] （6）将在不同时间点收集的上清样本进行SIV p27核心抗原检测，并对结果进行统计绘制出感染曲线，如图8所示。
[0225] 结果表明，用转染293T细胞后收集的病毒上清感染恒河猴PBMC时，在感染病毒后第12天，病毒滴度达到最高。SHIV-KB9最高达到76.1ng/ml，SHIV-KBQJ-12最高达到18.9ng/ml。
[0226] 17.SHIV-KBQJ-12病毒在恒河猴体内的生物学特性检测：
[0227] 实验中采用体检确认无异常,并经血清学间接免疫荧光抗体检查法检查排除猴免疫缺陷病毒（SIV）、猴逆转录D型病毒（SRV_1,2,5）和猴T淋巴细胞性Ⅰ型病毒（STLV_1）感染的恒河猴2只（编号为3号和4号），以后肢静脉注射的方式给两只健康的恒河猴各接种6000ng用SHIV-KBQJ-12转染293T细胞后产生的病毒液，然后按下述时间点采集恒河猴静脉EDTA抗凝血：第一个月每周采集两次，之后每周采集一次。
[0228] 本次使用QIAGEN公司DNeasy Blood&Tissue Kit提取全血和组织中的DNA，完全按照试剂盒中提供的说明书进行操作，具体步骤如下：
[0229] (1)实验前将全血或组织样本、蛋白酶K恢复至室温并准备好56℃水浴锅。
[0230] (2)如果是全血样本，先在1.5ml离心管底部加入20μl蛋白酶K，然后取200μl全血样本加入上述离心管中，适度混匀后转入步骤4进行操作。
[0231] (3)如果是组织样本，先将各组织剪碎(脾需少于10mg，其它组织需少于25mg)并放入一个1.5ml的离心管中，加入180μl ATL溶液、20μl蛋白酶K，涡漩震荡以混匀，56℃水浴锅中孵育直到所有组织完全裂解，短暂离心后转入步骤4进行操作。
[0232] (4)将200μl AL液加入上述离心管中，充分震荡混匀。
[0233] (5)将上述混合液置于56℃水浴锅中孵育10分钟。
[0234] 注意:过高温度或过长时间会导致DNA的降解。
[0235] (6)将上述1.5ml离心管短暂离心，以消除粘在管壁上的液滴。
[0236] (7)往离心管中加入200μl无水乙醇，充分震荡混匀并短暂离心。
[0237] (8)将上述混合液转移入套有2ml收集管的DNeasy Mini spin柱子中，8000rpm离心1min。换新的2ml收集管。
[0238] (9)往柱子中加入500μl AW1溶液，8000rpm离心1min。换新的2ml收集管。
[0239] (10)往柱子中加入500μl AW2溶液，14000rpm离心3min。换新的2ml收集管。
[0240] (11)将柱子置于新的1.5ml离心管中，将200μl预热至56℃的AE溶液加入到柱子中，室温下孵育1分钟后10000rpm离心1min以洗脱DNA。
[0241] (12)取3μl提取出的DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并用紫外分光光度计检测所提取核酸的质量。
[0242] 将SHIV KBQJ12病毒注射恒河猴后第0，3，6，9，12，16，19，23和28天采集的恒河猴静脉EDTA抗凝血中的基因组DNA提取出来，并对Gag保守区长度为477bp的特异性片段进行扩增，采取巢式PCR，第一轮扩增使用以下SIV out F和SIV out R这对引物：
[0243] SIV out F:5’-GGTGCATTCACGCAGAAGAGAAAGTGAAAC-3’，
[0244] SIV out R:5’-TGGGTTAGCATTTTGAATCAGCAGTGTTTG-3’，
[0245] 第一轮扩增的反应条件为：94℃3min，50℃1min，72℃1min；94℃30S，62℃30S，-0.3℃/循环，72℃1min，34循环；72℃10min。
[0246] 第二轮扩增使用以下SIV inner F和SIV inner R这对引物：
[0247] SIV inner F:5’-GCAGAGACATCTAGTGGTGGAAACAGGAAC-3’
[0248] SIV inner R:5’-AATGTTGCCTACTGGTATGGGGTTTTGTTG-3’，
[0249] 第二轮扩增的反应条件为：94℃3min，50℃1min，72℃1min；94℃30S，54℃30S，72℃1min，34循环；72℃10min。反应结束后，将PCR产物进行琼脂糖电泳，3号和4号恒河猴的电泳结果分别如图9和图10所示。
[0250] 结果表明，3号和4号恒河猴分别在感染病毒后第12天和第6天开始后，都能一直检测到病毒的gag基因。说明SHIV-KBQJ-12病毒已经整合到恒河猴基因组中，在猴体内建立了稳定的产毒性感染。
[0251] 接种病毒98天后，处死上述两只恒河猴，采集腹股沟、肠系膜等各种组织，用QIAGEN公司的DNeasy Blood&Tissue Kit和RNeasy Mini Kit试剂盒分别提取各组织中的DNA和RNA，组织中DNA的提取步骤如上所述，提取组织中RNA的具体步骤如下：
[0252] （1）先取不多于30mg的组织放入一个1.5ml的离心管中，剪碎后加入600μl已加入β-ME的RLT溶液并充分研磨。
[0253] （2）以最大转速将上述装有裂解液的离心管离心3min，小心取出上清至一个干净的新离心管中。
[0254] （3）加入等量体积的70%乙醇到上述上清液中，迅速混匀。
[0255] （4）将上述混合液转移入套有2ml收集管的RNeasy spin柱子中，轻轻盖上管盖，12000rpm离心15s，弃去滤液。
[0256] （5）往柱子中加入700μl RW1溶液，轻轻盖上管盖，12000rpm离心15s，弃去滤液。
[0257] （6）往柱子中加入500μl已加入乙醇的RPE溶液，轻轻盖上管盖，12000rpm离心15s，弃去滤液。
[0258] （7）往柱子中加入500μl已加入乙醇的RPE溶液，轻轻盖上管盖，12000rpm离心2min，换上新的2ml收集管后12000rpm离心1min。
[0259] （8）将柱子置于新的试剂盒中提供的1.5ml离心管中，将30-50μl无RNA酶水直接加入到柱子的膜上面，轻轻盖上管盖，室温下孵育1分钟后12000rpm离心1min以洗脱RNA。
[0260] 提取出各组织中的DNA和RNA后，同样用PCR扩增的方法检测各组织中RNA和DNA的Gag区长度为477bp的特异性片段，统计结果如表5所示，表5中“ND”代表未测定。
[0261] 结果表明，病毒主要存在于恒河猴的生殖系统、中枢神经系统和肠相关淋巴组织中，这进一步证实了SHIV-KBQJ-12病毒对恒河猴是具有感染性的。
[0262] 因此，我们已经初步建立了嵌合中国HIV-1主要流行毒株CRF08_BC env基因的SHIV-KBQJ-12/恒河猴模型。但由于未经传代的SHIV原代病毒感染活性较低，SHIV-KBQJ-12毒株表现出的也是类似于其亲本株HIV-1QJ001的部分感染特性，其使用CCR5辅助受体，疾病进程较慢。但经过猴体传代实验后，病毒的复制能力和致病性会大大提高的。目前构建的此弱毒株/恒河猴模型可以模拟HIV自然感染后普遍出现的慢性疾病进程，从而在HIV候选疫苗及药物筛选中也具有一定的应用前景。
[0263] 附表
[0264] 表1
[0265]
[0266] 表2
[0267]
[0268] 表3
[0269]
[0270] 表4
[0271]
[0272] 表5
[0273]