肝癌细胞核酸适配体序列及其用途

摘要

本发明属细胞生物技术领域，具体涉及一种肝癌细胞的核酸适配体序列及其应用。本发明筛选与人肝癌细胞株HepG2特异结合的核酸适配体，制得具有特异结合HepG2的特征序列TTTTTT。本发明所述的特征序列是核酸适配体与人肝癌细胞株HepG2特异性结合的基础，可用于设计、制备抗肝癌的靶向药物或制剂或其他制品，以及可作为抗肝癌的分子探针或靶点。本发明将为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，其将具有重要的临床价值。

权利要求

1.一种肝癌细胞的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的序列如序列1所示；所述肝癌细胞选自人肝癌细胞株HepG2。

2.权利要求1所述的肝癌细胞的核酸适配体在制备检测肝癌的分子探针中的用途。

说明书

肝癌细胞核酸适配体序列及其用途

技术领域

[0001] 本发明属细胞生物技术领域。涉及肝癌细胞核酸适配体序列，具体涉及一种肝癌细胞的核酸适配体的序列及应用。

背景技术

[0002] 统计显示，我国是肝癌发生的第一大国，其发病率占全球的55％，死亡率占全球45％，并以每年30多万例的速度上升。据报道，肝癌已是全球第六位最常见癌症，是全球第三位癌症致死原因，严重威胁到人类健康。临床治疗方案中，手术虽可根治肝癌，但仅限于少部分患者，对于多数患者，或因病灶较大或因考虑术后复发转移等因素，化疗仍是主要治疗手段，但目前肝癌的化学治疗尚缺少有效的治疗药物，为提高肝癌的化学治疗效果，本领域研究者致力于寻找有效的抗肝癌的药物靶点。

[0003] 已知核酸适配体(aptamer)是经体外筛选技术筛选出的能特异结合金属离子、多肽、蛋白质乃至整个细胞的寡聚核苷酸(DNA或RNA)片段。它的特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。核酸适配体的体外筛选技术被称为指数富集的配体系统进化(Systematic evolution ofligand by exponentialenrichment，SELEX)技术。SELEX技术模拟自然进化过程，对随机寡核苷酸文库施加选择压力(结合靶目标)，淘选与靶目标高度特异结合片段(如图1所示)。

[0004] 研究显示，核酸适配体相比抗体等多肽类的适配体(peptide aptamer)的优势相当明显，例如：制备简单快捷、化学性质稳定、至今未见报道存在免疫原性或毒性、靶分子范围广、亲和力高、特异性强、易于进行改造修饰等等。

[0005] 核酸适配体的诸多优势令其在基础研究、临床检测、新药开发等方面有着广泛的用途。在临床检测方面，目前能用抗原抗体反应进行检测的技术几乎都可以用核酸适配体TM替代，如Archemix公司开发的一种适配体分子传感器——RiboReporter 即可以将检测到的蛋白信号直接转化成光信号记录并分析，从而实现了对生物混合液(如血清、细胞提取物)中的大分子蛋白的直接快速检测。在新药开发方面，最典型的例子便是第一个通过美国FDA批准上市的核酸适配体药物Macugen。它是抗血管内皮细胞生长因子(VEGF)的核酸适配体，被用于治疗湿性老年性黄斑变性(wetAMD)。另一个核酸适配体药物的例子是由Aptamera公司研制的AGR0100。临床前试验表明，AGRO100对多种癌细胞均有抑制作用。目前国际上大部分从事核酸适配体研究的科学家和生物技术公司主要针对心血管疾病，而较少见有关针对中国人的常见疾病，如肝炎、肝癌、胃癌等的报道，因此本发明采用核酸适配体应用于上述严重威胁我国人民健康的常见重大疾病，开发针对肝癌细胞的核酸适配体作为特征性标志物，为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，其将具有重要的临床价值。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种肝癌细胞的核酸适配体的序列，尤其涉及一种人肝癌细胞株HepG2的核酸适配体中具有特异结合人肝癌细胞株HepG2的序列(本发明中命名为HCCAp2)。

[0007] 本发明中，所述的肝癌细胞的核酸适配体中含有特异结合HepG2的特征序列，所述的特征序列结构为TTTTTT。

[0008] 本发明中，所述的肝癌细胞选自人肝癌细胞株HepG27。

[0009] 本发明的进一步目的是提供所述核酸适配体序列的用途，根据对该序列分析，设计抗肝癌的药物并进一步制备抗肝癌的药物或制品。

[0010] 本发明的目的通过下述技术方案实现：

[0011] 利用核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术，以人肝癌细胞株HepG2(购自上海细胞库)为正筛靶标，以人正常肝细胞株HL-7702(购自上海细胞库)为反筛靶标，从体外合成的随机寡聚DNA文库(5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’)中筛选出与HepG2特异结合的核酸适配体。将筛选出的序列用引物Aptamer_L(5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’)和Aptamer_R(5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’)进行扩增并进行TA克隆入pMD19-T载体(购自上海博光生物公司)，转化DH5a细菌(购自北京天根生物公司)。挑去白色菌落以引物RV-M(5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′)和M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)进行PCR确定阳性克隆后，抽提质粒并用M13(-47)(5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′)为测序引物进行测序反应，上测序仪测序，。根据测序结果分析特征序列。

[0012] 本发明通过上述实验研究，获得1种核酸适配体的特征序列TTTTTT。

[0013] 本发明中，所述的核酸适配体序列可选自天然存在或人工合成的序列，或任何其他来源的同样的序列；

[0014] 本发明中，所述的核酸适配体序列含有与所述特征序列的核苷酸的全部都相同的序列；

[0015] 本发明获得的核酸适配体的特征序列TTTTTT是核酸适配体与HepG2特异性结合的基础，本领域的技术人员在上述结果的启示下，可用于药物设计、制备抗肝癌的靶向药物或制剂或其他制品，可将含该特征序列的核酸适配体作为抗肝癌的分子探针或药物靶点。本发明的核酸适配体的特征序列TTTTTT将为肝癌的分子诊断和靶向治疗提供有力支持，其将具有重要的临床价值。

附图说明

[0016] 图1是核酸适配体的体外筛选技术SELEX技术的流程图。

具体实施方式

[0017] 实施例1核酸适配体筛选(一轮)

[0018] 首轮寡聚DNA文库序列：5’-acgctcggatgccactacagNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNctcatggacgtgctggtgac-3’

[0019] 富集所用引物：

[0020] Aptamer_L：5’-FAM-acgctcggatgccactacag-3’

[0021] Aptamer_R：5’-biotin-gtcaccagcacgtccatgag-3’

[0022] 将寡聚DNA文库测定OD260后，离心干燥。用300ul结合缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl2，2mg/mL BSA，0.2mg/mL酵母tRNA)溶解文库，取250pmol(第一轮10nmol)，95℃5min，迅速置冰上，稍后快速离心。

[0023] 反筛：将250pmol的文库吸入HL-7702生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培养皿中，用结合缓冲液补足到1mL。4℃摇床振荡1h。取上清液。

[0024] 正筛：将反筛上清液加入HepG2生长覆盖度达到70～80％的直径6cm培养皿中中，4℃摇床振荡1h。弃上清液。用洗涤缓冲液(PBS中含4.5g/L葡萄糖，5mM MgCl2)洗涤HepG2细胞三遍。用细胞刮刮下HepG2细胞，用1mL洗涤缓冲液将HepG2细胞转移到EP管中，95℃5min，迅速置冰上。待变冷后，10000rpm离心5min。上清转移到一干净的EP管中。

[0025] 富集：配置PCR体系(总体积1000ul)：H2O 740ul，10×PCR缓冲液100ul，dNTP80ul，引物混合物25ul(H2O∶100uM Aptamer_L∶100uM Aptamer_R＝4∶0.5∶0.5)，DNA模板(正筛上清)50ul，Taq HS酶5ul。

[0026] 按如下条件，在PCR仪上扩增：94℃加热预变性2min后，94℃变性30s，58℃退火20s，72℃延伸20s，20个循环，72℃延伸4min，4℃保温＜1h。

[0027] 纯 化：纯 化 柱 用MilliQ 水 洗 一 遍，PBS洗 两 遍，加 入 150ul GE 的StreptavidinSepharose后PBS洗两遍，加入PCR产物，摇床振荡20min，放出液体，PBS洗两遍后，加0.5mL NaOH静置2-3min后放出液体，放出液上脱盐柱，待液体从脱盐柱几乎流尽时加1mL MilliQ水洗脱，同时开始接洗脱液1mL，该洗脱液即为富集了的寡聚DNA文库，可进行下一轮筛选。

[0028] 实施例2核酸适配体TA克隆

[0029] 在微量离心管中配制下列溶液，全量为5ul：pMD19-T Vector 1ul，适配体PCR产物1ul，dH2O 3ul。加入5ul的Solution I。16℃反应30分钟。全量(10ul)加入至100ul DH5a感受态细胞中，冰中放置30分钟。42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。加入890ul LB培养基，37℃振荡培养60分钟。在含有X-Gal、IPTG、Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。

[0030] 实施例3 核酸适配体克隆的菌落PCR与测序

[0031] pMD19-T菌落PCR和测序引物：

[0032] RV-M：5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

[0033] M13(-47)：5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′

[0034] 用灭菌牙签挑取白色单克隆菌落加入到4ml LB(Amp 50ng/L)液体培养基内，180rpm，37℃摇菌过夜(＜16h).取 菌液作PCR模板，进行PCR扩增。以水作为阴性对照。

[0035] 配置PCR体系：菌液 引物RV-M(10uM)0.5ul，引物M13(-47)0.5ul，2×TaqMix7.5ul，水5.5ul(总体系15ul)。按如下条件，在PCR仪上扩增：95℃预变性5min；94℃变性
30s，55℃退火30s，72℃延伸45s，共33个循环；72℃总延伸10min。

[0036] 反应结束后取3-6ul菌液PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，140V电泳20min。若出现明亮的目的大小条带而阴性对照没有条带，说明该菌液为阳性克隆。

[0037] 随后行质粒提取：取4ml过夜培养的新鲜菌液，收集菌体，按照Omega的质粒提取试剂盒操作说明进行质粒提取。最后加水溶解。采用Nanodrop对提取的质粒进行浓度和纯度测定。

[0038] 测序反应：BDT v3.1 0.5ul，质粒100ng，引物M13(-47)0.5ul，加水至5ul。96℃加热预变性1min后，96℃变性10s，50℃退火10s，60℃延伸4min，33个循环，4℃保温。反应结束后将5ul测序产物+1.25ul EDTA(125mM，pH 8.0)+15ul无水乙醇封好，震荡4次，室温放置15min，立即3860rpm，室温(25℃)离心40min后立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻停。加60ul 70％乙醇，(不需震荡)封好。随后室温下3860rpm，离心15min。立即倒扣在纸巾上，离心到900rpm，立刻停。避光室温干燥15min，加10ul Hi-Di，封好盖。95℃变性4min，立刻冰上静置4min，短暂离心，上3730xl测序仪。测序结果发现50个克隆中有9个克隆都存在同一个特征序列TTTTTT。因此，获得了具有特异结合HepG2细胞的特征序列，该段特征序列结构为TTTTTT。