一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7

摘要

本发明公开了一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的单链抗体19B7，并给出了编码单链抗体19B7的DNA序列及其蛋白质氨基酸预测序列，涉及水产养殖品种病原体的检测及侵染机理研究。该单链抗体19B7通过噬菌体展示技术制备。本发明的优点是，提供一种低成本检测及中和草鱼呼肠孤病毒的单克隆抗体分子工具，制备价格低廉，方法简便，可大量制备。

权利要求

1.一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7，其特征在于，该单链抗体

19B7的氨基酸序列为：

MAEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLKSEDTAMYYCARDRADWGQGTLVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIKR编码该单链抗体19B7的DNA序列为：

ATGGCCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATCGAGCCGACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGC。

说明书

一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7

技术领域

[0001] 本发明涉及水产养殖品种病原体的检测以及防治技术，具体涉及一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒（GCRV）的单链抗体。

背景技术

[0002] 草鱼是我国淡水养殖业的重要品种，其在幼鱼时期易感染草鱼呼肠孤病毒，且致死率高达80%，目前该病毒侵染细胞的机理尚未得到揭示，因此利用中和抗体研究病毒对宿主细胞的吸附及侵染将会为草鱼出血病的防治提供新的思路。

[0003] 草鱼呼肠孤病毒在结构上由双层蛋白衣壳组成，其中外层蛋白衣壳由衣壳蛋 白VP5-VP7 异源 二 聚 体 构 成。邵 玲 等（Shao et al.,Antibodies against outer-capsid proteins of grass carp reovirus expressed in E.coli are capable of neutralizing viral infectivity,Virology Journal,2011,8:347） 及和 永 杏 等（He et al.,Prokaryotic expression and purification of grass carp reovirus capsid protein VP7 and its vaccine potential,African Journal of Microbiology Research,2011,5(13):1643-1648；He et al.,The use of an in vitro microneutralization assay to evaluate the potential of recombinant VP5 protein as an antigen for vaccinating against Grass carp reovirus.Virology Journal,2011,8:132）分别制备了GCRV衣壳蛋白VP5和VP7的多抗血清，并证实两种多抗血清均能够中和GCRV，说明GCRV的衣壳蛋白VP5和VP7在病毒侵染细胞过程中起着重要的作用。但多抗血清中所含的抗体是多克隆抗体，它们是识别同一抗原不同位点的混合抗体，因此VP5与VP7的多抗血清均无法特异性地研究VP5或VP7某一特定区域在病毒吸附与侵染细胞过程中的作用，这一缺陷限制了它们在病毒和细胞相互作用研究中的进一步应用。杨倩等（杨等，一株草鱼呼肠孤病毒检测用单克隆抗体的制备及其特性，中国免疫学杂志，2012,28（3）：240—241）利用传统杂交骨髓瘤方法得到了识别衣壳蛋白VP7的单克隆抗体，为建立快速检测GCRV的方法奠定了基础。但是传统的单克隆抗体制备往往价格高昂，制备周期长，并且需要免疫小鼠，因此限制了其大批量的生产和应用。并且到目前为止，尚未有对GCRV具有中和效应的单克隆抗体报道。

[0004] 噬菌体展示单链抗体主要通过将工程化的抗体可变区基因片段插入到噬菌体外壳蛋白基因中，达到抗体可变区与噬菌体外壳蛋白融合表达并展示于噬菌体表面的目的。通过几轮对目的抗原的淘选，目标抗体即可快速且廉价地获得，此单链抗体在大肠杆菌中表达分泌，可大批量制备；另外，由于不需要免疫动物，通过噬菌体展示技术获得单克隆抗体的方法更方便快捷。
发明内容：

[0005] 本发明的目的是提供一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒（专利号：200410060881.2）的单链抗体19B7，该单链抗体19B7通过噬菌体抗体展示技术制备。本发明的优点在于，单链抗体19B7可以特异性识别草鱼呼肠孤病毒873毒株的衣壳蛋白VP7，并能够中和草鱼呼肠孤病毒873毒株，阻止其侵染细胞。本发明成本低、制备简单、可大量制备，并可以单链抗体19B7为分子工具进一步研究草鱼呼肠孤病毒873毒株侵染宿主细胞的机理。

[0006] 为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0007] 一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7的DNA序列：

[0008] ATGGCCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGGGGAGGCTTAGTGCAGCCTGGAGGGTCCCTGAAACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACTTTCAGTAGCTATGCCATGTCTTGGGTTCGCCAGACTCCAGAGAAGAGGCTGGAGTGGGTCGCATCCATTAGTAGTGGTGGTAGCACCTACTATCCAGACAGTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGATAATGCCAGGAACATCCTGTACCTGCAAATGAGCAGTCTGAAGTCTGAGGACACAGCCATGTATTACTGTGCAAGAGATCGAGCCGACTGGGGCCAAGGGACTCTGGTCACCGTGTCGACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTGACGTCGTGATGACCCAGTCTCCACTCACTTTGTCGGTTACCATTGGACAACCAGCCTCCATCTCTTGCAAGTCAAGTCAGAGCCTCTTAGATAGTGATGGAAAGACATATTTGAATTGGTTGTTACAGAGGCCAGGCCAGTCTCCAAAGCGCCTAATCTATCTGGTGTCTAAACTGGACTCTGGAGTCCCTGACAGGTTCACTGGCAGTGGATCAGGGACAGATTTCACACTGAAAATCAGCAGAGTGGAGGCTGAGGATTTGGGAGTTTATTATTGCTGGCAAGGTACACATTTTCCGTACACGTTCGGAGGGGGGACCAAGCTGGAAATCAAGCGC

[0009] 一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7的氨基酸序列：

[0010] MAEVKLVESGGGLVQPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQTPEKRLEWVASISSGGSTYYPDSVKGRFTISRDNARNILYLQMSSLKSEDTAMYYCARDRADWGQGTLVTVSTGGGGSGGGGSGGGGSDVVMTQSPLTLSVTIGQPASISCKSSQSLLDSDGKTYLNWLLQRPGQSPKRLIYLVSKLDSGVPDRFTGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCWQGTHFPYTFGGGTKLEIKR

[0011] 制备一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7的方法，该方法包含下列步骤：

[0012] (1)在大肠杆菌BL21DE3（美国Novagen公司产品）中表达草鱼呼肠孤病毒的衣壳蛋白VP7，并用His bind树脂（美国Novagen公司产品）纯化，将纯化后的衣壳蛋白VP7固定在His bind树脂上；

[0013] (2)将鼠源天然抗体噬菌体展示单链抗体文库（文库的制备方法见Rao et al.,Novel recombinant monoclonal antibodies for vitellogenin assays in cyprinid fish species.Diseases of Aquatic Organisms,2010,93:83—91）拯救后，用衣壳蛋白VP7对单链抗体文库进行三轮淘选，得到单链抗体文库的菌液；

[0014] (3)将菌液涂在氨苄抗性的平板上，30℃培养至长出单菌落；

[0015] (4)对各单菌落用ELISA方法鉴定可特异识别衣壳蛋白VP7的单链抗体阳性克隆菌株，选取A450nm值最高的单链抗体阳性克隆菌株，将该克隆株命名为19B7菌株；

[0016] (5)将19B7菌株诱导表达为可溶性单链抗体19B7，或噬菌体展示的单链抗体19B7；

[0017] (6)用ELISA方法检测单链抗体19B7对原核表达草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7的识别，结果显示该单链抗体19B7能够特异识别原核表达草鱼呼肠孤病毒衣壳蛋白VP7；

[0018] (7)用草鱼呼肠孤病毒对草鱼头肾细胞的致病变作用方法鉴定单链抗体19B7对草鱼呼肠孤病毒的中和效应，结果显示该单链抗体19B7对草鱼呼肠孤病毒具有中和效应；

[0019] (8)对单链抗体19B7进行DNA测序，该单链抗体即为一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7。

[0020] 本发明的优点和效果:

[0021] 通过噬菌体展示技术得到的单链抗体19B7，可以特异性识别草鱼呼肠孤病毒873毒株的衣壳蛋白VP7，并能够中和草鱼呼肠孤病毒873毒株，阻止其侵染细胞。相对于多克隆抗体和杂交瘤细胞制备的单克隆抗体，本发明的单链抗体对抗原的识别位点单一，能够特异性研究衣壳蛋白VP7与宿主细胞的相互作用，且制备过程简单，可以通过大肠杆菌的发酵大量生产，减少人力物力消耗。其应用前景为：单链抗体19B7一方面可以发展为病毒检测试剂盒，另一方面能够作为分子工具深入研究草鱼呼肠孤病毒873毒株侵染宿主细胞机理。

附图说明

[0022] 图1：单链抗体19B7特异性识别VP7的ELISA曲线图

[0023] 图中横坐标表示蛋白（原核表达GCRV衣壳蛋白VP7，阴性对照pRSET蛋白）的浓度；纵坐标表示本发明的一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7对不同浓度的两种蛋白ELISA检测所得到在450nm波长处的吸光值；—●—曲线表示本发明的一种特异识别并中和GCRV的单链抗体19B7对不同浓度的原核表达GCRV衣壳蛋白VP7的检测；——○——曲线表示本发明的一种特异识别并中和GCRV的单链抗体19B7对不同浓度的阴性对照pRSET蛋白的检测结果；

[0024] 图2：用病毒致细胞病变作用计数法（CPE计数法）鉴定单链抗体19B7对GCRV病毒的中和效应；

[0025] 图中，A行1、2、3列表示102倍稀释的GCRV病毒液与噬菌体展示的单链抗体19B72
孵育后，感染CIK细胞的结果，为实验组；4、5、6列表示10 倍稀释的GCRV病毒与没有展示单链抗体的辅助噬菌体M13KO7（美国invitrogen公司）孵育后，感染CIK细胞结果，为阴性对照；

[0026] B行1、2、3列表示103倍稀释的GCRV病毒液与噬菌体展示的单链抗体19B7孵育3
后，感染CIK细胞结果，为实验组；4、5、6列表示10 倍稀释的GCRV病毒与没有展示单链抗体的辅助噬菌体M13KO7孵育后，感染CIK细胞结果，为阴性对照；

[0027] C行1、2、3列表示105倍稀释的GCRV病毒液与噬菌体展示的单链抗体19B7孵育5
后，感染CIK细胞结果，为实验组；4、5、6列表示10 倍稀释的GCRV病毒与没有展示单链抗体的辅助噬菌体M13KO7孵育后，感染CIK细胞结果，为阴性对照；

[0028] D行1、2、3列表示106倍稀释的GCRV病毒液与噬菌体展示的单链抗体19B7孵育6
后，感染CIK细胞结果，为实验组；4、5、6列表示10 倍稀释的GCRV病毒与没有展示单链抗体的辅助噬菌体M13KO7孵育后，感染CIK细胞结果，为阴性对照。

[0029] 实验组的噬菌体展示单链抗体19B7和阴性对照组的没有展示单链抗体辅助噬菌体M13KO7均为两百倍稀释。具体实施方案：

[0030] 制备一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7的方法，该方法包含下列步骤：

[0031] (1)在大肠杆菌BL21 DE3中表达草鱼呼肠孤病毒的衣壳蛋白VP7

[0032] 1a用接种环将保种的衣壳蛋白VP7表达菌株BL21 DE3-PLysS pRSET A VP7（制备方法见Zhang et al.High Level expression of grass carp reovirus VP7 protein in prokaryotic cells[J].Virologica Sinica,2008,23(1):51—56）划线至LB+Amp+Chl平板上，30℃过夜培养，长出单克隆；

[0033] 其中：LB+Amp+Chl平板的制备方法：在LB固体培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g,琼脂粉15g，加水至总体积为1L）中，加入氨苄青霉素钠盐（Amp）至终浓度
100毫克/升，及氯霉素(Chl)至终浓度50毫克/升，将混合物倒在平板中；

[0034] 1b从平板上挑取3个单克隆于20毫升LB+Amp+Chl培养基中，在37℃，200转/分钟的条件下，振荡培养过夜，得菌液；

[0035] 其中：LB+Amp+Chl制备方法为：在LB培养基（胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠5g,加水至总体积为1L）中，加入氨苄青霉素钠盐（Amp）至终浓度100毫克/升，及氯霉素(Chl)至终浓度50毫克/升

[0036] 1c取菌液6毫升接种到300毫升LB+Amp+Chl培养液中，在37℃摇床中200转/分钟振荡培养至A600nm=0.5-0.8；

[0037] 1d再加入IPTG至终浓度为1毫摩/升，30℃，200转/分钟振荡培养过夜；

[0038] 其中：IPTG即为异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷

[0039] 1e将菌液，4℃，4000转/分离心15分钟；

[0040] 1f去上清，加入蛋白纯化结合缓冲液15毫升，重悬沉淀，超声波破菌；

[0041] 其中：结合缓冲液配方：500毫摩/升氯化钠,5毫摩/升咪唑,20毫摩/升Tris base用浓盐酸将PH调至7.7.

[0042] 1g4℃，10000转/分钟离心15分钟，收集上清；

[0043] 1h用His Bind树脂（美国Novagen公司产品）纯化上清，得到目的蛋白，该蛋白即为纯化的大肠杆菌表达的GCRV衣壳蛋白VP7。

[0044] (2)鼠源天然抗体噬菌体展示抗体文库的拯救

[0045] 2a在300毫升2YT-AG培养基中加入1.5毫升鼠源天然噬菌体展示单链抗体文库大肠杆菌，37℃，200转/分钟震荡培养，得到A600nm＝0.5－0.6的大肠杆菌菌液；

[0046] 其中：2YT培养基的配方为：酵母膏10g，蛋白胨17g，氯化钠5g，加水至总体积为1L。AG表示，在原培养基的基础上，加入质量体积比为2%的葡萄糖，及100微克/毫升的氨苄青霉素

[0047] 2b在大肠杆菌菌液中加入辅助噬菌体M13K07（美国Invitrogen公司产品），大肠杆菌数目：辅助噬菌体M13K07数目＝1：5，37℃，200转/分钟震荡培养1小时；

[0048] 2c4℃，4000转/分钟，离心10分钟，取沉淀物，用200毫升2YT-AK培养基重悬，37℃，200转/分钟震荡培养2小时；

[0049] 其中：AK表示在2YT培养液中加入100微克/毫升的氨苄青霉素（Amp），和50微克/毫升的羧苄青霉素(Kana)

[0050] 2d4℃，10000转/分钟离心20分钟，加入2YT-AK培养基体积1/5体积的PEG/NaCl，冰浴1小时；

[0051] 其中：PEG/NaCl的配方为：质量体积比为20%的聚乙二醇8000，2.5摩尔/升的氯化钠，其余为水

[0052] 2e4℃，10000转/分钟离心20分钟，取沉淀物，用0.5毫升2YT培养基重悬，得到拯救的噬菌体展示单链抗体文库溶液。

[0053] (3)用衣壳蛋白VP7对单链抗体文库进行淘选

[0054] 3a对20微升His Bind树脂（Novagen公司产品）进行清洗、平衡、离子化，得到离子化的His Bind树脂；

[0055] 3b取步骤1h中纯化的大肠杆菌表达的GCRV衣壳蛋白VP710微克，用200微升PBS稀释，加入到离子化的His Bind树脂中，4℃放置过夜，3000转/分钟，离心，取沉淀物；

[0056] 其中：PBS配方为：1L水中溶解8g氯化钠，0.2g KCl，3.7g Na2HPO4·12H2O，0.24g KH2PO4，用NaOH调节pH值为7.4。

[0057] 3c清洗20微升His Bind树脂，再与步骤2e中的单链抗体文库溶液200微升混合，旋转震荡15分钟，3000转/分钟，离心，取上清液；

[0058] 3d将步骤3c中的上清液加入到步骤3b中的沉淀物中，旋转震荡2小时；

[0059] 3e3000转/分钟，离心2分钟，取沉淀物；

[0060] 3f加入200微升含有0.1%吐温-20的漂洗缓冲液，室温下旋转震荡5分钟，3000转/分钟，离心2分钟，取沉淀物；

[0061] 其中：含有0.1%吐温-20的漂洗缓冲液配方为：500毫摩/升氯化钠,60毫摩/升咪唑,20毫摩/升Tris-base,用盐酸调pH至7.0，加入吐温-20体积比为0.1%[0062] 3g重复步骤3f4次；

[0063] 3h加入漂洗缓冲液200微升，室温下旋转震荡5分钟，3000转/分钟，离心2分钟，取沉淀物；

[0064] 漂洗缓冲液配方为：500毫摩/升氯化钠,60毫摩/升咪唑,20毫摩/升Tris-base,用盐酸调pH至7.0，

[0065] 3i重复步骤3h4次；

[0066] 3j加入洗脱缓冲液200微升，旋转震荡20分钟；

[0067] 其中：洗脱缓冲液配方：500毫摩/升氯化钠,1摩尔/升咪唑,20毫摩/升Tris base,用盐酸调pH至7.9

[0068] 3k3000转/分钟，离心2分钟，将上清液加入10毫升大肠杆菌TG1中，37℃静置培养1小时，得到大肠杆菌TG1菌液；

[0069] 其中：该大肠杆菌TG1表示，将TG1在2YT培养液中，200转/分钟，37℃条件下生长，使A600nm达到0.3-0.5

[0070] 3l将大肠杆菌TG1菌液涂在SOBAG平板上，30℃培养至长出菌落；

[0071] 其中，SOBAG平板制备方法为：胰蛋白胨20g，酵母提取5g，氯化钠0.5g，加水至总体积为1L，高温灭菌后，加入氯化镁至10毫摩/升，氨苄青霉素100微克/毫升，质量体积比为2%的葡萄糖

[0072] 3m取SOBAG平板上的菌落，得到淘选后的鼠源天然噬菌体展示单链抗体文库大肠杆菌；

[0073] 3n重复步骤(2)(3)两次。

[0074] (4)用ELISA方法鉴定可特异识别衣壳蛋白VP7的单链抗体阳性克隆菌株[0075] 4a选取步骤（3）经三轮淘选的SOBAG平板上的各单菌落，分别加入200微升2YT-AG培养基，30℃培养过夜；

[0076] 4b吸取25微升菌液，再加入175微升2YT-AG培养基，30℃培养3小时；

[0077] 4c3500转/分钟，离心10分钟，取沉淀物，200微升2YT-AI重悬，30℃诱导过夜；

[0078] 其中：2YT-AI表示在2YT培养液里加入氨苄青霉素100微克/毫升，异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)1摩尔/升

[0079] 4d4℃，3500转/分钟，离心10分钟，取上清，上清即为单链抗体溶液；

[0080] 4e将步骤1h中纯化的病毒衣壳蛋白VP7用PBS稀释，100纳克/100微升/孔加入到酶标板（广州BIOFIL公司)，4℃放置过夜；

[0081] 4f倾掉包被液后，以PBS洗3次，用4%的PBSM封闭1小时；

[0082] 其中：4%的PBSM表示，在PBS溶液中，加入质量体积分数为4%的脱脂奶粉[0083] 4g倾掉4%的PBSM，用PBS洗3次，加入50微升步骤4d中的单链抗体溶液和50微升4%PBSM，于37℃保温1小时；

[0084] 4h用PBS和PBST各洗3次，加入100微升4%PBSM稀释的HRP/E-Tagconjugate溶液(美国Abcam公司产品)，37℃保温1小时；

[0085] 其中：PBST表示在PBS溶液中加入体积比0.1%的吐温-20

[0086] HRP/E-Tag conjugate表示辣根过氧化物酶标记的E tag抗体，

[0087] 4i再用PBST和PBS各洗3次，加入100微升TMB底物溶液，显色10分钟，再加入25微升2摩尔/升的硫酸，中止反应，酶标仪测定A450nm值，A450nm≥0.05为单链抗体阳性克隆菌株；

[0088] 其中：TMB溶液的配方为：浓度为1摩尔/升的醋酸钠溶液(pH6.0)2.5毫升，22.5毫升H2O，250微升TMB储液[称取60毫克TMB粉末溶于1毫升二甲亚枫(DMSO)中，10微升双氧水。

[0089] 4j将单链抗体阳性克隆菌株中A450nm值最高的菌株命名为19B7菌株。

[0090] (5)单链抗体19B7的诱导表达

[0091] 5.1可溶性单链抗体19B7的诱导表达

[0092] 5.1a取19B7菌株于20毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养过夜；

[0093] 5.1b将6毫升菌液转接至300毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养至A600nm达到0.5-0.8；

[0094] 5.1c4500转/分，离心15分钟，取沉淀物，300毫升2YT-AI重悬，30℃，200转/分，培养过夜；

[0095] 5.1e4℃，4500转/分，离心15分钟，取沉淀物，3毫升预冷的1×TES溶液重悬，再加入预冷的1/5×TES溶液4.5毫升，混匀，冰浴30分钟；

[0096] 5.1f4℃，10000转/分，离心15min，收集上清，此即为可溶性单链抗体19B7。

[0097] 5.2噬菌体展示的单链抗体19B7的诱导表达

[0098] 5.2a取19B7菌株于20毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，培养过夜；

[0099] 5.2b将6毫升菌液转接至300毫升2YT-AG培养基中，37℃，200转/分，得到A600nm＝0.5－0.6的大肠杆菌菌液；

[0100] 5.2c在大肠杆菌菌液中加入辅助噬菌体M13K07，大肠杆菌数目：辅助噬菌体M13K07数目＝1：5，37℃，200转/分钟震荡培养1小时；

[0101] 5.2d4℃，4000转/分钟，离心10分钟，取沉淀物，用200毫升2YT-AK培养基重悬，37℃，200转/分钟震荡培养2小时；

[0102] 5.2e4℃，10000转/分钟离心20分钟，加入2YT-AK培养基体积1/5体积的PEG/NaCl，冰浴1小时；

[0103] 5.2f4℃，10000转/分钟离心20分钟，取沉淀物，用0.5毫升2YT培养基重悬，此即为噬菌体展示的单链抗体19B7。

[0104] 用ELISA方法检测本发明的一种特异识别并中和草鱼呼肠孤病毒的单链抗体19B7对原核表达的GCRV衣壳蛋白VP7的识别，其方法按下列步骤进行：

[0105] (1)将步骤1h中纯化的病毒衣壳蛋白VP7用PBS稀释，100纳克/100微升/孔加入到酶标板进行包被，4℃放置过夜；

[0106] (2)倾掉包被液后，以PBS洗3次，用4%的PBSM封闭1小时；

[0107] (3)倾掉4%的PBSM，用PBS洗3次，加入用PBSM1:1稀释的本发明的可溶性单链抗体19B7溶液，于37℃保温1小时；

[0108] (4)用PBS和PBST各洗3次，加入100微升4%PBSM稀释的HRP/E-Tag conjugate溶液(美国Abcam公司产品)，37℃保温1小时；

[0109] (5)再用PBST和PBS各洗3次，加入100微升TMB底物溶液，显色10分钟，再加入25微升2摩尔/升的硫酸，中止反应，酶标仪测定A450nm值；

[0110] (6)根据抗原蛋白的浓度与对应的A450nm值绘制结合曲线。

[0111] 另外，也分别取同样浓度的同载体序列不相关的其他蛋白（记作pRSET）进行同样操作，作为阴性对照；若最后结果为，随着抗原蛋白VP7浓度的增加，A450nm值也增加，且阴性对照组，完全没有此趋势，则说明，本发明的一种特异识别并中和GCRV病毒的单链抗体19B7可以特异识别原核表达的GCRV病毒衣壳蛋白VP7。

[0112] 结果如图1所示，随着病毒衣壳蛋白VP7浓度的增加，A450nm值也增加，而阴性对照组，则完全没有此趋势。故单链抗体19B7能够特异识别GCRV病毒衣壳蛋白VP7。

[0113] 利用GCRV对CIK细胞的致病变作用方法鉴定单链抗体19B7对GCRV病毒的中和效应，其方法按照如下步骤进行：

[0114] GCRV病毒液具体制备方法见范超的硕士毕业论文《草鱼呼肠孤病毒非结构蛋白NS80的功能研究》［P.18的2.1与2.2中的1）—4）］。

[0115] (1)将GCRV液用MEM培养基（美国Invitrogen公司）进行10、102、103、104、105、106倍稀释；

[0116] (2)取102、103、104、106倍数稀释的病毒稀释液100微升分别加入0.5微升噬菌体展示形式的单链抗体19B7（先用孔径为0.22微米的滤膜过滤，美国Millipore公司），28℃保温孵育1小时；

[0117] (3)按常规方法培养CIK细胞，待其长满24孔板，吸出其中MEM培养基，留少许，加入上述各组与单链抗体保温孵育的病毒稀释液混匀，28℃保温吸附30分钟；

[0118] (4)加入500微升含2%胎牛血清（美国Invitrogen公司）的MEM培养基，28℃保温培养；

[0119] (5)两天后，吸出孔中培养基，用PBS清洗三次，加入4%多聚甲醛室温条件固定细胞20分钟，再用PBS洗三次，0.1%结晶紫染色30分钟，自来水冲洗干净，拍照。

[0120] 其中：4%多聚甲醛配方：称取4g多聚甲醛，用PBS定容至100毫升；

[0121] 0.1%结晶紫配方：称取0.1g结晶紫，用PBS定容至100毫升。

[0122] 实验中同时将没有展示单链抗体的辅助噬菌体M13KO7进行同样操作，作为阴性对照。若每个稀释度的GCRV病毒液感染细胞的结果均为，实验组中的细胞病变数目少于对照组中的细胞病变数目，则说明单链抗体19B7具有中和GCRV病毒的作用。

[0123] 结果如附图2所示，实验组中出现病变的细胞明显比对照组中的少，因此，单链抗体19B7对GCRV病毒具有中和效应。