一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法

摘要

本发明公开了一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法，选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养3～7d后取出发酵产物。发酵产物经纯化处理、切割，得到细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白分子的细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。本发明制备过程简单易行、操作方便、成本低，得到的面膜服帖性、持水性和透气性好，具有保湿、防皱及促进皮肤修复等功效。

权利要求

1.一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法，其特征是：（1）将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成150目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.5%，且中性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:3；

（2）配制好的浆液控制反应温度为70℃，pH为7.5，搅拌1h进行酶解反应；反应后的浆液中加入占其质量0.3%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为

0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析6天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析5天；

（3）透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为0.02wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa；每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖50g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾2g、酵母膏3g、蛋白胨2g配制发酵培养基；

（4）选取能分泌细菌纤维素的无色杆菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为

70wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养4d后取出发酵产物；

（5）发酵产物在质量百分含量为1%的NaOH水溶液中，在90℃的温度下加热3h；再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

说明书

一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及化妆品领域，具体涉及一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的不断提高以及科学技术的不断发展，化妆品在人们生活中占据了越来越重要的地位，这也极大的带动了化妆品化学的发展。近年来化妆品的品类在不断增加，科技含量也逐步提高。其中面膜产品利用覆盖在肌肤表面的短暂时间，暂时隔离外界空气及污染，提高肌肤温度，皮肤的毛孔扩张，促进汗腺分泌与新陈代谢，使肌肤含氧量上升，能够有效排除肌肤毒素和累积的油脂物，并快速将水分、营养物质等渗入肌肤表皮的角质层，使得皮肤变得更加柔软、光亮有弹性。正是由于其便捷、有效、快速的护肤方式受到了极大的关注，也成为了近年来研究的热点。但是传统面膜也存在一些不足：1、延展性不好，较难完全符合人面部形状；2、黏附性较差，易脱落，也不利于促进肌肤新陈代谢；3、使用的添加物及其他原料（如胶原蛋白、透明质酸等）价格昂贵，成本较高。

[0003] 细菌纤维素（BC）是一种天然的生物高聚物，有着良好的生物相容性、适应性和生物可降解性，且具有高结晶度、高纯度、高持水性、超细纳米纤维网络结构等许多良好的物理、化学和机械性能。其具有良好的延展性且与人体皮肤黏附性好，是目前生物纤维素面膜的主要原料。为了拓展护肤方面的功效往往需要添加不同的活性物质，而胶原蛋白正是支持各种护肤功效的首选。胶原蛋白是皮肤的主要成分，人体皮肤中72%是胶原蛋白，胶原蛋白在皮肤中构成弹力网，支撑皮肤锁住水分。胶原蛋白流失导致支撑皮肤的弹力网断裂，皮肤组织萎缩、塌陷，肌肤会出现干燥、粗糙、松弛、皱纹、毛孔粗大、暗斑、色斑等现象。因此在细菌纤维素中添加胶原蛋白能够有效补充肌肤流失的胶原蛋白，起到保湿、防皱及促进皮肤修复等功效。

[0004] 目前在细菌纤维素中添加胶原蛋白的方法主要有两种：一种是生物发酵得到细菌纤维素膜后通过表面处理、改性等方式，在细菌纤维素膜的表面复合胶原蛋白（如中国专利CN102352051A）。这种方法使胶原蛋白集中在细菌纤维素的表面，很难进入材料内部，有效加载量较低且影响材料的透气、持水等性能。另一种方法是在培养基中添加胶原蛋白，通过生物发酵得到细菌纤维素复合胶原蛋白膜，这种方法可以在细菌纤维素的生长过程中直接与胶原蛋白复合，使材料结构均匀。如中国专利CN101509025A，在细菌纤维素培养基中直接加入胶原蛋白。但一般的胶原蛋白不易溶于水，而能够溶于水的低分子量胶原蛋白成本很高，加入培养基后最终与细菌纤维素复合的量很少。另外，传统的胶原蛋白来源是从猪、牛的皮和骨，以及禽类组织中提取。但近年来因疯牛病、口蹄疫、禽流感等疾病的爆发，尤其是H5N1，H7N9等新亚型流感病毒的出现，使人们对牲畜与禽类胶原制品安全性产生严重疑虑。另外，由于宗教和习俗等原因，从猪皮牛皮中提取胶原蛋白受到很大限制，因此，寻找胶原蛋白的新来源显得愈来愈迫切。从海水或淡水鱼体废弃物提取安全性高、吸收率高、生物活性更强的胶原蛋白将成为胶原蛋白产品提取的主要来源。

[0005] 本专利利用鱼胶原蛋白提取过程中产生的小分子量胶原蛋白水溶液作为培养基，采用微生物发酵技术制备细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。制备过程绿色环保，快速方便，鱼胶原蛋白均匀分布在细菌纤维素网络中。

发明内容

[0006] 本发明的目的是提供一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法。本发明制备过程简单易行、操作方便、成本低，得到的面膜服帖性、持水性及透气性好，具有保湿、防皱及促进皮肤修复等功效。

[0007] 本发明的公开了一种细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜的制备方法，包括：选取能分泌细菌纤维素的菌株活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30～90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养3～7d后取出发酵产物。发酵产物经纯化处理、切割，得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0008] 所述的能分泌细菌纤维素的菌株是木醋杆菌、根瘤菌属、八叠球菌属、假单胞菌属、无色杆菌属、产碱菌属、气杆菌属或固氮菌属中的一种或几种。

[0009] 所述的鱼胶原蛋白水解液的制备方法如下：

[0010] （a）将干净鱼体废弃物剪切成50～200目的鱼粉，加入占鱼粉重量3～10倍的蒸馏水以及占鱼粉质量的0.1～1%的反应酶，混合制成浆液；其中反应酶由脂肪酶与蛋白酶组成且质量比为1:2～4；

[0011] （b）浆液在反应温度为50～70℃，pH为7～-9，搅拌0.5～2h；反应后浆液中加入少量氢氧化钠，并加热至80～90℃，搅拌20～30min；

[0012] （c）过滤浆液，滤液由截留分子量为0.1～0.5kDa透析袋透析4～-7天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析4～-7天；

[0013] （d）透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白水溶液。

[0014] 所述的鱼胶原蛋白水溶液中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa，鱼胶原蛋白含量为0.01～1wt%

[0015] 所述的发酵培养基为：每1L的鱼胶原蛋白水溶液中含有葡萄糖30～100g、磷酸氢二钠1～4g、磷酸二氢钾1～4g、酵母膏1～5g、蛋白胨1～5g。

[0016] 所述的纯化处理为，发酵产物在质量百分含量为1～8%的NaOH水溶液中，在30～100℃的温度下加热3～6h，再用水反复冲洗至中性。

[0017] 本发明的有益效果在于，目前鱼胶原蛋白的提取方法有酶解法、酸解法、碱解法、盐解法等，但是酸解法、碱解法和盐解法在提取过程中都需要加入大量的酸、碱或盐类试剂，得到的鱼胶原蛋白溶液不适于菌株的发酵培养。因此，本专利涉及的鱼胶原蛋白溶液来自于提取过程较为绿色的酶解法。

[0018] 小分子量的胶原蛋白能够更快的被人体皮肤吸收达到保湿、防皱、促进皮肤修复等的作用，选用分子量为0.1～1kDa的鱼胶原蛋白水溶液。鱼胶原蛋白提取过程中会产生大量分子量不等的鱼胶原蛋白分子，其中具有三螺旋结构的高分子量鱼胶原蛋白是主要的目标产物，而小分子量的鱼胶原蛋白往往不被重视或直接作为废弃物排出。因此，本发明鱼胶原蛋白水溶液中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa，而且本专利利用鱼胶原蛋白提取过程中产生的小分子量胶原蛋白水溶液作为培养基，来源广泛且成本低廉。采用微生物发酵技术制备细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。制备过程绿色环保，快速方便，其细菌纤维素三维网络内部均匀分布有鱼胶原蛋白分子，且细菌纤维素的分子与鱼胶原蛋白分子间存在氢键作用，具有很好的服帖性、透气性、持水性、保湿性，以及防皱、促进皮肤修复的技术效果。

具体实施方式

[0019] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0020] 实施例1：

[0021] 1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成50目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为3倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.1%，且中性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1: 4。

[0022] 2、配制好的浆液控制反应温度为50℃，pH为7，搅拌2h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.1%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌20min；将滤液置于截留分子量为0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析7天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析4天。

[0023] 3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为0.01wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖30g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1g、酵母膏1g、蛋白胨1g配制发酵培养基。

[0024] 4、选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为30wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养7d后取出发酵产物。

[0025] 5、发酵产物在质量百分含量为3%的NaOH水溶液中，在80℃的温度下加热6h。再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0026] 实施例2：

[0027] 1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成100目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为5倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和碱性蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.3%，且中性脂肪酶与碱性蛋白酶的质量比1: 2。

[0028] 2、配制好的浆液控制反应温度为55℃，pH为7.5，搅拌1.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.2%的氢氧化钠，加热至80℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析4天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析7天。

[0029] 3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为1wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖100g、磷酸氢二钠4g、磷酸二氢钾4g、酵母膏5g、蛋白胨5g配制发酵培养基。

[0030] 4、选取能分泌细菌纤维素的八叠球菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为50wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养5d后取出发酵产物。

[0031] 5、发酵产物在质量百分含量为2%的NaOH水溶液中，在100℃的温度下加热6h。再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0032] 实施例3：

[0033] 1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成150目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由中性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.5%，且中性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:3。

[0034] 2、配制好的浆液控制反应温度为70℃，pH为7.5，搅拌1h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.3%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析6天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析5天。

[0035] 3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为0.02wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖50g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾2g、酵母膏3g、蛋白胨2g配制发酵培养基。

[0036] 4、选取能分泌细菌纤维素的无色杆菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为70wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养4d后取出发酵产物。

[0037] 5、发酵产物在质量百分含量为1%的NaOH水溶液中，在90℃的温度下加热3h。再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0038] 实施例4：

[0039] 1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成200目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为9倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和菠萝蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.7%，且碱性脂肪酶与菠萝蛋白酶的质量比1:3。

[0040] 2、配制好的浆液控制反应温度为65℃，pH为8，搅拌0.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.4%的氢氧化钠，液加热至80℃，搅拌20min；将滤液置于截留分子量为0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析5天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析6天。

[0041] 3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为0.04wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖80g、磷酸氢二钠3g、磷酸二氢钾3g、酵母膏4g、蛋白胨3g配制发酵培养基。

[0042] 4、选取能分泌细菌纤维素的气杆菌属和固氮菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为90wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养3d后取出发酵产物。

[0043] 5、发酵产物在质量百分含量为5%的NaOH水溶液中，在50℃的温度下加热4h。再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0044] 实施例5：

[0045] 1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成50目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为10倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和碱性蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的0.9%，且碱性脂肪酶与碱性蛋白酶的质量比1:2。

[0046] 2、配制好的浆液控制反应温度为60℃，pH为8.5，搅拌1h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.5%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析7天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析7天。

[0047] 3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为0.06wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖70g、磷酸氢二钠1g、磷酸二氢钾1g、酵母膏5g、蛋白胨1g配制发酵培养基。

[0048] 4、选取能分泌细菌纤维素的木醋杆菌和产碱菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为80wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养7d后取出发酵产物。

[0049] 5、发酵产物在质量百分含量为8%的NaOH水溶液中，在30℃的温度下加热6h。再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0050] 实施例6：

[0051] 1、将去除表面杂质干净的鱼体废弃物剪切成小块，并用破碎机切成100目的鱼粉；鱼粉在密闭容器中加入占鱼粉质量为7倍的蒸馏水和反应酶搅拌制成浆液，其中反应酶由碱性脂肪酶和胰蛋白酶组成，反应酶加入量占鱼粉质量的1%，且碱性脂肪酶与胰蛋白酶的质量比1:2。

[0052] 2、配制好的浆液控制反应温度为55℃，pH为7，搅拌0.5h进行酶解反应。反应后的浆液中加入占其质量0.1%的氢氧化钠，加热至90℃，搅拌30min；将滤液置于截留分子量为0.1～0.5kDa的透析袋中经蒸馏水透析4天，保留液再次经截留分子量为0.5～1kDa透析袋透析6天。

[0053] 3、透析后的渗出液经蒸发浓缩得到鱼胶原蛋白含量为0.08wt%的鱼胶原蛋白水溶液，其中鱼胶原蛋白分子量为0.1～1kDa。每1L的鱼胶原蛋白水溶液中加入有葡萄糖40g、磷酸氢二钠2g、磷酸二氢钾2g、酵母膏1g、蛋白胨5g配制发酵培养基。

[0054] 4、选取能分泌细菌纤维素的根瘤菌属和假单胞菌属活化制备成种子醪液，然后将菌株浓度为60wt%的种子醪液均匀接入含有鱼胶原蛋白水溶液的发酵培养基中，发酵培养6d后取出发酵产物。

[0055] 5、发酵产物在质量百分含量为4%的NaOH水溶液中，在60℃的温度下加热6h。再用蒸馏水反复冲洗至中性、切割后得到细菌纤维素复合鱼胶原蛋白面膜。

[0056] 以下通过试验进一步说明本发明的有益效果

[0057] 试验1

[0058] 每个处理分别选择面部皮肤干燥、蜕皮明显的患者120例分成6组，每组20人进行试验，取实施例1-6所得的面膜两片，分别于清晨和临睡前各用温开水洗脸后敷于面部，然后在脸上保留15min左右。试验30天后统计痊愈、显效、好转、无效的病患数，计算其总有效率（%）。疗效判定标准：①痊愈:肤色改善、蜕皮完全消退，皮肤光滑滋润;②显效: 肤