一种抗衰老生物学细胞制剂的制备方法

摘要

一种抗衰老生物学细胞制剂的制备方法，所述制剂以健康成人的外周血为原料，按下述步骤进行制备：a．以取得的健康成年人外周血为所述制剂原料；b.将上述外周血原料进行单个核细胞分离提取；c．将分离的单个核细胞经细胞分裂原体外诱导转化增殖；d．制剂检测。将本发明制剂以皮下多点注射的接种方式注射到患者体内，可刺激机体的免疫细胞，调节免疫功能，有效治疗亚健康状态、延缓功能减退和抗衰老，临床上达到调整月经周期、改善饮食睡眠质量、促进活力及体力恢复、改善精神状况、提高抗病能力、使皮肤亮丽光泽、驻颜焕采的疗效。

权利要求

1.一种抗衰老生物学细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述抗衰老生物学细胞制剂以健康成人的外周血为原料，其制备方法按下述步骤进行：a．抽取健康成年人外周血为所述制剂原料；

b. 将上述外周血原料进行单个核细胞分离提取；

c．将分离的人外周血单个核细胞经细胞分裂原植物血凝素PHA体外刺激后转化增殖；

d．制剂检测；

所述b步骤中，取外周血15mL-20mL，用Hank’s液或PBS缓冲液1-1.5倍稀释，采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离收集单个核细胞；所述c 步骤中，取b步骤分离的外周血单个核细胞，经Hank’s液或PBS缓冲液清洗2次后，以RPMI-1640完全培养液调整细6

胞浓度为2×10/mL，加入植物血凝素PHA使其终浓度至100μg/mL，混匀后置37℃、5%CO2饱和湿度中共培养72h，1500rpm离心5min后，弃上清获取沉淀细胞，以注射用生理盐水重7

悬、调整细胞浓度为0.5~1×10/mL，即制成所述制剂。

2.根据权利要求1所述的抗衰老生物学细胞制剂的制备方法，其特征在于：所述制剂检测步骤中，将c 步骤中制成的制剂，以1500rpm离心5min，弃上清获取沉淀细胞；倒置显微镜下进行活细胞计数、台盼蓝排除法判断细胞活力、细胞涂片HE染色法油镜下观察淋巴细胞转化率、MTT法检测细胞活化增殖的A492值；其中，活细胞比例≥95%、淋巴细胞转化率≥70%、A492值介于0.85~1.20之间、细胞免疫功能正常。

说明书

一种抗衰老生物学细胞制剂的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物制剂，特别是通过对机体整体调理，治疗女性亚健康、延缓功能减退的抗衰老生物学细胞制剂，属医药技术领域。

背景技术

[0002] 受特殊生理、心理、环境因素的影响，成年女性特别是进入中年的女性，多有流产或生育史，在生活工作压力、心理压力、环境污染的干扰下，机体各种生理功能逐渐下降，卵巢功能衰退，激素水平变化，导致出现皮肤晦暗无光泽、月经失调及痛经、食欲不振、精神委靡、睡眠质量差、神经衰弱、抗病及恢复能力降低等亚健康及功能减退和衰老的征象。当今，美容业所采用的各种技术方法，其目的是使女性保持青春亮丽的外貌、遮掩岁月的痕迹，而亚健康状态、功能减退和衰老则是美容养颜、保持青春亮丽最根本、最重要、最直接的不利因素。无论是日常基础美容护理、美容仪器治疗，还是风靡一时的羊胎素、玻尿酸、肉毒素A等先进的美容制剂，都只是从局部入手，哪里出现问题在哪里修补，属于“头痛医头、脚痛医脚”的治标不治本的方法。目前，尚缺乏一种从整体调理机体功能入手，对导致女性亚健康和衰老的根源予以干预逆转的医疗制剂。

发明内容

[0003] 本发明所要解决的技术问题是：克服上述已有技术之缺陷而提供一种通过对机体进行整体调理，达到女性驻颜焕采效果的抗衰老生物学细胞制剂的制备方法。

[0004] 本发明所称问题是由以下技术方案解决的：

[0005] 一种抗衰老生物学细胞制剂的制备方法，其特别之处是：所述抗衰老生物学细胞制剂以健康成人的外周血为原料，并按下述步骤进行制备：

[0006] a．以取得的健康成年人外周血为所述制剂原料；

[0007] b. 将上述外周血原料进行单个核细胞分离提取；

[0008] c．将分离的人外周血单个核细胞经细胞分裂原植物血凝素（PHA）体外刺激后转化增殖；

[0009] d．制剂检测。

[0010] 上述抗衰老生物学细胞制剂的制备方法，所述b步骤中，取外周血15mL-20mL，用Hank’s液或PBS缓冲液1-1.5倍稀释后，采用淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离、收集单个核细胞；所述c 步骤中，取b步骤分离的外周血单个核细胞，经Hank’s液或PBS缓冲6
液清洗2次后，以RPMI-1640完全培养液调整细胞浓度为2×10/mL，加入植物血凝素（PHA）使其终浓度至100μg/mL，混匀后置37℃、5%CO2饱和湿度中共培养72h，1500rpm离心5min
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后，弃上清获取沉淀细胞，以注射用生理盐水重悬、调整细胞浓度为0.5~1×10/mL，即制成所述制剂。

[0011] 上述抗衰老生物学细胞制剂的制备方法，所述制剂检测步骤中，将c 步骤制成的制剂，以1500rpm离心5min，弃上清获取沉淀细胞；倒置显微镜下进行活细胞计数、台盼蓝排除法判断细胞活力、细胞涂片HE染色法油镜下观察淋巴细胞转化率、MTT法检测细胞活化增殖的A492值。其中，活细胞比例≥95%、淋巴细胞转化率≥70%、A492值介于0.85～1.20之间、细胞免疫功能正常。

[0012] 本发明所述抗衰老生物学细胞制剂是以健康成人的外周血为原料、经外周血单个核细胞的分离提取、分离细胞的体外诱导转化增殖等步骤制备而成的，所述制剂是一种通过整体调理调动机体免疫功能、使女性重新焕发青春活力的细胞生物学制剂。将本发明制剂以皮下多点注射的接种方式注射到患者体内，能够通过刺激机体的免疫细胞，调节免疫功能，有效治疗亚健康状态、延缓功能减退和抗衰老，临床上达到调整月经周期、改善饮食睡眠质量、促进活力及体力恢复、改善精神状况、提高抗病能力、使皮肤亮丽光泽、驻颜焕采的疗效。本发明制剂为纯细胞成分，无辅助性添加物质，使用安全有效，疗效肯定，临床观察未见短期及长期不良反应和毒副作用。

具体实施方式

[0013] 本发明提供一种以健康成人外周血为原材料的抗衰老生物学细胞制剂的制备方法。所述制剂通过对机体进行整体调理，治疗女性亚健康状态、延缓功能减退和抗衰老，从而使女性皮肤亮丽光泽、驻颜焕采。研究发现，本发明提供的抗衰老生物学细胞制剂皮下注射后，可使机体T淋巴细胞的数量、活化信号转导水平、活化增殖能力显著提高，促进正向免疫效应性及负向调节性T淋巴细胞平衡、正负向协同刺激因子表达平衡、Th1/ Th2细胞因子表达平衡，从而刺激机体的免疫细胞、调节整体免疫功能。

[0014] 本发明抗衰老生物学细胞制剂的制备方法如下：

[0015] 1、取符合献血人员国家标准的健康成人外周血15mL-20mL，以Hank’s液或PBS缓冲液1-1.5倍稀释；以淋巴细胞分离液经密度梯度离心法分离收集单个核细胞。

[0016] 2、将分离的单个核细胞经细胞分裂原体外诱导转化增殖：取上述分离收集的单个核细胞，经Hank’s液或PBS缓冲液清洗2次后，以RPMI-1640完全培养液调整细胞浓6
度为2×10/mL，使用的分裂原为植物血凝素（Phytohemagglutinin，PHA），刺激终浓度至
100μg/mL；与细胞共孵育的条件为混匀后置37℃、5%（体积单位）CO2饱和湿度中培养
72h，1500rpm离心5min后，弃上清获取沉淀细胞，以注射用生理盐水重悬、调整细胞浓度为
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0.5~1×10/mL，即制成所述制剂。

[0017] 3、所述制剂的检测如下：将上述制剂以1500rpm离心5min，弃上清获取沉淀细胞；倒置显微镜下进行活细胞计数、台盼蓝排除法判断细胞活力、细胞涂片HE染色法油镜下观察淋巴细胞转化率、MTT法检测细胞活化增殖的A492值；其中，活细胞比例≥95%、70%以上的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，出现体积增大、胞浆丰富、嗜碱性增强、核膜清晰且有伪足样突起、染色质疏松呈网状、可见核仁等典型转化增殖的形态学改变；A492值介于0.85~1.20之间、细胞免疫功能正常，MTT法检测细胞活化增殖的A492值升高具有极显著的统计学差异（与未经PHA活化诱导的对照组细胞相比，P＜0.0005）。所述细胞免疫功能主要包括淋+ + + + + +
巴细胞转化率、Th1/Th2细胞因子分泌以及细胞表面CD3 、CD4、CD8、IL-2Rα、CD4CD25、+ + + +
CD4CD28、CD4CTLA-4阳性表达率等。

[0018] 本发明制剂使用时，将所述制剂以注射用生理盐水重悬，调整细胞浓度为7
0.5~1×10/mL；取2mL以皮下多点注射的接种方式进行治疗，每次间隔3-4周，3次为一疗