中华鳖小RNA病毒基因组全序列及其应用

摘要

一种分离的核酸分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1 所示或其反义序列，且所述核酸分子来源于中华鳖小RNA病毒株CNSR2011。所述的核酸分子的用途，在于制备检测中华鳖小RNA病毒的引物、探针或试剂盒，还可用于制备中华鳖小RNA病毒疫苗和抗中华鳖小RNA病毒的抗体。

权利要求

1.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或其反义序列。

2.一种权利要求1所述的核酸分子的用途，其特征在于，用于制备检测中华鳖小RNA病毒的引物、探针或试剂盒，或用于制备中华鳖小RNA病毒疫苗或抗中华鳖小RNA病毒的抗体。

3.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的引物长度为15-100个核苷酸。

4.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的探针的长度为25-5000个核苷酸。

5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述的探针的长度为50-500个核苷酸。

6.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的疫苗为基因工程疫苗。

7.如权利要求2所述的用途，其特征在于，所述的抗体为重组表达的抗原免疫动物后获得的抗体。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，所述的动物为小鼠、大白兔或羊。

说明书

中华鳖小RNA病毒基因组全序列及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及病毒基因组学领域。更具体地，本发明涉及中华鳖小RNA病毒的基因组序列及其应用。

背景技术

[0002] 中华鳖，拉丁文：Pelodiscus sinensis (Wiegmann, 1835)，中文俗称甲鱼、水鱼、团鱼和王八等，英文俗名：Chinese softshell turtle，属于龟鳖目鳖科鳖属，是一种珍贵的、经济价值很高的水生动物。中华鳖的肉味鲜美，营养丰富，蛋白质含量高，尤以裙边更是脍炙人口的美味佳肴。2010年中国中华鳖养殖产量26.6万吨，其中浙江省养殖产量占全国中华鳖产量的46.6%。

[0003] 小RNA病毒是单正链RNA病毒，能广泛感染人、其他脊椎动物。病毒病的早期诊断与疫苗免疫对病毒病的预防起着关键作用，而病毒基因组的核苷酸序列可以作为检测
体内、外病毒的特异性分子标记，亦是研制抗病毒药物的靶标及病毒疫苗的基本素材。中
华鳖小RNA病毒可引起中华鳖病毒性肝坏死肠出血症，并引起暴发性死亡。目前，对于中
华鳖病毒性肝坏死肠出血症迄今人们尚无有效的治疗手段，接种疫苗是迄今人类控制该
疾病最有效和最经济的手段。因此，分离、鉴定中华鳖小RNA病毒（Pelodiscus sinensis Picornavirus，PSPV）及其基因组是对中华鳖肝坏死肠出血症病毒核酸进行检测及研制病
毒疫苗的前提条件。中华鳖小RNA病毒（Pelodiscus sinensis Picornavirus，PSPV）是发明人首次从患病中华鳖中分离获得的病毒，也是龟鳖科中发现的第一个小RNA病毒。此病
毒的基因组序列信息及功能基因国内外还未见报道。

发明内容

[0004] 针对现有技术缺乏中华鳖小RNA病毒的基因组序列信息，不利于中华鳖肝坏死肠出血症病毒核酸的检测及研制病毒疫苗的问题，本发明的目的在于设计提供中华鳖小RNA
病毒的基因组序列及其应用的技术方案，本发明为检测中华鳖小RNA病毒核酸、研究中华
鳖小RNA病毒感染途径等目的奠定可靠的基础。

[0005] 在本发明的第一方面，提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子具有或其序列为SEQ ID NO ：1 所示的核苷酸序列或其反义序列。

[0006] 在另一类优选例中，所述的核酸分子是DNA 或RNA。

[0007] 在本发明的第二方面，提供了本发明第一方面中所述的核酸分子的用途，它们被用于制备检测中华鳖小RNA病毒核酸的引物、探针或试剂盒。

[0008] 在另一类优选例中，所述的引物长度为15-100 个核苷酸。

[0009] 在另一类优选例中，所述的探针的长度为25-5000 个核苷酸。

[0010] 在另一类优选例中，所述的探针的长度为50-500 个核苷酸。

[0011] 在本发明的第三方面，提供了一种分离的DNA分子，该DNA分子由SEQ ID NO ：1所示序列或其反义序列中连续的150-8186 个核苷酸所构成。

[0012] 在另一类优选例中，所述的DNA分子由SEQ ID NO ：1 所示序列或其反义序列中连续的300-8186 个核苷酸所构成。

[0013] 在另一类优选例中，所述的DNA分子由SEQ ID NO ：1 所示序列或其反义序列中连续的1000-8186个核苷酸所构成。

[0014] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文( 如实施例) 中具体描述的各技术特征可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一赘述。

[0015] 本发明通过对中华鳖小RNA病毒纯化、病毒基因组文库构建、病毒序列筛选及病毒全基因组序列组装，最终得到中华鳖小RNA病毒的基因组全序列，并且本发明利用该全
序列用于制备检测中华鳖小RNA病毒核酸的引物、探针或试剂盒，为检测中华鳖小RNA病毒
核酸、研究中华鳖小RNA病毒感染途径等目的奠定可靠的基础。

具体实施方式

[0016] 本发明人经过广泛而深入的研究，首次获得了具有在中华鳖脾脏细胞上高效稳定增殖特性的中华鳖小RNA病毒全基因组序列。在此基础上，完成了本发明。

[0017] 本发明的多核苷酸可以是DNA 形式或RNA 形式。DNA 形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA 可以是单链的或是双链的。DNA 可以是编码链或非编码链。

[0018] 本发明的基因组全序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。对于PCR扩增法，可根据本发明所公开的有关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并按本领域技术人员已知的常规方法所制备的cDNA库作为模板，扩增而得有
关序列。当序列较长时，常常需要进行两次或多次PCR扩增，然后再将各次扩增出的片段按正确次序拼接在一起。

[0019] 一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。

[0020] 第一方面，本发明提供了一种核酸，该核酸含有在SEQ ID NO:l所示的中华鳖小RNA病毒的基因组核苷酸序列。还提供了含有与本文所公开的核苷酸序列
有序列相同性的核苷酸序列。根据具体的序列，序列相同性的程度宜大于50(例如
60%,70%,80%,90%,95%,99%或更高)。这些序列包括例如突变体和等位基因变体。

[0021] 本发明还提供了包含本文所公开的一种或多种核苷酸序列片段的核酸。这些片段应包含诸序列中至少n个连续的核苷酸，并且根据具体的序列，n为10或更高(例
如，11,12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，30，35，40，45，50，60，75，100或 更高)。较佳地，该片段是中华鳖小RNA病毒基因组特有的，换言之在其他生物体的基因组中
并不存在。更佳地，该片段是中华鳖小RNA病毒毒株的基因组特有的。本发明还提供了与
本文所提供的核酸发生杂交的核酸。杂交条件如本文下面所述。

[0022] 本发明还提供了一种核酸，该核酸包含与上述序列互补的序列(例如，用于反义、用于探针、或用于扩增引物)。

[0023] 当然，本发明的核酸可以用多种方法制备(例如，化学合成、从DNA文库、或从生物体本身制得等)，并可采用各种形式(例如单链、双链、载体、探针、引物等)。术语“核酸”包括DNA和RNA，以及它们的类似物，如含有修饰骨架的那些类似物，还包括肽核酸(PNA)等。

[0024] 应理解，因为SEQ ID NO:l代表了中华鳖小RNA病毒的完整基因组。

[0025] 本发明还提供了含有本发明的核苷酸序列的载体(如表达载体、测序载体、克隆载体等)以及用这些载体转化的宿主细胞。

[0026] 第二方面，本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有本文所示的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列。还提供了含有与这些蛋白质有序列相同性的序列
的蛋白。根据具体的序列，序列相同性程度宜大于50(例如60%,70%,80%,90%,95%,99%或
更高)。这些同源蛋白包括本文所示的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列中所编码的突变体和
等位基因变体。

[0027] 本发明还提供了一种蛋白质，该蛋白质含有序列表中所公开的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列中所编码的氨基酸序列片段。这些片段应包含诸序列中至少n个连续的氨基
酸，并且根据具体的序列，n为7或更高(例如，8,10,12,14,16,18,20或更高)。这些片段
宜包含该序列的表位。

[0028] 本发明还提供了编码本发明蛋白的核酸。

[0029] 第三方面，本发明还提供了含有本发明核酸的核苷酸序列的计算机、计算机存储器、计算机存储介质(如软盘、硬盘、CD-ROM等)和/或计算机数据库。较佳地，它含有本
文列出的一种或多种中华鳖小RNA病毒核苷酸序列。

[0030] 这可用于分析本文所列出中华鳖小RNA病毒核苷酸序列。例如，可用于检索以鉴别序列中的开放阅读框(ORF)或编码序列。

[0031] 第四方面，本发明提供了鉴别氨基酸序列的方法，它包括步骤:检索本文所列出的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列中推定的开放阅读框或蛋白编码序列。类似地，本发明提
供了此处所列出的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列在检索推定的开放阅读框或蛋白质编码
序列中的用途。

[0032] 开放阅读框或蛋白编码序列分析通常在计算机上用标准的生物信息技术进行。用于分析的典型算法或程序包括:ORFFINDER (NCBI)，GENMARK[Borodovsky &Mcininth
(1993)Computers Chem 17:122-133〕和GLIMMER[Salzberg et al. (1998)Nucl Acids Res
26:544-548]。

[0033] 对开放阅读框或蛋白编码序列的检索可包括步骤:检索此处所列出的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列中的起始密码子和检索下游序列中的处于读框中终止密码子。中间的
密码子就代表了推定的蛋白编码序列。通常，应检索一个序列中6种可能的读框。

[0034] 用这种方法鉴别出的氨基酸序列可用任何合适的系统进行表达，以获得蛋白。该蛋白可用于产生抗体，而该抗体识别在鉴别出的氨基酸序列中的表位。这些抗体可用于筛
选中华鳖小RNA病毒抗原，以检测是否存在含所鉴别氨基酸序列的蛋白质。该蛋白还可用
于制备抗中华鳖小RNA病毒的疫苗，该蛋白可以是开放阅读框编码的至少n个连续的氨基
酸，n为7或更高(例如，8,10,12,14,16,18,20或更高)。这些蛋白氨基酸片段宜包含该
开放阅读框编码蛋白的抗原表位。

[0035] 此外，一旦鉴别出ORF或蛋白编码序列，那么就可将该序列与序列数据库进行比较。序列分析工具可在NCB工(http://www. ncbi. nlm. nih. gov)处找到，例
如BLAST,BLAST2, BLASTn, BLASTp, tBLASTn, BLASTx，和tBLASTx算法[还可参见
Altschul 等 人 .(1997)Gapped BLAST and PSI-BLAST: new generation of protein
database search programs. Nucleic Acids Research 25:2289-3402]。用于比较的合
适数据库包括非冗余GenBank, EMBL,DDBJ和PDB序列，以及非冗余GenBank CDS翻译物，
PDB,SwissProt,Spupdate和PIR序列。这种比较可给出蛋白质功能的指示。

[0036] 氨基酸序列中的疏水区可用以上算法加以预测，例如基于Esposti等人的统计学研究的算法[“膜蛋白亲水性的关键评价”(Critical cvaluation of the hydropathy of membrane proteins)(1990)Eur J Biochem 190:207-219]。疏水区代表了潜在的跨膜区或
疏水性前导序列，这暗示蛋白质可以被分泌或位于表面。这些特性通常是良好免疫原的标
志。

[0037] 类似地，可用PSORT算法(http://www. psort. nibb. ac. jp)来预测跨膜区或前导序列，以及用MOTIFS程序来预测功能区(GCG Wisconsin&PROSITE)。

[0038] 本发明还提供了一种核酸，该核酸含有本文所列出的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列中的开放阅读框或蛋白编码序列。此外，基于本发明所提供的基因组序列，还提供了
若干种蛋白质，该蛋白质含有所述开放阅读框或蛋白编码序列所编码的氨基酸序列。例
如，SEQ ID NO：1中第728-7921位的ORF就编码一个长度为2397个氨基酸的前体蛋白
(pre-proprotein)(SEQ ID NO:2)。

[0039] 第五方面，本发明提供了结合这些蛋白的抗体。它们可能是多克隆的或单克隆的，可用本领域技术人员已知的任何合适方法制得。

[0040] 本发明的抗体可以以各种不同方式使用，例如用于证实蛋白质的表达，或用于证实蛋白质表达的场所。例如，标记的抗体(如荧光标记以用于FACS(流式细胞分选仪))可
以与完整的病毒一起孵育，而在病毒表面上存在标记就证实蛋白质的位置。

[0041] 第六方面，本发明提供了各种方法。

[0042] 本发明提供了一种生产本发明的蛋白的方法，该方法包括步骤:在诱导蛋白表达的条件下，培育本发明的宿主细胞。一种方法还可包括化学合成蛋白或化学合成(至少部
分合成)核苷酸。

[0043] 本发明提供了一种检测本发明的多核苷酸的方法，该方法包括下列步骤:(a)在杂交条件下使本发明的核酸探针与生物样品接触，形成双链体；和(b)检测所述双链体。

[0044] 本发明提供了一种检测本发明的蛋白质的方法，该方法包括下列步骤:(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下使本发明的抗体和生物样品接触；和(b)检测所述复合
物。

[0045] 第七方面，本发明提供了检测选择性结合于抗原或多肽或蛋白质的抗体的方法，这些抗原或多肽或蛋白质是对中华鳖小RNA病毒的任何毒种或毒株特异性的，较佳地是对
中华鳖小RNA病毒毒株特异性的，但更佳地是对中华鳖小RNA病毒特异的。该方法包括步
骤:(a)在适合形成抗体-抗原复合物的条件下，使本发明抗原或多肽或蛋白质与生物样品
接触；和(b)检测所述复合物。

[0046] 本发明提供了中华鳖小RNA病毒核苷酸序列和其所编码的氨基酸序列。利用这些所公开的序列，可以产生核酸探针试验和表达盒及载体。蛋白质还可化学合成，表达载体可以转入宿主细胞以产生蛋白。纯化或分离的多肽可用于产生抗体以检测中华鳖小RNA病毒
蛋白，也可制备抗中华鳖小RNA病毒的基因工程疫苗。而且，宿主细胞或提取物可用于生物试验以分离促效剂和拮抗剂。此外，利用这些序列，人们可检索以鉴定开放阅读框(ORF)和鉴定氨基酸序列。蛋白质还可用于免疫原性组合物以及用作疫苗组份。

[0047] 除非另有描述，本发明的实施将采用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的常规技术，这些均是本领域技术人员所知的。这些技术在下列文献中有全面的描述:例如，Sambrook《分子克隆实验手册》第2版(1989) ； ((DNA克隆》第I和II卷(D. N. Glover编1985)；《寡核苷酸合成》(M. J. Ga i t编，1984)；《核酸杂交》(B. D. Hame s和S. J. Higgins编.1984) ；《转录和翻译》(B. D. Hame s和S. J. Higgins编，1984) ；《动物细胞培养》(R.I.Freshney编，1986)；《固定化细胞和酶》(IRL出版社，1986) ；B. Perbal,《分子克隆实用指南》(1984)；《酶学方法》系列丛书(Academic Press，inc.)，尤其是154和155卷；《哺乳动物细胞的基因转移载体》(J. H. Miller和M. P. Cabs编，1987,Cold
Spring Harbor Laboratory) ；Mayer和Walker编(1987) ,《细胞和分子生物学的免疫
化学方法》(Academic Press, London) ；Scopes, (1987)《蛋白质纯化:原理和实践》第
2版(Springer-Verl ag, N. Y.)，以及《实验免疫学手册》I-IV卷(D. C. Weir和C. C.
Blackwell编1986)。

[0048] 在本说明书中采用了核苷酸和氨基酸的标准缩写。

[0049] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请均全部纳入本文作参考。

[0050] 免疫诊断试验

[0051] 本发明的中华鳖小RNA病毒抗原或开发的重组抗原，可用来制备相应的实验动物抗体，该类抗体可用于免疫试验来检测临床罗氏沼虾样品的病毒抗原水平。免疫试验的设
计可作很大变化，其各种方案均是本领域中已知的。免疫试验的方案可基于例如竞争性、或直接反应或夹心型试验。方案例如还可采用固体支持物，或可以采用免疫沉淀法。大多数
试验涉及采用标记的抗体或多肽；该标记例如可以是荧光标记、化学发光标记、放射活性标记或染料分子。扩增探针信号的试验也是已知的；其例子是采用生物素和亲和素的试验，酶标记的和介导的免疫试验，如ELISA试验。

[0052] 将合适的材料(包括本发明的组合物)以及进行试验所需的其它试剂和材料(例如合适的缓冲液、盐溶液等)和合适的试验说明书包装到合适的容器中，构成适用于免疫
诊断且含有适当标记的试剂的试剂盒。

[0053] 核酸杂交

[0054] “杂交”指两条核苷酸序列相互之间通过氢键而结合。通常，一条核苷酸固定于固体载体，另一条将游离于溶液内。然后，在有利于形成氢键的条件下使两条核苷酸相互接触。影响这种结合的因素包括：溶剂的类型和体积；反应温度；杂交时间；搅拌；封闭液相核苷酸序列与固体载体非特异性结合的试剂(Denhardt's试剂或BLOTTO)；各序列的浓度；是
否使用化合物来增加核苷酸序列结合的速度(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；以及杂交后洗涤
条件的严谨程度。见Sambrook等人(同上)第2卷，第9章，9. 47至9. 57页。

[0055] “严谨性”指有利于非常相似的序列结合而不利于不同序列结合的杂交反应条件。例如，应选择温度和盐浓度的组合，使温度比所研究的杂交的Tm计算值大约120至200℃。
温度和盐浓度常可在前期初步实验中通过经验来确定，在初步实验中，固定在滤膜上的基
因组DNA样品与感兴趣的序列杂交，然后在不同的严谨度条件下洗涤。见Sambrook等人第
9.50页。

[0056] 在设计杂交实验时，影响核酸杂交的一些因素可以方便地予以改变。杂交和洗涤时的温度以及洗涤时的盐浓度的调节最为简单。随着杂交温度(即严谨度)的升高，不同
源的链之间发生杂交的可能性变得更少，结果背景值降低。如果放射性标记的探针并非与
固定的片段完全同源(这在基因家族和种间杂交实验中是常见的)，则必须降低杂交温度，
而背景值将会增加。洗涤温度以类似的方式影响杂交带的强度和背景值的程度。洗涤的严
谨性也随盐浓度的降低而升高。

[0057] 通常，在50%甲酰胺存在下方便的杂交温度是:对于靶片段同源性达95%至100%的探针而言，是42℃；对于同源性为90%至95%的探针，为37 ℃；对于同源性为85和90%
的探针，为32℃。对于较低的同源性，应用上述方程式应相应地降低甲酰胺含量和调节温
度。如果探针和靶片段之间的同源性是未知的，则最简单的方法是从非严谨的杂交和洗涤
条件开始。如果在放射自显影后发现了非特异性的条带或高背景值，则可在高严谨性下洗
涤滤膜，并重新曝光。如果曝光所需时间使得该方法不切实际，则应平行测试几种杂交和/或洗涤严谨性。

[0058] 核酸探针试验

[0059] 采用本发明的核酸探针的方法(如PCR、分支DNA探针试验或印迹技术)能确定cDNA或mRNA的存在。如果探针和本发明的序列能形成稳定地足以被检测到的双链体或双
链复合物，则称探针与本发明的序列“杂交”。

[0060] 核酸探针将与本发明的中华鳖小RNA病毒核苷酸序列(包括有义和反义链)杂交。尽管有许多不同的核苷酸序列编码该氨基酸序列，但是天然的中华鳖小RNA病毒序列
是较佳的，因为它是实际存在于细胞中的序列。mRNA代表一种编码序列，因此探针应与该编码序列互补；单链cDNA与mRNA互补，因此cDNA探针应与非编码序列互补。

[0061] 探针的确切长度和序列将取决于杂交条件，如温度、盐浓度等。例如，对于诊断应用，根据分析物序列的复杂程度，核酸探针通常含有至少10-20个核苷酸，较佳的15-25个，更佳的至少30个核苷酸，但是也可短于该长度。短的引物通常需要较低温度，以便和模板形成足够稳定的杂交复合物。

[0062] 探针可用合成方法产生，例如Matteucci等人[J. Am. Chem. Soc. (1981) 103:3185]的方法或Urdea等人[Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1983) 80 :7461]的方法，或
用市售的自动寡核苷酸合成仪合成。

[0063] 可以根据偏好选择探针的化学特征。对于某些应用，DNA或RNA是合适的。对于其它的应用，可以加入修饰，例如骨架修饰，如硫代磷酸酯或甲基磷酸酯，可用来增加体内半衰期，改变RNA亲和力，增加核酸酶抗性等[例如参见Agrawal和Iyer (1995) Curr
Opin Biotechnol 6:12-19；Agrawal(1996)TIBTECH 14:376-387]；还可采用类似物如肽
核酸[例如参见Corey (1997) TIBTECH 15:224-229；Buchardt等人(1993) TIBTECH
11:384-386]。

[0064] 另外，聚合酶链反应(PCR)是另一个熟知的检测少量靶核酸的手段。该试验在Mullis等人[Meth. Enzymol. (1987) 155 :335-350]；美国专利4, 683, 195和4, 683,
202中有所描述。用两个“引物”核苷酸与靶核酸杂交，并用来引导反应。引物可包含不与扩增靶序列(或其互补序列)杂交的序列，以帮助双链体的稳定性，或例如可插入一个简便
的限制性位点。这些序列通常侧接所需的中华鳖小RNA病毒序列。

[0065] 利用最初的靶核酸作为模板，热稳定的聚合酶能从引物产生靶核酸的拷贝。在聚合酶产生临界量的靶核酸后，它们可用较传统的方法(如Southern印迹)来检测。当采用
Southern印迹方法时，标记的探针将与中华鳖小RNA病毒序列(如其互补序列)杂交。

[0066] 另外，mRNA或cDNA也可用Sambrook等人〔同上〕描述的传统印迹技术来检测。用凝胶电泳可纯化井分离利用聚合酶从mRNA产生的mRNA或cDNA。然后，将凝胶上的核酸印
迹到固体载体如硝酸纤维素上。使固体载体与标记的探针接触，然后洗涤除去所有未杂交
的探针。然后，检测含有标记探针的双链体。该探针通常用放射活性物质作标记。

[0067] 表达系统

[0068] 以往，人们较多地采用原核表达系统来表达VP2 蛋白，表达过程复杂，难操作，且蛋白产量难以提高。因此，本发明人致力于开发新的VP2 蛋白表达系统，以期提高产量，并获得免疫原性良好的蛋白，从而可直接应用于制备疫苗。经过多种表达系统的比较，本发明人最终选择了毕赤酵母系统。

[0069] 比较原核细胞和酵母这两种宿主细胞的特性，酵母的优势非常明显。甲醇毕赤酵母表达系统能将表达的重组蛋白进行精确的翻译后加工修饰，接近于天然蛋白。分泌型酵
母表达载体能将目的蛋白分泌到发酵上清液中，而酵母自身的本底蛋白大部分都留在细胞
沉淀中，免去了沉淀破碎和纯化等繁杂的后续处理。本发明的方法获得的发酵上清液可不
作任何处理直接用于制作亚单位疫苗，结果表明该蛋白亚单位疫苗能够有效地刺激鸡产生
中和抗体。相对于细菌等原核系统表达产物，应用酵母生产的疫苗无任何毒副作用，工艺简单，成本低廉，非常适合大规模工业化生产。

[0070] 本发明对这多种酵母菌株都进行了转化筛选，根据转化子生长情况和蛋白表达量的高低，来选择最合适的酵母菌株。毕赤酵母常用的菌株有KM71H、GS115、X-33 等，都为甲醇营养型酵母菌，在基因组型，外源基因插入时有不同的整合和重组方式，表达效果上有不同。作为本发明的优选方式，采用X-33 作为重组表达的宿主菌。

[0071] 基因组序列的应用

[0072] 基于对中华鳖小RNA病毒基因组全序列的测定，可以了解与该病毒增殖及重要调控功能有关的基因结构和功能，找到其分子生理机制以及如何侵染宿主的关键点，寻找病
毒致病甚至致死基因。

[0073] 一种应用方法是，用中华鳖小RNA病毒感染中华鳖，建立cDNA文库。用双向末端法测定cDNA克隆，或直接对中华鳖小RNA病毒 cDNA的文库用PCR扩增的方法进行序列测
定。基于本发明所提供的中华鳖小RNA病毒基因组序列，可以大大方便引物的设计以及克
隆的进程。

[0074] 另一种直接的应用是使用本发明的引物或探针，来检测样品中是否存在中华鳖小RNA病毒或其遗传物质。

[0075] 对于探针而言，这种检测方法包括步骤:

[0076] 将DNA样品与本发明的探针接触，观察是否形成DNA-探针复合物，形成了复合物就表示样品中存在中华鳖小RNA病毒或遗传物质。

[0077] 对于引物而言，这种检测方法包括步骤:

[0078] 用本发明的特异性引物，对样品进行PCR反应，观察是否扩增产生了特异性的扩增产物，产生了特异性扩增产物就表示样品中存在中华鳖小RNA病毒或遗传物质。

[0079] 在本发明的一个实例中，中华鳖小RNA病毒的基因组序列是通过如下方法获得的，该方法包括步骤:

[0080] 1.分离纯化中华鳖小RNA病毒，获取高纯度RNA样品。

[0081] 2.以此RNA样品为模板，以带有锚定序列的随机引物进行反转录反应，以合成单链cDNA。继续以此cDNA为模板，利用锚定序列引物，在Taq和Deep Vent DNA多聚酶的作
用下进行PCR扩增，并将扩增产物克隆入T载体，进行序列测定，获得大部分病毒序列

[0082] 3.将得到的序列输入计算机，利用软件(如Innerpeace软件)进行拼接，再经后期工作得到完整的病毒基因组全序列。

[0083] 经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上获得了如SEQ ID NO : l所示的中华鳖小RNA病毒基因组全序列。

[0084] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆:实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory
Press,l989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

附图说明

[0085] 图1是 中华鳖小RNA病毒基因组解析图谱；

[0086] 图2是 中华鳖小RNA病毒基因组序列验证的PCR产物电泳图。

[0087] 实施例1

[0088] 病毒RNA的提取及基因组序列解析

[0089] 取中华鳖小RNA病毒株CNSR2011感染的中华鳖脾脏细胞，超声破碎3-5秒，将细胞破碎。4℃ 6000rpm离心30min后取上清液，用0.22um滤膜过滤除菌，再进行蔗糖/甘油
非连续密度梯度离心，获得高纯度中华鳖小RNA病毒，用病毒RNA提取试剂盒提取病毒RNA。

[0090] 逆转录PCR (RT-PCR)

[0091] 逆转录及二链合成：设计并合成引物1:5'-GCAAAAGCCCGAGCGACCTTCNNNNNNNN-3'(SEQ ID NO :4)。取前述制备的RNA病毒5uL置于200 u L的PCR扩增专用小管中，加入
100pmol的引物1，置于65℃变性10min后，立即置于冰上，加入10×逆转录缓冲液2 uL, l
mmol/L 4×dNTP,20U RNasin,和50U Expand Reverse Transcriptase，加水至终体积20 u
L。混匀后42 ℃温育1h。再于沸水孵育2 min后冰冷5 min，加入2.4 uL的10×Klenow
buffer,1.6 uL的Klenow酶，混匀后37℃温育30 min。

[0092] PCR扩增

[0093] 设计并合成以下引物2。

[0094] 引物2 :5’-GCAAAAGCCCGAGCGACCTTC -3' (SEQ ID NO :5)。

[0095] 取上述逆转录产物5uL置于200 u L的PCR扩增专用小管内，加入10 × PCR缓冲液2 u L, 200nmol 4 × dNTP, 400nmol引物2,8U含Deep Vent的Taq DNA聚合酶，混匀
后置PCR仪进行扩增，循环参数:95℃ 3min 1个循环，94℃ 30s, 54℃ 30s, 72℃ 3min
40个循环。反应产物取50uL于1%琼脂糖凝胶电泳检测，并将大小为1-2Kb的片段割下回
收纯化。

[0096] 连接反应

[0097] 按如下条件与 pMD20-T质粒讲行连接:

[0098]10×连接酶缓冲液 1μL
DNA 7.5μL
pMD20-T 0.5μL
T4连接酶 1μL

[0099] 转化

[0100] 取50u1的大肠杆菌DH5α感受态细胞，加入连接反应产物，在冰上放置30分钟。42℃条件下放置1分钟，再进行冰浴2分钟。加入500u1 37℃的SOC营养液，37℃摇菌一小
时，涂板。

[0101] 测序

[0102] 然后，挑取大肠杆菌阳性克隆进行PCR。对PCR产物进行末端双脱氧法测序，将获得的序列进行序列拼接和比对，并采用PCR方法进行补缺，通过RACE法获得病毒末端序列。

[0103] 经过多次反复测序，在平均每个碱基测序约6次的基础上，获得了如SEQ ID NO : l 所示的中华鳖小RNA病毒基因组全序列，根据全基因组序列的进化树分析发现，中华鳖小RNA病毒与肝病毒属和震颤病毒属进化关系最为接近。

[0104] 利用NCBI上的ORF Finder工具寻找并确定中华鳖小RNA病毒基因组全序列中的开放阅读框，并根据氨基酸密码子规律将开放阅读框序列转换为如SEQ ID NO : 2的氨基
酸序列。通过与小RNA病毒科肝病毒属和震颤病毒属中代表病毒甲肝病毒和禽脊髓炎病毒
的开放阅读框编码蛋白序列同源性比对和功能预测，最终获得中华鳖小RNA病毒基因组解
析图谱（图1）。

[0105] 实施例2

[0106] 对中华鳖小RNA病毒基因组序列的验证

[0107] 根据SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列，按每1000bp至1400bp长度区间设计引物，进行PCR反应，PCR结果图见图2，并对PCR产物进行测序验证。结果表明SEQ ID NO:l的
核苷酸序列是正确的。

[0108] 实施例3

[0109] 检测中华鳖小RNA病毒核酸的试剂盒

[0110] 基于SEQ ID NO:l中所示的基因组序列，合成以下PCR引物和探针:

[0111] 正义引物1:序列为SEQ ID NO:l中第7506—7525位。

[0112] 反义引物2:序列为SEQ ID NO:l中第7687—7706位的互补序列。

[0113] 探针3:序列为SEQ ID NO:l中第7551-7570位的互补序列。

[0114] 制备一试剂盒(检测100次)，它含有:

[0115]

[0116] 取中华鳖小RNA病毒感染中华鳖脾脏细胞，如实施例1获得中华鳖小RNA病毒RNA4 5 6 7
并通过反转录获得cDNA样品。将该cDNA样品稀释10, 10, 10 和10 倍制得样品A, B,
C, D，用上述试剂盒进行PCR扩增和杂交检测，同时设置阳性对照和阴性对照。
4 5 6 7

[0117] 结果表明，该试剂盒可以检测稀释度为10, 10, 10 和10 倍的中华鳖小RNA病毒样品。

[0118] 实施例4

[0119] 中华鳖小RNA病毒基因工程疫苗制备

[0120] 根据SEQ ID NO:l所示的核苷酸序列以及SEQ ID NO:l所编码的氨基酸序列SEQID NO:2，选取编码中华鳖小RNA病毒VP1的区域，核苷酸序列为SEQ ID NO:l中第2243—
3133位，对用的氨基酸序列为SEQ ID NO:2中第506—802位。依据VP1基因序列，应用
Oligo5.0 软件在基因上下游设计一对引物。上游引物中引入酶切位点XhoI 和蛋白酶
KEX2 的切割序列，下游引物中引入NotI 酶切位点和终止密码子TAA。引物序列分别是：

[0121] 上游引物：5′-CACTCGAGAAAAGA GCTGGCGATGATGAAGCTG-3′(SEQ ID NO:5)

[0122] 下游引物：5′-TAGCGGCCGC TTCAGCCAAATTTTGTCTGTGAA-3′(SEQ ID NO:6)

[0123] 下划线分别是XhoI、Not I 酶切位点；斜体为蛋白酶KEX2 的切割序列；上游引物方框内为起始密码子(ATG)，下游引物方框内为终止密码子(TAA) 的反向序列。以上构建原因一：当重组蛋白由信号肽引导从胞内分泌至胞外时，经信号肽蛋白切割酶( 该蛋白切
割酶天然存在于酵母体内) 切割后，在目的蛋白的N 端不会残留多余的氨基酸，从而不影
响其天然免疫原性。原因二：在下游引物中添加TAA终止密码子，使得重组蛋白只表达VP2 蛋白，而不带有酵母载体自身的c-myc epitope 抗原表位和六组氨酸标签polyhistidine
tag，使目的蛋白保持天然活性。

[0124] 以实例1中反转录获得的产物为模板，对中华鳖小RNA病毒VP1编码区进行扩增，并将产物克隆入酵母表达载体pPICZαA中，转化毕赤酵母X-33，进行诱导表达，采用常规
方法进行SDS-PAGE 和Western-blot 鉴定表达的VP1蛋白，并用中华鳖小RNA病毒多抗血
清与目的蛋白进行免疫学反应，结果表明表达的VP1蛋白具有免疫反应性。

[0125] 按照水油比例为2 ∶ 3( 体积比) 进行乳化，即两份重组蛋白发酵上清( 含0.5％(v/v) 吐温-80，蛋白浓度为0.766mg/ml) 加3 份白油司本( 白油购自山东搏润工
业技术有限公司，司本购自北京希凯创新有限公司) 充分乳化均匀，即成VP1 蛋白基因工
程亚单位疫苗。

[0126] 取200克体重的健康中华鳖进行免疫，分三组，每组10 只，每只免疫剂量均为0.5mL，免疫方式为后腿根部皮下注射。A 组为本发明的VP1 蛋白亚单位疫苗，B 组为常规中华鳖小RNA病毒土法组织灭活疫苗，C 组阴性对照。20日后采用中华鳖小RNA病毒强毒
株攻毒，攻毒后连续观察15 天，计算免疫保护率。

[0127] 攻毒后15天，VP1 蛋白基因工程亚单位疫苗免疫组保护率为90％，土法组织灭活苗免疫组保护率为60％,对照组攻毒后10日内全部死亡。这表明了，本发明表达的本发明
的重组VP1蛋白亚单位疫苗能够完全保护免疫中华鳖抵抗中华鳖小RNA病毒强毒株的致死
性攻击。

[0128] 实施例5

[0129] 中华鳖小RNA病毒抗体制备

[0130] 以实施例4中获得的重组VP1蛋白，免疫BALB/c小鼠，每14日加强免疫1次，共免疫3次，在末次免疫后第5日采集小鼠血清并分离抗体。采用ELISA方法检测抗体效价，
检测结果抗体效价达1:12800。表明，本发明公布的中华鳖小RNA病毒基因组序列所编码的
氨基酸序列可以用于制备中华鳖小RNA病毒，并能进一步可以获得抗中华鳖小RNA病毒的
高效价抗体。

[0131] 此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。