一种饲用高活性乳酸菌固态制剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种饲用高活性乳酸菌固态制剂及其制备方法。该固态制剂包括益生乳酸菌菌泥、保护配方和基本配方。本发明还提供该固态制剂的制备方法，通过保护配方和基本配方中各种组分的协同作用有效保护乳酸菌，提高了整个过程中的活菌存活率。本发明制备的乳酸菌制剂中乳酸菌耐高温高湿能力提高、在模拟肠液中存活率高，动物应用效果显著提高。

权利要求

1.一种饲用高活性乳酸菌固态制剂，其特征在于，包括益生乳酸菌菌泥、保护配方和基本配方；其中，所述益生乳酸菌菌泥是屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌或保加利亚杆菌中的一种或几种的菌泥，重量份数为1～5份；

所述保护配方包括如下重量份数的组分：0.1～2份的食品级甘油，0.4～2份的蔗糖，

0.3～5份的麦芽糊精，0.1～3份的乳清粉和0.06～1.5份的植物提取物；所述植物提取物为杜仲叶提取物和陈皮提取物，或杜仲叶提取物、陈皮提取物和甘草提取物，其中，所述杜仲叶提取物、陈皮提取物或甘草提取物是：将1～10份杜仲叶、陈皮或甘草在40℃～

55℃条件下干燥至水分含量≤10%，粉碎至60～80目，无水乙醇萃取1～3h，过滤，旋转蒸发得到萃取物，加入10～200份水，即得；

所述基本配方包括如下重量份数的组分：3～10份的益生因子，3～10份的黏结剂，

20.5～55份的包衣剂，34～67份的淀粉；

所述饲用高活性乳酸菌固态制剂是通过下述方法制得：

（1）以屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌或保加利亚杆菌中的一种或几种为菌种进行发酵，然后将发酵液离心，制得菌泥；

（2）将重量份数为1～5份的上述菌泥与保护配方中的各种组分混合，然后加入水，分散搅匀，制得菌液，其中，所述保护配方包括如下重量份数的组分：0.1～2份的食品级甘油，0.4～2份的蔗糖，0.3～5份的麦芽糊精，0.1～3份的乳清粉和0.06～1.5份的植物提取物；

（3）将步骤（2）制得的菌液和基本配方中的各种组分混合搅拌，且搅拌过程中加水，然后进行湿法制粒、干燥，得到成品，其中，加水量为基本配方组分总重量的40%～50%；所述基本配方包括如下重量份数的组分：3～10份的益生因子，3～10份的黏结剂，20.5～55份的包衣剂，34～67份的淀粉。

2.根据权利要求1所述的饲用高活性乳酸菌固态制剂，其特征在于，所述益生因子为低聚木糖或低聚果糖中的一种或两种；所述黏结剂为羧甲基纤维素钠或微晶纤维素中的一种或两种；所述包衣剂为聚丙烯酸树脂Ⅱ、海藻酸钠或氯化钙中的一种或几种；所述淀粉为玉米淀粉、麦类淀粉或马铃薯淀粉中的一种或几种。

3.一种饲用高活性乳酸菌固态制剂的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

（1）以屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌或保加利亚杆菌中的一种或几种为菌种进行发酵，然后将发酵液离心，制得菌泥；

（2）将重量份数为1～5份的上述菌泥与保护配方中的各种组分混合，然后加入水，分散搅匀，制得菌液，其中，所述保护配方包括如下重量份数的组分：0.1～2份的食品级甘油，0.4～2份的蔗糖，0.3～5份的麦芽糊精，0.1～3份的乳清粉和0.06～1.5份的植物提取物；所述植物提取物为杜仲叶提取物和陈皮提取物，或杜仲叶提取物、陈皮提取物和甘草提取物，且所述杜仲叶提取物、陈皮提取物或甘草提取物的制备方法为：将1～10份杜仲叶、陈皮或甘草在40℃～55℃条件下干燥至水分含量≤10%，粉碎至60～80目，无水乙醇萃取1～3h，过滤，旋转蒸发得到萃取物，加入10～200份水，即得；

（3）将步骤（2）制得的菌液和基本配方中的各种组分混合搅拌，且搅拌过程中加水，然后进行湿法制粒、干燥，得到成品，其中，加水量为基本配方组分总重量的40%～50%；所述基本配方包括如下重量份数的组分：3～10份的益生因子，3～10份的黏结剂，20.5～55份的包衣剂，34～67份的淀粉。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，发酵时使用的培养基配方为：蔗糖

1～4%(W/V)，玉米浆1～3%(W/V)，酵母膏0.4～2%(W/V)，氯化镁0.06～0.1%(W/V)，硫酸锰0.04～0.2%(W/V)，碳酸钙0.1～0.4%(W/V)，氯化钠0.2～0.6%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述益生因子为低聚木糖或低聚果糖中的一种或两种；所述黏结剂为羧甲基纤维素钠或微晶纤维素中的一种或两种；所述包衣剂为聚丙烯酸树脂Ⅱ、海藻酸钠或氯化钙中的一种或几种；所述淀粉为玉米淀粉、麦类淀粉或马铃薯淀粉中的一种或几种。

6.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述干燥为20℃～45℃条件下旋流干燥。

7.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，发酵时的温度为：30℃～

39℃。

说明书

一种饲用高活性乳酸菌固态制剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种微生物饲料添加剂，特别是一种饲用高活性乳酸菌固态制剂及其制备方法，属于微生物制剂领域。

背景技术

[0002] 益生菌作为抗生素的替代品之一，已在饲料添加剂领域得以广泛的应用。在动物体内，微生物从未被胃肠消化的食糜中制造能量，刺激肠道免疫系统，或提供必要维生素，调整肠道微生态及其代谢活性。虽然益生菌制剂已逐步发展成为最具有应用前景的抗生素替代产品，但是益生菌尤其是具有肠道粘附作用的乳酸菌，在生产、加工、储存和使用过程中极易失活，对胃酸、胆盐等的抵抗力差，因此，研究开发生产全过程有效保护的益生菌制剂技术已成为国内外的热点。

[0003] 现有技术和专利中，益生菌制剂(尤其是乳酸菌)的应用效果受多种因素影响，如动物种类、生理状态、饲料类型、加工工艺、制剂的细菌组成、饲喂方法、剂量、水分、温度、pH值和菌制剂的保存时间等。如何保持微生物的稳定性是从事乳酸菌制剂研究和生产面临的最现实和最重要的问题。

[0004] (1)乳酸菌的活性问题。在运输、使用和保存过程中易失活，从而降低生物活性作用，导致制剂使用效果的重复性和稳定性较差。

[0005] (2)在饲料加工过程中的稳定性问题。对乳酸菌饲料添加剂必须经受饲料加工制粒过程中80℃高温的考验，所以菌种及其制剂对温度的稳定性显得尤为重要。不同的菌种对高温的耐受力差异较大，一般制粒温度对芽孢杆菌影响较小，对乳酸杆菌、酵母菌等影响2+ 2+ 2+ 2+
较大。除此以外，饲料的保存时间、饲料中的矿物质（如重金属离子Cu 、Zn 、Mn 、Fe 等）、胆碱等也会影响益生菌的活力。

[0006] (3)在动物体内，乳酸菌制剂必须通过胃环境，以大量的活菌到达肠道并定居于肠粘膜上才能发挥其生理功能。然而，由于大部分乳酸菌在进入肠道前就已经因胃酸和胆汁作用而死亡，因此在宿主体内存活增殖的能力较低，很大程度上影响了它们的益生效果。在肠道的存活率也就成为乳酸菌功效的一个重要指标。而任何宣称添加有益生菌的产品标准6 7
是必须含有至少10-10cfu/g的有活性的益生菌（FAO/WHO，2001）。

[0007] (4)制剂配方单一，通用性不强，从而限制了同一工艺或方法在非指定菌种制备的乳酸菌制剂中的应用。

发明内容

[0008] 本发明要解决的第一个技术问题是提供一种饲用高活性乳酸菌固态制剂，该制剂中乳酸菌存活率高，耐高温高湿能力提高，且在肠液中存活率高，可替代抗生素，能显著提升肉仔鸡的生产性能和健康性能，有效降低仔猪腹泻率。

[0009] 本发明要解决的第二个技术问题是提供一种饲用高活性乳酸菌固态制剂的制备方法，该制备方法具有以下特点：

[0010] （1）具有通用性，工艺简单，对常见商用乳酸菌，包括屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌或保加利亚杆菌，具有广泛的适用性，并可用于大量生产，操作简单，辅料成本低廉；

[0011] （2）采用“两步法”，即添加基本配方和保护配方，制备微生物制剂，对乳酸菌生产、储存和使用过程有效保护，提高了整个过程中的活菌存活率；

[0012] （3）独特的配方组分、比例和添加顺序，使得乳酸菌、保护剂、益生因子和各种助剂相互作用、相互配合，以达到有效保证活菌数的目的。

[0013] 为解决第一个技术问题，本发明采用以下技术方案：

[0014] 本发明提供了一种饲用高活性乳酸菌固态制剂，其包括益生乳酸菌菌泥、保护配方和基本配方；其中，

[0015] 所述益生乳酸菌菌泥是屎肠球菌（Enterococcus faecium）、粪肠球菌（Enterococcus faecalis）、乳 酸 肠球 菌（Enterococcus lactis）、两 歧 双歧 杆 菌（Bifidobacterium bifidum）、嗜 酸 乳 杆 菌（Lactobacillus acidophilus）、干 酪 乳杆菌（Lactobacillus casei）、乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸片球菌（Pedicoccus acidilacticii）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）或保加利亚杆菌（Lactobacillus bulgaria）中的一种或几种的菌泥，重量份数为1～5份；

[0016] 上述这些菌种均可以通过商业购买的方式获得。

[0017] 所述保护配方包括如下重量份数的组分：0.1～2份的食品级甘油，0.4～2份的蔗糖，0.3～5份的麦芽糊精，0.1～3份的乳清粉和0.06～1.5份的植物提取物；

[0018] 所述基本配方包括如下重量份数的组分：3～10份的益生因子，3～10份的黏结剂，20.5～55份的包衣剂，34～67份的淀粉。

[0019] 进一步地，本发明所述植物提取物优选为杜仲叶提取物、陈皮提取物或甘草提取物中的一种或几种。

[0020] 所述益生因子为低聚木糖或低聚果糖中的一种或两种。

[0021] 所述黏结剂为羧甲基纤维素钠或微晶纤维素中的一种或两种。

[0022] 所述包衣剂为聚丙烯酸树脂Ⅱ、海藻酸钠或氯化钙中的一种或几种；优选地，所述包衣剂为聚丙烯酸树脂Ⅱ、或海藻酸钠与氯化钙两种组合、或聚丙烯酸树脂Ⅱ、海藻酸钠与氯化钙三种组合。

[0023] 所述淀粉为玉米淀粉、麦类淀粉或马铃薯淀粉中的一种或几种。

[0024] 为解决第二个技术问题，本发明采用以下技术方案：

[0025] 一种饲用高活性乳酸菌固态制剂的制备方法，该方法包括以下步骤：

[0026] （1）以屎肠球菌、粪肠球菌、乳酸肠球菌、两歧双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌或保加利亚杆菌中的一种或几种为菌种进行发酵，然后将发酵液离心，制得菌泥；

[0027] （2）将重量份数为1～5份的上述菌泥与保护配方中的各种组分混合，然后加入水，分散搅匀，制得菌液，其中，所述保护配方包括如下重量份数的组分：0.1～2份的食品级甘油，0.4～2份的蔗糖，0.3～5份的麦芽糊精，0.1～3份的乳清粉和0.06～1.5份的植物提取物；在该步骤中，加水的目的是为了分散菌泥，按照常规操作，加水量只要保证能够使菌泥分散即可，一般情况所述水与菌泥的重量比为（5-7）:1；

[0028] （3）将步骤（2）制得的菌液和基本配方中的各种组分混合搅拌，且搅拌过程中加水，然后进行湿法制粒、干燥，得到成品，其中，所述加水量为基本配方组分总重量的40%～50%；所述基本配方包括如下重量份数的组分：3～10份的益生因子，3～10份的黏结剂，
20.5～55份的包衣剂，34～67份的淀粉。

[0029] 进一步地，所述植物提取物为杜仲叶提取物、陈皮提取物或甘草提取物中的一种或几种，具体制备方法为：将1～10份杜仲叶、陈皮或甘草在40℃～55℃条件下干燥至水分含量≤10%，粉碎至60～80目，无水乙醇萃取1～3h，过滤，旋转蒸发得到萃取物，用加入10～200份水，即得。

[0030] 进一步地，本发明在进行菌种发酵时，可以使用现有技术中已知的适合于菌种生长的培养基，例如，MRS培养基、LB培养基等，本发明在此提供了一种优选培养基的配方：蔗糖1～4%(W/V)，玉米浆1～3%(W/V)，酵母膏0.4～2%(W/V)，氯化镁0.06～0.1%(W/V)，硫酸锰0.04～0.2%(W/V)，碳酸钙0.1～0.4%(W/V)，氯化钠0.2～0.6%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2。

[0031] 本发明所使用的“W/V”是指重量体积比，即g/ml或kg/L。

[0032] 进一步地，上述方法中所述益生因子为低聚木糖或低聚果糖中的一种或两种；所述黏结剂为羧甲基纤维素钠或微晶纤维素中的一种或两种；所述包衣剂为聚丙烯酸树脂Ⅱ、海藻酸钠或氯化钙中的一种或几种，优选地，所述包衣剂为聚丙烯酸树脂Ⅱ一种组分、或海藻酸钠与氯化钙两种组合、或聚丙烯酸树脂Ⅱ、海藻酸钠与氯化钙三种组合。所述淀粉为玉米淀粉、麦类淀粉或马铃薯淀粉中的一种或几种。

[0033] 进一步地，步骤（3）中，所述干燥为20℃～45℃条件下旋流干燥。

[0034] 进一步地，本发明在进行菌种发酵时，发酵温度为：30℃～39℃。发酵过程中还可以控制氧气的量，一般在有氧或微好氧条件下发酵培养，当选择微好氧条件发酵时，氧气的量为0～0.5mg/L溶解氧。

[0035] 本发明的有益效果为：

[0036] 1.本发明的饲用高活性乳酸菌固态制剂形态结构稳定，在生产、加工、储存、使用过程中有效保护活菌。与只加基本配方的乳酸菌制剂相比，该制剂在制粒后、干燥后活菌存活率提高；货架期延长，常温下储存6个月，有效活菌存活率在80%以上；在模拟肠液中的菌存活率均达到87%以上；高温高湿耐受力提高50%。

[0037] 2.动物应用效果显著提高：本发明的饲用高活性乳酸菌固态制剂改善肉鸡生产性能，显著提高日增重，降低料肉比；在10-100g/T添加量下，与基础日粮组相比，该制剂降低料肉比9.5%以上；改善肉鸡健康性能，肠绒毛明显变长，比例协调，排列整齐，高低均匀，单位面积上肠绒毛数量多；抗氧化性能增强，总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶水平均有提高（P＜0.05），肠道中双歧杆菌和乳杆菌含量显著提高（P＜0.05）。

[0038] 此外，还能改善仔猪生产性能，提高日增重，降低料重比；在30-100g/T添加量下，与只加基本配方组相比，该制剂提高日增重在1.37%以上；改善仔猪健康性能，显著降低仔猪腹泻率在18%以上（P＜0.05），可部分替代氧化锌和抗生素。

具体实施方式

[0039] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但并不是限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂供应商购买得到。

[0040] 实施例1

[0041] （1）植物提取物的制备

[0042] 分别将1～10份杜仲叶、陈皮和甘草在40℃～55℃条件下干燥至水分含量≤10%，粉碎至60～80目，无水乙醇10～50份、萃取1～3h，过滤，旋转蒸发得到萃取物3
（密度0.7～1.5g/cm），用加入10～200份水，即得。

[0043] （2）配制MRS培养基和优选培养基

[0044] MRS培养基的配制：取蛋白胨1%(W/V)，葡萄糖2%(W/V)，牛肉浸膏1%(W/V)，无水乙酸钠0.5%(W/V)，酵母浸膏0.5%(W/V)，吐温800.1ml，磷酸氢二钾0.2%(W/V)，柠檬酸氢二铵0.2%(W/V)，七水合硫酸镁0.058%(W/V)，一水合硫酸锰0.025%(W/V)，水100ml，调节pH至
7.0±0.2；采用湿热灭菌，温度为115℃，灭菌时间30min。

[0045] 优选培养基的配制：蔗糖1～4%(W/V)，玉米浆1～3%(W/V)，酵母膏0.4～2%(W/V)，氯化镁0.06～0.1%(W/V)，硫酸锰0.04～0.2%(W/V)，碳酸钙0.1～0.4%(W/V)，氯化钠0.2～0.6%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2；采用湿热灭菌，温度为115℃，灭菌时间30min。

[0046] （3）菌泥制备

[0047] a.选取屎肠球菌（CGMCC2516）、嗜酸乳杆菌（ATCC4356），分别将菌种在35℃微好氧条件（即0.5mg/L溶解氧）下，MRS培养基中培养8h，得到屎肠球菌和嗜酸乳杆菌一级种子液；

[0048] b.分别将两种菌的一级种子液按2%接种量接入种子罐中扩大培养，在35℃微好氧条件下，MRS培养基中培养6h，得到两种菌的二级种子液；

[0049] c.分别将两种菌的二级种子液按5%接种量接入发酵罐中进行发酵培养，使用优选培养基进行发酵培养，在38℃微好氧条件下培养24h；将发酵液用管式离心机10000rpm离心得到两种菌的菌泥，根据需要可以按照任一比例将两种菌泥混合，制得混合菌泥，例如，屎肠球菌菌泥与嗜酸乳杆菌菌泥的质量比为1:1,1:2，1:3，2:1，或3:1等等；

[0050] （4）固态制剂的配方：

[0051] 混合菌泥50g；

[0052] 保护配方：5g食品级甘油、20g蔗糖、30g麦芽糊精、30g乳清粉、13g杜仲叶提取物、1g陈皮提取物；

[0053] 基本配方：300g低聚木糖、20g羧甲基纤维素钠、450g微晶纤维素、8g聚丙烯酸树脂Ⅱ、550g海藻酸钠、600g氯化钙、1700g玉米淀粉。

[0054] （5）制剂样品制备

[0055] 一份加无菌水稀释20倍备用（样品一），一份只加入基本配方组分制粒（样品二），一份加入基本配方和保护配方制粒（样品三）。

[0056] A.只加入基本配方组分制粒

[0057] 取上述菌泥与基本配方中的各种组分混合搅拌，且搅拌过程中加水（所述加水量为基本配方组分总重量的40%～50%），然后湿法制粒、抛圆，20℃～45℃条件下旋流干燥，得成品。

[0058] B．加入基本配方和保护配方制粒

[0059] 取上述菌泥立即与保护配方中各种组分混合，然后加入水，分散搅匀，静置15-60min，制得菌液备用；

[0060] 取上述得到的备用菌液和基本配方中的各种组分混合搅拌，且搅拌过程中加水（所述加水量为基本配方组分总重量的40%～50%），然后进行湿法制粒、抛圆，20℃～45℃10
条件下旋流干燥，得到成品。制粒、干燥后活菌数在1.0×10 CFU/g以上。

[0061] （6）本实施例所制备乳酸菌制剂的性能检测

[0062] a.将（5）中的样品二和样品三的加工中间品（制粒后、干燥后）取样，检测样品活菌数和存活率，见表1；b.将（5）中的3个样品置于模拟肠液（中国药典配方）中2h，检测样品活菌数和存活率，见表2；c.将（5）中的样品置于85℃、60%湿度环境中2min，检测样品活菌数和存活率，见表3；d.将（5）中的3个样品密封保存、20℃常温储存，检测样品活菌数和存活率，见表4。

[0063] 表1

[0064]

[0065] 注：菌数单位：CFU值/g。下同。

[0066] 表2

[0067]

[0068] 表3

[0069]样品 0h原始值 2min 2min后存活率%
样品一 1.21×1010 7.1×106 --
样品二 1.17×1010 1.15×109 9.8
样品三 1.01×1010 6.16×109 61.01

[0070] 表4

[0071]

[0072] 由上可以得出：a.生产过程中间品对比表明：制粒后、干燥后用“两步法”制成的乳酸菌制剂活菌存活率比只加基本配方的制剂分别提高6.05%和20.01%；b.模拟肠液耐受实验表明：利用“两步法”制成的乳酸菌制剂中有效活菌存活率分别显著高于不加任何辅料保护的菌液、只加基本配方的制剂为16.42%和8.69%；c.高温高湿耐受实验表明：利用“两步法”制成的乳酸菌制剂中有效活菌存活率显著高于只加基本配方的制剂超过50%；d.6月储存实验表明：利用“两步法”制成的乳酸菌制剂中有效活菌存活率在80%以上，远高于不加任何辅料保护的菌液、只加基本配方的制剂。

[0073] 实施例2

[0074] （1）制备LB培养基和优选培养基的配制

[0075] LB培养基的配制：取胰蛋白胨1%(W/V)，酵母提取物0.5%(W/V)，氯化钠1%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2；采用湿热灭菌，121℃，20min。

[0076] 优选培养基的配制：蔗糖1～4%(W/V)，玉米浆1～3%(W/V)，酵母膏0.4～2%(W/V)，氯化镁0.06～0.1%(W/V)，硫酸锰0.04～0.2%(W/V)，碳酸钙0.1～0.4%(W/V)，氯化钠0.2～0.6%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2；采用湿热灭菌，温度为115℃，灭菌时间30min。

[0077] （2）菌泥制备

[0078] a.选取粪肠球菌（ATCC19433），将菌种在35℃条件下，LB培养基中培养8h，得到一级种子液；

[0079] b.将一级种子液按2%接种量接入种子罐中扩大培养，在37℃微好氧条件下，LB培养基中培养6h，得到二级种子液；

[0080] c.将二级种子液按5%接种量接入发酵罐中进行发酵培养，使用优选培养基进行发酵培养，在38℃微好氧条件下培养24h；将发酵液用台式离心机6000rpm离心制得菌泥。

[0081] （3）固态制剂的配方

[0082] 菌泥100g；

[0083] 保护配方为：25g食品级甘油、45g蔗糖、30g麦芽糊精、28g乳清粉、8g杜仲叶提取物、1.5g陈皮提取物、4.5g甘草提取物；所述植物提取物的制备方法同实施例1；

[0084] 基本配方为：325g低聚木糖、1.0g羧甲基纤维素钠、334g微晶纤维素、18g聚丙烯酸树脂Ⅱ、1050g海藻酸钠、1200g氯化钠、6700g玉米淀粉；

[0085] （4）制剂样品制备

[0086] 一份只加入基本配方组分制粒，一份加入基本配方和保护配方制粒（制粒、干燥后活菌数在1.0×1010CFU/g以上）。具体制备方法同实施例1。

[0087] （5）本实施例所制备的乳酸菌制剂的性能检测：对肉仔鸡生长及健康的作用效果。

[0088] 实验动物：120只AA公肉鸡；

[0089] 饲养管理：整个饲养期共计42d，分为两个阶段：1-21d为前期，22-42d为后期。采用笼养(每个笼子就是一个重复)，整个试验期按常规进行免疫、消毒，全天24h光照，全期自由采食与饮水，自动控温控湿。育雏期前3d室温控制在33℃，以后每周下降3℃直至24℃恒温；湿度1-21日保持在65-70%，22-42保持60-65%；1-42d持续24h光照和通风。

[0090] 分组设计：

[0091] 将120只肉仔鸡随机分成4组，每组6个重复，每重复5只。饲养于中试基地SPF房，电脑控制温湿度。

[0092] A组：饲喂不加抗生素的基础日粮+只加基本配方乳酸菌制剂

[0093] B组：饲喂不加抗生素的基础日粮+“两步法”保护的乳酸菌制剂1.00×1010CFU/kg饲料。

[0094] 实验结果如表5-6。

[0095] 表5“两步法”制成的乳酸菌制剂对肉仔鸡生长性能的影响

[0096]

[0097]

[0098] 同行肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P>0.05）。下表同。

[0099] 表6总抗氧化能力（T-AOC）

[0100]A组 B组
21日龄 11.11±0.84a 15.54±1.19c
42日龄 9.49±0.93bc 10.89±1.28c

[0101] 表7“两步法”制成的乳酸菌制剂对肉仔鸡小肠绒毛形态结构的影响[0102]

[0103]

[0104] 表8“两步法”制成的乳酸菌制剂对肉仔鸡肠道菌群的影响

[0105]

[0106]

[0107] 表5-表8表明，与只加基本配方制剂的组别相比，“两步法”制成的乳酸菌制剂组别肉鸡料肉比显著降低9.66%；总抗氧化能力显著提高14.75%-39.87%；单位面积肠绒毛数量多，肠绒高度、隐窝深度均有显著变化；回肠内双歧杆菌、乳杆菌数量显著增加。

[0108] 实施例3

[0109] （1）制备培养基

[0110] 配制LB培养基：取胰蛋白胨1%(W/V)，，酵母提取物0.5%(W/V)，氯化钠1%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2；采用湿热灭菌，121℃，20min。

[0111] 配制优选培养基：蔗糖1～4%(W/V)，玉米浆1～3%(W/V)，酵母膏0.4～2%(W/V)，氯化镁0.06～0.1%(W/V)，硫酸锰0.04～0.2%(W/V)，碳酸钙0.1～0.4%(W/V)，氯化钠0.2～0.6%(W/V)，水100ml，pH7.0±0.2；灭菌方法：湿热灭菌，115℃，30min。

[0112] （2）菌泥制备

[0113] a.选取乳酸乳杆菌（ATCC12315）、保加利亚杆菌（ATCC11842）和乳酸肠球菌（ATCC19435），分别将菌种在35℃微好氧条件（即0.3mg/L溶解氧）下，LB培养基中培养8h，得到三种菌的一级种子液；

[0114] b.分别将三种菌的一级种子液按2%接种量接入种子罐中扩大培养，在37℃微好氧条件下，LB培养基中培养6h，得到三种菌的二级种子液；

[0115] c.分别将三种菌的二级种子液按5%接种量接入发酵罐中进行发酵培养，使用优选培养基进行发酵培养，在38℃微好氧条件下培养24h；将发酵液用台式离心机6000rpm离心得到菌泥。根据需要可以按照任一比例将三种菌泥混合，制得混合菌泥，例如，乳酸乳杆菌菌泥、保加利亚杆菌菌泥与乳酸肠球菌菌泥的质量比为1:1:1,1:2:1，1:1:3，2:1:1等等；

[0116] （3）固态制剂的配方

[0117] 混合菌泥50g

[0118] 保护配方：10g食品级甘油、23g蔗糖、33g麦芽糊精、26g乳清粉、8g杜仲叶提取物、1g陈皮提取物、4g甘草提取物；植物提取物的制备方法参见实施例1；

[0119] 基本配方：450g低聚木糖、18g羧甲基纤维素钠、320g微晶纤维素、10g聚丙烯酸树脂Ⅱ、1250g海藻酸钠、1550g氯化钙、3250g玉米淀粉。

[0120] （4）制剂样品制备

[0121] 一份只加入基本配方组分制粒（样品一），一份加入基本配方和保护配方制粒（样品二）具体制备方法同实施例1。

[0122] （5）本实施例制备的乳酸菌制剂的性能检测

[0123] 实验目的：对比只加基本配方与“两步法”制成的乳酸菌制剂对仔猪腹泻、日增重。

[0124] 试验动物：断奶仔猪102头；

[0125] 试验期限：试验自断奶开始，试验期35天；

[0126] 分组设计：

[0127] 将断奶仔猪随机分成2组（样品一组和样品二组），每组3个重复，每重复17只。