一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物

摘要

本发明涉及一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物，该组合物的组分的重量百分比为：人参皂苷Rb128～32%，人参皂苷Rg118～22%，人参皂苷Rb214～16%，人参皂苷Rc14～16%，人参皂苷Re8～12%，麦冬皂苷D14～16%。本发明的优点在于，提供了一种组分固定、科学、质量可控、稳定、药效显著且安全性更高的人参皂苷、麦冬皂苷Ｄ组合物，在抗（心肌、脑、肺）缺血再灌注损伤、抗血栓、抗动脉硬化、抗心律失常等方面药效与参麦注射液相当或略好，在急性毒性、异常毒性、溶血与凝聚等安全性方面比参麦注射液更安全。本发明具有成分清楚固定，质量更稳定、可控，疗效显著、安全性更高的优点。

权利要求

1.一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物，其特征在于，该组合物的组分包含人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rc，人参皂苷Re，麦冬皂苷D；其所述组份的重量百分比为：人参皂苷Rb128～32%，人参皂苷Rg118～22%，人参皂苷Rb214～

16%，人参皂苷Rc14～16%，人参皂苷Re8～12%，麦冬皂苷D14～16%。

2.根据权利要求1所述的一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物，其所述特征在于:该组合物的组分中，人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rc，人参皂苷Re，麦冬皂苷D的纯度均为85%～99.9%。

3.根据权利要求1和2所述的一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物，其特征在于，该组合物含有药学上常规的载体。

说明书

一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物，具体的说由人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、麦冬皂苷D组成。

背景技术

[0002] 心脑血管疾病是威胁人类健康的首要疾病。据世界卫生组织（WHO）关于1996年全球各种疾病的死亡统计显示，全球心脑血管疾病患者至少有4.5亿人，是导致死亡和致残最多的疾病，冠心病、脑卒中和其它心脏病死亡人数共计1400万，占总死亡人数的28.8%，并且呈逐年上升的趋势，据不完全统计，2000年死于心脑血管疾病已占总死亡人数的34％，约占疾病死亡人口的一半以上。

[0003] 我国的情况与WHO统计大致相似。1999年心脑血管疾病导致人口死亡占总死因的百分比已上升到39.4%，也是导致人口死亡的头号疾病和主要原因。我国现有600万以上的脑卒中患者，其中75%不同程度地丧失劳动能力，4%重残，每年还有约150万新发脑卒中患者和75万冠心病患者，高血压、高血脂疾病更是人数众多，病人现已逾亿。由此导致的家庭、医疗和经济负担已成为不可小觑的社会问题。心脑血管疾病己成为全世界主要的公共卫生问题之一，研制治疗心脑血管疾病的新型药物，已成为极为迫切的事情。

[0004] 人参具有大补元气,复脉固脱,补脾益肺,生津养血,安神益智的功效。人参皂苷是人参的最主要的活性成分,已从人参中分离出人参皂苷R0、Ra1、Ra2、Ra3、Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Re、Rf、Rg1、Rg2、Rg3、Rh1、Rh2、Rh3、Rs1、Rs2等40余种单体人参皂苷。现代研究表明,人参皂苷具有抗感染、解毒、抗疲劳、抗肿瘤、抗氧化、舒张血管、促进生物合成和抑制血小板凝集等作用。其中人参皂苷Rg1、Re、Rb1、Rb2、Rc在人参中含量最高，且表现出多种药理活性，主要体现如下：

[0005] 人参皂苷Rbl的主要药理作用有：1、抗心肌缺血再灌注损伤；2、抗肺缺血再灌注损伤；3、抗脑缺血损伤；4、促进周围神经细胞再生；5、改善小鼠学习记忆功能；6、抗衰老作用。

[0006] 人参皂苷Rg1的主要药理作用有：1、对心肌缺血再灌注损伤的保护作用；2、对心率失常及动脉粥样硬化的治疗作用；3、对脑缺血再灌注损伤的保护作用；4、中枢神经系统保护作用；5、免疫促进作用；6、抗衰老、促智等药理作用。

[0007] 人参皂苷Rb2主要药理作用有：1、对脂肪代谢的作用，能够预防和减少高血脂症和动脉粥样硬化症的发生；对胆固醇有异化作用和促进排泄作用；抑制机体对脂肪的吸收。2、对心血管系统的作用，具有钙通道阻滞作用和抗自由基作用；能够对抗过量黄嘌呤一黄嘌呤氧化酶诱发的心肌细胞氧化性损伤。3、促进DNA、RNA和蛋白质合成的作用。4、抑制肿瘤生长和扩散。5、对中枢神经系统的作用，有抑制吗啡耐受性和依赖性发生的作用，可拮抗吗啡的阵痛作用和僵住反应，同时可拮抗吗啡升高体温作用，减弱吗啡脑室给药引起的抗伤害作用。6、对肝脏糖代谢的作用，抑制葡萄糖-6-磷酸酶来抑制糖尿病大鼠的糖异生，增加组织中ATP含量，减少AMP含量，从而改变糖尿病大鼠体内的代谢模式，使血糖和肝糖元含量明显降低。7、抑制人视网膜色素上皮细胞增生的作用。

[0008] 人参皂苷Rc主要药理作用有：1、抗血栓和抗动脉硬化作用。2、抗心律失常作用。3、抗过氧化活性。4、钙通道阻滞作用。5、对cAMP磷酸二酯酶有抑制活性。6、促进血浆分泌皮质酮活性。7、保肝作用。8、对蛋白酪氨酸激酶有兴奋作用。

[0009] 人参皂苷Re主要药理作用有：1、抗缺血性心律失常；2、抗心肌缺血；3、对细胞膜流动性的双向调节作用；4、较强的镇静作用及抗利尿作用；5、抗帕金森病作用；6、抗衰老功能；7、降血糖作用；8、促进小鼠骨髓细胞增殖作用。

[0010] 麦冬具有滋阴生津,润肺清心等功效,是临床治疗心血管疾病的重要组成药味。其主要成分为甾体皂苷、多糖和高异黄酮类化合物,药理研究表明:总皂苷具有抗心肌缺血损伤和抗心率失常作用，在川麦冬中总皂苷主要含麦冬皂苷D，麦冬皂苷D主要药理作用有：显著抑制静脉血栓模型大鼠早期外周血中性粒细胞活化、粘附，减轻血栓重量，降低血清sICAM-1含量，降低炎症反应、抑制血栓形成。稳定线粒体膜电位，减少钙离子内流，增加细胞活力，对人脐静脉血管内皮细胞（HUVEC）有一定的保护作用。另外，麦冬皂苷D还可以具有止咳、平喘、抗炎的功效。

[0011] 在申请号为201010225595.2的“包含红参皂苷提取物和麦冬皂苷提取物的药物组合物、其制备方法和用途”，申请号为200510063087.8的“一种药物组合物及其制备方法和用途”，申请号为200510108139.9的“参麦冻干粉针及其质量控制方法”，申请号为200510108140.1的“一种参麦葡萄糖注射液”，申请号为200710121028.0的“一种用于治疗心血管疾病的组合物及及其制备方法”的发明专利中，涉及到人参皂苷、麦冬皂苷，均为混合物，且均未明确混合物中单体皂苷的比例，比例合适才能起到正确的药效，比例不合适其药效可能会相反，从而造成对人体的毒副作用。这是医生、患者及其家属都不愿意看到的。

[0012] 人参皂苷、麦冬皂苷主要存在于参麦注射液，参麦注射液具有益气固脱，养阴生津，生脉的作用。用于治疗气阴两虚型之休克、冠心病、病毒性心肌炎、慢性肺心病、粒细胞减少症。能提高肿瘤病人的免疫机能，与化疗药物合用时，有一定的增效作用，并能减少化疗药物所引起的毒副反应。

[0013] 但是参麦注射液的化学成分十分复杂，目前已知并且作为质量控制指标的只有人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re，而人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、麦冬皂苷D等成分在参麦注射液中含量并不低，但在质量配比时未进行控制，并且因红参、麦冬药材的个体差异及各厂家制备工艺的不同导致不同批次参麦注射液中人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、麦冬皂苷D含量均有不同程度的差异和比例的不同，正是因为人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、麦冬皂苷D的含量而造成的差异，其药效稳定性不高，这就增加了临床使用时患者发生不良反应的危险，且不良反应发生率在逐年上升。

[0014] 另外，人体对药物的依赖性渐渐明显，在某一个体使用一种药物时，其使用量是在不断的增加和扩大的，而药物组分中各成分的比例稳定性就至关重要。如何确定稳定的组分比例参数，从而带来的安全性问题就显得越来越重要。

发明内容

[0015] 本发明正是为了解决上述问题的缺陷，提供了一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷D组合物。

[0016] 本发明采用如下技术方案实现。

[0017] 一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷Ｄ组合物，该组合物的组分包含人参皂苷Rb1，人参皂苷Rg1，人参皂苷Rb2，人参皂苷Rc，人参皂苷Re，麦冬皂苷D；其所述组份的重量百分比为：人参皂苷Rb128～32%，人参皂苷Rg118～22%，人参皂苷Rb214～16%，人参皂苷Rc14～16%，人参皂苷Re8～12%，麦冬皂苷D14～16%。

[0018] 本发明的组合物含有药学上常规的载体。

[0019] 本发明的人参皂苷Rbl、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、来源于生药红参、人参、西洋参、半合成的人参皂苷，麦冬皂苷D来源于生药川麦冬、半合成的麦冬皂苷D，可以从市场上购得，纯度要求为85%～99.9%。

[0020] 本发明涉及到的一种治疗心脑血管疾病的人参皂苷、麦冬皂苷Ｄ组合物，可加入药学上常规的载体，制备成各种常规的制剂。所述制剂可以是注射液、注射用粉针剂、片剂、散剂、颗粒剂、胶囊剂、滴丸剂等制剂。

[0021] 本发明的优点在于，本发明克服了现有技术的不足，提供了一种组分固定、科学、质量可控、稳定且药效显著的人参皂苷、麦冬皂苷Ｄ组合物。本发明单体人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、麦冬皂苷D特定比例组合后，在抗（心肌、脑、肺）缺血再灌注损伤、抗血栓、抗动脉硬化、抗心律失常等方面药效与参麦注射液相当或略好，在急性毒性、异常毒性、溶血与凝聚等安全性方面比参麦注射液更安全。现有参麦注射液中的成分不清楚，质量不易控制，药效稳定性不高，而本发明的成分清楚固定，质量更稳定、可控，这就大大提高其安全性和有效性。再者，本申请在与其他化疗药物合用时，增效作用较现有技术更加明显，患者在较短的时间内可以得到治疗并康复。具体实施方案

[0022] 下面结合具体实施方式对本发明做进一步解释。

[0023] 人参皂苷、麦冬皂苷D的制备

[0024] 取红参薄片（1～2mm），加5倍75%乙醇回流提取3次，每次2小时，收集提取液，过滤，取滤液减压回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0.5g生药的溶液，上大孔树脂柱（D类大孔树脂，树脂床高与直径比约为20），分别用水、20%、40%、60%、80%的乙醇液进行梯度洗脱，经TLC鉴别，分别合并含单一目标化合物（人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc）多的组份，蒸干，再加适量95%乙醇溶解，上中性氧化铝柱（样品与氧化铝重量比为1：60），分别用浓度为95%～50%乙醇液进行梯度洗脱，收集洗脱液进行TLC鉴别，合并含单一斑点部分，蒸干，即得纯度为85%～99.9%的人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc。

[0025] 取麦冬，加5倍75%乙醇回流提取2次，每次2小时，收集提取液，过滤，取滤液减压回收乙醇至无醇味，加水制成每lml含0.5g生药的溶液，上大孔树脂柱（D类大孔树脂，树脂床高与直径比约为20），分别用水、30%、80%的乙醇液进行梯度洗脱，收集30%～80%的乙醇液洗脱的组份，蒸干，再加适量95%乙醇溶解，上中性氧化铝柱（样品与氧化铝重量比为1：60），分别用浓度为95%～60%乙醇液进行梯度洗脱，收集洗脱液进行TLC鉴别，合并含麦冬皂苷D的部分，蒸干。再经反相硅胶柱进行分离，以甲醇-水（20：80～50：50）进行梯度洗脱，收集洗脱液进行TLC鉴别，合并含单一斑点部分，蒸干，即得纯度为85%～99.9%的麦冬皂苷D。

[0026] 人参皂苷、麦冬皂苷Ｄ的检测

[0027] 人参皂苷照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定。

[0028] 色谱条件与系统适用性试验固定相采用Waters symmetry shieldTM RP18色谱柱（4.6mm×250mm；5.0μm）；柱温30℃，以乙腈为流动相A，以水为流动相B，按下表进行梯度洗脱；检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于1350000。

[0029]

[0030]

[0031] 对照品溶液的制备取人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc和人参皂苷Re对照品适量，精密称定，加80％乙腈制成每1ml分别含0.15mg、0.10mg、0.05、0.06、0.07和0.05mg的混合溶液，即得。

[0032] 测定法分别精密吸取对照品溶液与供试品各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0033] 麦冬皂苷D照高效液相色谱法（中国药典2010年版一部附录VI D）测定。

[0034] 色谱条件与系统适用性试验UItimate XB-C18色谱柱（4.6mm×250mm；5-Micron）；

[0035] 柱温30℃，流速1.0ml/min，进样量20μl；检测器：检测器（Altech ELSD2000ES），气体流量2.5L/min，漂逸管温度95℃；流动相为水：乙腈(48：52)。理论板数按麦冬皂苷D峰计算应不低于3000。

[0036] 对照品溶液的制备分别精密称取麦冬皂苷D对照品适量，加甲醇溶解，制成浓度为麦冬皂苷D0.5mg/ml对照品溶液。

[0037] 测定法分别精密吸取对照品溶液10μl、20μl与供试品20μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

[0038] 实施例1制备本发明所述组合物的注射液

[0039] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb199.6%，人参皂苷Rg199.5%，人参皂苷Rb299.0%，人参皂苷Rc99.2%，人参皂苷Re99.3%，麦冬皂苷D99.4%。

[0040] 人参皂苷Rb132%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D14%，加适量注射用水溶解，超滤，灌封，制成注射液。

[0041] 实施例2制备本发明所述组合物的注射液

[0042] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb191.3%，人参皂苷Rg192.1%，人参皂苷Rb290.0%，人参皂苷Rc91.5%，人参皂苷Re90.8%，麦冬皂苷D91.4%。

[0043] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg120%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re10%，麦冬皂苷D14%，加适量注射用水溶解，再加入适量活性炭，滤过，灌封，制成注射液。

[0044] 实施例3制备本发明所述组合物的冻干粉针

[0045] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb185.6%，人参皂苷Rg186.2%，人参皂苷Rb285.1%，人参皂苷Rc85.8%，人参皂苷Re85.3%，麦冬皂苷D86.0%。

[0046] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg122%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D14%，加适量注射用水溶解，滤过，灌封，制成冻干粉针。

[0047] 实施例4制备本发明所述组合物的片剂

[0048] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb192.3%，人参皂苷Rg192.8%，人参皂苷Rb292.1%，人参皂苷Rc92.5%，人参皂苷Re92.9%，麦冬皂苷D92.4%。

[0049] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re12%，麦冬皂苷D14%，按常规方法制备成片剂。

[0050] 实施例5制备本发明所述组合物的颗粒剂

[0051] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb198.5%，人参皂苷Rg198.4%，人参皂苷Rb298.3%，人参皂苷Rc98.7%，人参皂苷Re98.2%，麦冬皂苷D98.1%。

[0052] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb216%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D16%，按常规方法制备成颗粒剂。

[0053] 实施例6制备本发明所述组合物的胶囊剂

[0054] 人按上述步骤制备的样品，再按上述的的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb188.9%，人参皂苷Rg188.7%，人参皂苷Rb288.3%，人参皂苷Rc88.2%，人参皂苷Re88.6%，麦冬皂苷D88.5%。

[0055] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc16%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D16%，按常规方法制备成胶囊剂。

[0056] 实施例7制备本发明所述组合物的滴丸剂

[0057] 按上述步骤制备的样品，再按上述的的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb194.3%，人参皂苷Rg194.8%，人参皂苷Rb294.1%，人参皂苷Rc94.7%，人参皂苷Re94.5%，麦冬皂苷D94.2%。

[0058] 人参皂苷Rb130%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D16%，按常规方法制备成滴丸剂。

[0059] 实施例8制备本发明所述组合物的片剂

[0060] 按上述步骤制备的样品，再按上述的的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb198.7%，人参皂苷Rg198.4%，人参皂苷Rb296.4%，人参皂苷Rc97.6%，人参皂苷Re95.5%，麦冬皂苷D94.8%。

[0061] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb215%，人参皂苷Rc15%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D16%，按常规方法制备成滴丸剂。

[0062] 实施例9制备本发明所述组合物的胶囊剂

[0063] 按上述步骤制备的样品，再按上述的的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb199.4%，人参皂苷Rg195.8%，人参皂苷Rb290.6%，人参皂苷Rc96.8%，人参皂苷Re94.4%，麦冬皂苷D94.6%。

[0064] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb215%，人参皂苷Rc16%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D15%，按常规方法制备成滴丸剂。

[0065] 实施例10制备本发明所述组合物的滴丸剂

[0066] 按上述步骤制备的样品，再按上述的的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb193.8%，人参皂苷Rg196.8%，人参皂苷Rb293.6%，人参皂苷Rc94.8%，人参皂苷Re95.5%，麦冬皂苷D94.6%。

[0067] 人参皂苷Rb128%，人参皂苷Rg118%，人参皂苷Rb216%，人参皂苷Rc15%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D15%，按常规方法制备成滴丸剂。

[0068] 实施例11制备本发明所述组合物的注射液

[0069] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb196.6%，人参皂苷Rg194.5%，人参皂苷Rb293.0%，人参皂苷Rc91.2%，人参皂苷Re95.3%，麦冬皂苷D94.4%。

[0070] 人参皂苷Rb129%，人参皂苷Rg121%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D14%，加适量注射用水溶解，超滤，灌封，制成注射液。

[0071] 实施例12制备本发明所述组合物的冻干粉针

[0072] 按上述步骤制备的样品，再按上述的方法进行检测，纯度分别为人参皂苷Rb193.6%，人参皂苷Rg197.5%，人参皂苷Rb294.0%，人参皂苷Rc93.2%，人参皂苷Re96.3%，麦冬皂苷D97.4%。

[0073] 人参皂苷Rb131%，人参皂苷Rg119%，人参皂苷Rb214%，人参皂苷Rc14%，人参皂苷Re8%，麦冬皂苷D14%，加适量注射用水溶解，超滤，灌封，制成注射液。

[0074] 本发明所述组合物对大鼠心肌缺血再灌注损伤影响实验

[0075] 1、试验材料

[0076] 1.1药物：本发明实施例1制备的注射液，实施例2制备的注射液，实施例3制备的粉针剂，参麦注射液，10ml/支，由大理药业股份有限公司生产，批号：1203242。

[0077] 1.2试验动物：SD大鼠，普通级，昆明医学院实验动物室提供（使用许可证号：SYXK（滇）2010-0008）。

[0078] 1.3主要试剂：氯化硝基氯化硝基四氮唑蓝（N-BT）试剂，上海前进试剂厂；SOD、MOD试剂盒，南京建成生物工程研究所；LDH、CK试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；TNF-a、ICAM-1酶联免疫试剂盒，北京天象一邦定医学联合体公司。

[0079] 1.4主要仪器：PowerVision6001检测系统，PowerVision公司产品；电动呼吸机（MODEL CS-3），上海医疗设备厂；酶标仪（RT-6000），美国雷杜公司；多媒体彩色病理图像分析系统（HPIAS-1000型），北京空海公司；紫外分光光度计（TU-1800SPC），北京普析通用仪器有限责任公司；全自动生化仪（BIOSYSTEMS A25），成都贝斯达仪器有限公司；分析天平（CPA225D），赛多利斯。

[0080] 2、实验方法

[0081] 2.1大鼠在体缺血再灌注损伤模型的建立、分组、给药剂量

[0082] 健康SD大鼠（180～240g），10%乌拉坦麻醉，开胸，气管插管，连接电动呼吸机(吸呼比1:2，呼吸频率30次/min，气道压力3kPa)，左冠状动脉前降支根部穿结扎线，平衡10分钟后，除正常对照组外结扎冠状动脉造成缺血，结扎后即刻十二指肠给药。结扎40min形成缺血模型，之后放开结扎线复灌2h形成再灌损伤模型。

[0083] 实验为10组:正常组，模型组，本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组，每组15只(5只用于N-BT染色及血清中SOD、MDA含量测定；5只用于血清LDH、CK测定；5只用于血清中TNF-a、ICAM-1含量测定。十二指肠给药，正常及模型组给生理盐水，本发明实施例1制备的注射液、施例4制备的注射液、实施例3制备的粉针剂（加生理盐水稀释成每ml含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、麦冬皂苷D分别为0.1、0.35、0.3、0.03、0.2、0.02mg）、参麦注射液组高、低剂量分别给12ml/kg、6ml/kg。

[0084] 2.2心肌缺血梗死范围的测定

[0085] 大鼠缺血40min，复灌2h后摘取心脏，生理盐水冲洗干净，均匀切成5片，称重，N-BT染色，图像分析仪计算心肌梗塞面积，心肌梗塞重量，梗塞区/心室(心脏)面积百分率。

[0086] 2.3血清中SOD、MDA、LDH、CK的含量测定

[0087] 再灌2小时后腹主动脉取血，自然分离血清，-20℃保存。具体步聚按试剂盒说明书进行，可见分光光度计检测样品SOD、MDA的OD值，计算活性及含量；全自动生化仪检测CK、LDH。

[0088] 2.4血清中TNF-a、ICAM-1含量测定

[0089] 双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中TNF-a、ICAM-1含量。取TNF-a、ICAM-1定量EIA试剂盒，设标准孔8孔，每孔各加入样品稀释液100ul，第一孔加标准品100ul，混匀后用加样器吸出100ul，移至第二孔。如此反复作对倍稀释至第7孔，并从第7孔中及出100ul弃去，第八孔为空白对照孔。待测孔中每孔各加入血清样品100ul，将反应板充分混匀后置37℃，120min，洗涤液充分洗涤4-6次，滤纸印干，每孔中加入第一抗体工作液50ul，混匀后置37℃，60min洗板，每孔加酶标工作液100ul，37℃，60min洗板，每孔加入显色液100ul，37℃，5-10min，每孔加入1滴终止液混匀，酶标仪492nm处测OD值，以标准品1000、500、250、125、62.5、32、16、0PG/ml之OD值在半对数纸上作图，画出标准曲线。根据样品OD值在该曲线图上求算样品中TNF-a、ICAM-1浓度。

[0090] 2.5心肌组织病理学观察

[0091] 再灌2小时后摘取心脏，冰生理盐水冲净血液，结扎线下3mm处取2mm厚心肌，液氮冷冻，-20℃冰冻切片，片厚8μm，各样本均做HE染色，观察心肌组织病理改变。

[0092] 3、统计处理

[0093] 数值采用均值士标准差表示( )，SPSS11.5统计软件作noe-way ANOVA分析。

[0094] 4、结果及结论

[0095] 4.1对缺血再灌注损伤心肌梗死范围的影响

[0096] N-BT染色后，正常心肌呈暗蓝色，梗塞区心肌不着色。缺血再灌注模型组梗塞严重，各给药组能明显缩小梗死面积、减轻梗死区重量、降低梗死区/心室(心脏)百分率，与模型组相比差异具统计学意义(p＜0.05)，结果见表1。

[0097] 表1缺血再灌注损伤心肌梗死范围的影响(错误！未定义书签。 n=5)

[0098]

[0099]

[0100] 注:与模型组相比*P＜0.05，**P＜0.01

[0101] 缺血再灌注后，心肌梗死面积、梗死区重量增加，梗死区/心室(心脏)百分率增加；本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组能明显缩小梗死面积、减轻梗死区重量，降低梗死区/心室（心脏)百分率，与模型组相比差异具统计学意义(p＜0.05)。

[0102] 4.2对血清中SOD、MDA的影响

[0103] 正常组血清中SOD活性较高(459.6土14.0)U/ml、MDA(2.9士0.8)nmol/ml含量低，缺血再灌后SOD活性显著降低为(369.2士25.1)U/ml、MDA增高到(6.4土1.2)nmol/ml。

[0104] 给予本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量后，血清中SOD、MDA发生变化，与模型组相比差异具统计学意义(p＜0.05)，结果见表2。

[0105] 表2大鼠心肌缺血再灌注对血清SOD和MDA的影响( n=5)

[0106]

[0107] 注:与模型组相比*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

[0108] 再灌注损伤模型血清中SOD活性降低、MAD含量升高；本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组能增高血清中SOD活性、降低MDA含量，与模型组相比差异具统计学意义(p＜0.05)。

[0109] 4.3对血清中LDH、CK的影响

[0110] 正常组血清中LDH、CK值为(546.4士151.7)U/L、(638.4士139.5)U/L，缺血再灌后增高到(3831.3士1496.0)U/L、(6754.3士2086.2)U/L。各药处理后血清中LHD、KC含量降低，本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组与模型组相比差异具意义(p＜0.05)，结果见表3。

[0111] 表3大鼠心肌缺血再灌注对血清LDH和CK的影响( n=5)

[0112]

[0113] 注:与模型组相比*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

[0114] 再灌注损伤模型血清中KC、LHD血清增加；本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组能抑制KC及LHD的释放，与模型组相比差异具统计学意义(p＜0.05)。

[0115] 4.4对血清中TNF-a、cIAM-1含量的影响

[0116] 缺血再灌注损伤后血清TNF-a、ICAM-1分别由正常组(62.810士1.890)GP/ml、(46.901士0.418)PG/ml升高到(70.022士3.088)PG/ml、(50.280士1.035)PG/ml，差异具统计学意义(P<0.05)；本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组能显著抑制TNF-a、CIAM-1的过量分泌，与模型组相比差异有统计学意义(P<0.05)，结果见表4。

[0117] 表4对心肌缺血再灌注损伤血清TNF-a、IAcM-1含量的影响(错误！未定义书签。n=5)

[0118]

[0119] 注:与模型组相比*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001

[0120] 再灌注损伤模型血清中TNF-a及CIAM-1升高；本发明实施例1制备的注射液、实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂、参麦注射液高低剂量组能显著抑制TNF-a，IcAM-1的过量分泌，与模型组相比差异有统计学意义(p＜0.05)。

[0121] 4.5对心肌组织病理改变的影响

[0122] HE染色光镜观察，正常心肌细胞排列整齐，着色均匀，胞膜完整，无变性坏死，缺血再灌注损伤后心肌细胞排列紊乱，着色不均，部分心肌细胞浊肿、心肌纤维横纹不清或消失，核裂解消失;SSTG方处理后心肌细胞排列较模型组整齐、心肌纤维模纹较清，着色相对均匀，水肿减轻，变性坏死范围较小。

[0123] HE染色光镜观察，造模后各组大鼠梗死区心肌细胞排列紊乱，着色不均匀，部分区域心肌细胞浊肿，心肌纤维横纹不清或消失，核裂解消失，SSTG处理后梗死区心肌细胞变性与坏死改变较轻，着色相对均匀，水肿变性减轻，心肌坏死范围较小。

[0124] 本发明药物与参麦注射制剂毒性比较研究

[0125] 依（中国药典2010年版一部附录XVIII B异常毒性检查法）及参照急性毒性试验法对本发明及参麦注射剂进行毒性试验比较。

[0126] 表5急性毒性试验结果（LD50）

[0127]

[0128] 对照上面两项试验结果，发现本发明产品在毒性和异常毒性两方面，出乎意料的有改善，使得产品的安全性得到明显的保障，发明目的得以实现。

[0129] 本发明药物与参麦注射溶血试验比较研究

[0130] 依（中国药典2010年版一部附录XVIII B溶血与凝聚检查法）的试验方法进行溶血试验，观察本发明药物及参麦注射液在不同浓度下的溶血与凝聚情况。

[0131] 1、试验材料

[0132] 1.1药物：本发明实施例1制备的注射液，实施例2制备的注射液、实施例3制备的粉针剂，参麦注射液10ml/支，由大理药业股份有限公司生产，批号：1203242。

[0133] 2%红细胞混悬液的制备：取兔血20～30ml，除去纤维蛋白原，加氯化钠注射液约10倍量洗涤，1500r/min离心15min，弃上清液，重复2～3次，直至上清液不显红色为止，弃上清液，将所得红细胞用氯化钠注射液配制2%红细胞混悬液，供试验用。

[0134] 受试药物的制备：精密称取本发明实施例3制备的粉针剂，加生理盐水稀释成每ml含人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rc、人参皂苷Re、麦冬皂苷D分别为0.1、0.35、0.3、0.03、0.2、0.02mg。

[0135] 2、检验方法：

[0136] 分别取试管7支，其中1～5号管为受试药物管，6号管为阴性对照管（只有2%红细胞混悬液和氯化钠注射液），7号管为阳性对照管（只有2%红细胞混悬液和蒸馏水）。按下表所示加入2％红细胞悬液、氯化钠注射液、蒸馏水，混匀后立即置于37℃±0.5℃的恒温水箱中进行温育。开始每隔15分钟观察一次，1h后间隔1小时观察一次，连续24小时。

[0137] 表7本发明药物及参麦注射液样品溶血与凝聚观察试验

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