除去抗A、抗B抗体以及多反应性免疫球蛋白IgG的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物

摘要

本发明涉及一种用于治疗的免疫球蛋白浓缩物，其中在体外间接Coombs实验中抗-A和抗B抗体的各自含量为阴性结果。该IgG浓缩物的多反应性IgG含量相对于IgG总量为在0.01%-0.1%之间，尤其是在0.07-0.1%。

权利要求

1.治疗用免疫球蛋白G浓缩物，其特征在于抗A和抗B抗体的各自含量符合体外间接Coombs测试的阴性结果，其中，对肌凝蛋白和白蛋白表现多反应性的IgGs的含量相对于总IgG含量减少了,所述白蛋白是被二硝基苯基修饰的DNP白蛋白，其中免疫球蛋白浓缩物是通过包含以下步骤的方法获得的：a)通过乙醇分馏法和/或层析分离制备IgG浓缩物，联合病毒灭活步骤，b)通过介质载体的混合物对所述IgG浓缩物渗滤，以进行免疫亲和层析，该介质载体的基质接枝有与血型A的抗原决定基相对应的N-乙酰半乳糖胺-半乳糖-岩藻糖和与血型B的抗原决定基相对应的半乳糖-半乳糖-岩藻糖基团，并c)过滤以除去病毒和/或超过20nm大小的颗粒。

2.根据权利要求1的免疫球蛋白G浓缩物，其具有抗A抗体的含量不超过23ng/mg IgG，抗B抗体的含量不超过20ng/mg IgG。

3.根据权利要求1或2的浓缩物，包含使得所述浓缩物可以贮存的稳定剂。

4.根据权利要求3的浓缩物，其中稳定剂是糖醇，甘氨酸和非离子型去污剂的混合物。

5.根据权利要求4的浓缩物，其中糖醇是甘露糖醇或山梨糖醇。

6.根据权利要求1的浓缩物，可经由静脉途径注射。

说明书

除去抗A、抗B抗体以及多反应性免疫球蛋白IgG的免疫球蛋白

G(IgG)浓缩物

技术领域

[0001] 本发明涉及除去抗A(AcaA)和抗B(AcaB)抗体的免疫球蛋白G(IgG)浓缩物，其具有明显降低的多反应性，以及涉及获得上述浓缩物的方法。

背景技术

[0002] 自从Cohn研制出乙醇沉淀法，富集免疫球蛋白(Ig)成分的人血浆用于各种感染或者先天性缺陷疾病的治疗(Cohn等,1946,J.Am.Chem.Soc.68,459；Oncley等,1949,J.Am Chem.Soc.71,541).

[0003] 对用于静脉注射(IgIV)的高纯化Ig复合结构的需求越来越多，例如从人血浆中获得。免疫球蛋白的络合物结构(由二硫键连接的四肽链)，以及来自于数千供血者的血浆混合物中存在着的各种抗体，成为目前不能够促进免疫球蛋白生物技术发展的因素。虽然通过基因工程生产单克隆抗体，它们的极端特异性对治疗应用相当于一个缺点，在治疗应用中多种特异性显得是必需的。

[0004] 另一方面，例如，在近些年来的欧洲和美国，例如源自身免疫的许多病理，目前用IgG浓缩物治疗会导致它的一个缺陷。

[0005] 获得免疫球蛋白尤其是IgG浓缩物的方法，除了用乙醇使蛋白选择性沉淀，也可以包含其它各种方法，例如聚乙二醇沉淀法，受控蛋白水解酶法处理……用于除去免疫球蛋白聚合物中的聚集体，这些局集体可以激活与过敏反应危险相关的补充系统。同时，在体内存在于IgGIV中的二聚体和动脉压下降相关(Bleeker W.K.等,Blood,95,2000,p.1856-1861).

[0006] Steinbuch等已描述了一种可选择的方法是乙醇沉淀法(Rev. Et.Clin.et Biol.1969,XIV,1054)，其依赖于辛酸沉淀。这种酸沉淀了绝大多数的血浆蛋白，并把免疫球蛋白留在上层清液中。通过阴离子交换剂DEAE纤维素来提纯这些免疫球蛋白，提纯的条件是该阴离子交换剂不保留IgG。接着对非保留IgG的成分进行浓缩。

[0007] 同时使用色谱技术已经研发了各种方法增加产品的纯度。特别提及是的专利申请EP 0 703 922和WO 99/64462，其为至少两个相关联的连续色谱分析步骤，一个使用阴离子交换，另一个使用阳离子交换。这些方法的特异性在于该阴离子交换剂的性能，在传统的色谱分析条件下不会阻留免疫球蛋白G，但是它们反而在预提纯步骤中固定共纯化大多数其它蛋白。也可以引用由申请人提交的类似专利申请WO 02/092632，其公开了在阴离子交换剂上，在碱性pH下使用单个色谱分析步骤制备Ig浓缩物，在色谱分离介质上将它们固定。

[0008] 然而，许多科学刊物指出通过上述分馏技术获得的IgG的注射会导致接受治疗的患者偶尔会出现溶血现象，有时还很严重。例如，可以引用以下文献：Buchta C等,Biologicals,33,2005,41-48,Wilson J.R.等,Muscle&Nerve,29(9),1997,1142-1145,Copelan E.A.等,Transfusion,26,1986,410-412and Misbah S.A.等,Drug Safety,9,1993,254-262.对患有溶血的病人血液影响的研究，尤其是使用直接抗人球蛋白试验(直接抗人球蛋白试验-DCT)进行的研究，显示红细胞表面被直接抑制抗原A、B或者D的免疫球蛋白覆盖，因此导致溶血。这就是为什么在市场上可得到的IgG是通过选择性血浆获得的，以避免存在抗-D免疫球蛋白，或在抗体-A或抗体-B中滴定度高的其他抗体。

[0009] Buchta等引用上述文献，考虑通过不同途径使源于O和B血型供体的抗A抗体、源于O和A血型供体的抗B抗体和血浆衍生物例如IgG显著减少，这是为了使溶血的风险降到最低，当使用这些血浆衍生物治疗患者的时候，该溶血风险与这些抗体的水平直接相关。特别要正视选择供体，去除抗A和抗B抗体，生产源于特定血型(A和/或B血型)血浆的衍生物，以及排除那些具有高滴定度抗A和抗B抗体的血浆的批次。考虑到成本或提取步骤的复杂性，一些方法被认为是不现实的。应当注意在上述乙醇分馏期间，部分除去了抗A和抗B抗体。

[0010] 由于对IgG的需求不断地增加，也就需要逐渐增大的供者库，统计学上将包括更多的O型血的供者。因此，血浆衍生物如IgG将包含大量抗A和抗B抗体，由于这些抗体的浓度太高，通过传统分馏很难去除。

[0011] 这些增加的需求使得只从AB血型中选择以确保低含量的抗A和抗B抗体成为不可能。

[0012] 在使用欧洲药典(1997)的2.6.20实验时，每批纯化的IgG浓缩物或制备受抗A和抗B抗体限制，该实验是间接Coombs测试(间接Coombs测试-ICT)的体外应用。ICT测试包括加入红细胞悬液，涂以包含于IgG浓缩物的IgG型抗A和抗B抗体，IgG浓缩物是一种针对人IgG的抗体(抗球蛋白)溶液。与抗A和抗B抗体结合的这些抗体附着于红细胞，因此导致通过IgG之间桥结构形成凝集。抗A和抗B抗体的含量检测受到了血液血清试验(Coombs试验)中常规试验直接启发。

[0013] 依照欧洲药典，在稀释比为1:64、IgG溶液的起始浓度减少至30g/l进行的ICT测试条件下，IgIV不能显示A或B型红细胞的任何凝集。

[0014] 这就是被测试的IgG样品必须稀释以达到滴定度的原因，即最后稀释数值不再引起凝集反应。依据欧洲药典，IgIV溶液的阴性ICT结果为低于1:64稀释度，该结果表明抗A和抗B抗体的低含量是可接受的。然而，欧洲药典规定，即使IgG浓缩物在实验中得到阴性结果，即其稀释度低于1:64，仍不能够排除溶血反应的危险(Buchta等，如上所引)。

[0015] 应指出美国和日本的药典没有对需要控制抗A和抗B抗体剩余含量进行规定。

[0016] 如上所述，用乙醇分馏法在制备IgG浓缩物期间抗A和抗B抗体被部分除去，然而，其剩余含量可能超过了欧洲药典规定的上限。另外，依据申请人在其专利申请WO 02/092632中描述研究的方法制备的浓缩物的抗A和抗B抗体剩余含量比通过乙醇分馏法制备的浓缩物的剩余含量含量更高。由于一些批次的IgG浓缩物的抗A和抗B抗体的含量超过了欧洲药典限定值，因此需要对IgG浓缩物进行额外的纯化。

[0017] 一种除去IgG浓缩物中抗体的方法，其包括使用免疫吸附剂作为基质，用亲和色谱法纯化类似于A和B血型抗原的低聚糖，所述的低聚糖具体的是接枝在色谱基质上的三糖。

[0018] 例如，由Mazid M.A.等,J.Appl.Biomater.,3(1),1992,9-15出版的刊物，提及使用含有二氧化硅颗粒的色析法介质，其表面接枝了合成低聚糖的半抗原，其特征为A和B型血，尤其是A型-三糖。此外，Hout M.S.等(ASAIO J,46(6),2000,702-706)描述了用特定的抗A和抗B抗原接枝的管状纤维膜除去全血中的抗A和抗B抗体。也有报告指出，色析法介质性质非常稳定，这限制了所关注浓缩物中的残留半抗原的释放。

[0019] 专利申请WO 01/27623描述了一种获得A和B血型中去特异性抗体血浆的方法，即一种适合于任意接受者的血浆。这些特异性抗体实质上是免疫球蛋白M(IgM)所携带的。去特异性的获得包括先通过与A血型试验性亲和性高的介质，然后通过与B血型试验性亲和性高的介质。如果同时出现抗A和抗B(O型血)，则有必要连续通过两种介质载体。

[0020] 市场购买IgG浓缩物的一个其它特征是它们的多反应性。应想起多克隆抗体如IgG通常与单个抗原决定基(抗原基序)以独特的方式结合。然而，这种抗体严格特异性有时候可以延伸至其它抗原基序，然而，与第二抗原表位的亲和性比与名义上的基序的亲和性要弱。多克隆IgG可以对具有如肌动蛋白、肌球蛋白、三硝基苯基修饰白蛋白的结构作出更大或更少程度的反应。

[0021] 在这一方面，通过多克隆人类IgG制备静脉注射用的免疫球蛋白(IgIV)，其包括：

[0022] -直接抑制外部抗原和由免疫过程产生的免疫抗体；

[0023] -识别细胞内的蛋白、表面膜抗原、自身循环蛋白和其它抗体可变区的天然抗体。后者则称为抗个体型抗体(Kazatchkine M.D.等,Immunol.Rev.,139,1994,79-107).[0024] 天然抗体不是由目的性免疫法导致的(Coutinho A.等,Curr.Opin.Immunol.,7,
1995,812-818)。由于表现出对自体抗原不同的亲合性，因此具有多反应性(Berneman A.等,Eur.J.Immunol.,22,1992,625-631 and Lacroix-Desmazes等,J.Immunol.Methods,
216,1988,117-137)。

[0025] IgIV的化学处理(6M尿素、1.3M硫氰酸钠和酸处理pH＝2.0)可以增加这些多克隆免疫球蛋白多反应性活性(Bouvet J.P.et al,J.Autoimmun.,16(2),2001,163-172)。然而，用所述的免疫球蛋白治疗患者不曾证明其有益的效果。

[0026] 总之，在制备IgIV过程中抗体的多反应性活性归结如下：

[0027] -在各自血浆中存在天然抗体，

[0028] -在各自血浆中存在抗个体型抗体，

[0029] -制备方法产生的抗体的多反应性。

[0030] 因此，一些学者认为多反应性是IgG内在特性，因此天生存在于人体内。

[0031] 另一些学者证明了纯化单克隆或多克隆IgG能够显示其纯化前未检测出的多反应性。甚至从血浆中制备IgG的方法也会产生多反应性，其转变为氧化性“应激”和在制备过程中IgG的部分羟基化作用。

[0032] 这被Bouvet J.P等证实，Journal of Autoimmunity，16,2001,pp.163-172，他特别用尿素来处理多克隆IgG而使其变得更高的多反应性，在该文件中，也指出了临床应用中IgG的部分疗效归因于它们的多反应性。

[0033] 因此可以通过天然多反应性IgG和常规提纯法获得的多反应性IgG说明这些IgG浓缩物多反应性，这占所有多价IgG的0.5％-1％。使用IgG制剂来治疗患者可能需要最多至1-2g/kg的高剂量给药。这些剂量为短期治疗，例如，一天7-10倍患者生理IgG量。结果，通过IgG浓缩物生产方法产生的多反应性IgG的给药水平可导致不良副作用如发烧、恶心或头疼。

[0034] 因此，必需进行天然抗体多反应性和抗个体型抗体的区分，如申请人在其专利申请EP 1 059 088中所示，通过制备方法产生的抗体具有优点。申请人在其专利申请EP 1 059 088已显示在血浆中含天然多反应性IgG的成分，是从人多价IgIV分离出来，由于需要更小剂量的成分，在治疗特定炎性疾病如类风湿性多发性关节炎上有优势。

[0035] 因此，为了避免红细胞溶血反应和在治疗过程中给予大剂量的IgG而产生的相关副作用，看起来需要使用用于治疗的特别用于静脉注射的显著去除抗A和抗B抗体的IgG浓缩物，与市售IgG浓缩物相比，优选大幅度降低生产方法产生的多反应性，同时应具有相对于免疫疗法至少相同的功效。

发明内容

[0036] 因此，本发明涉及用于治疗用途的免疫球蛋白G浓缩物，其特征在于抗A和抗B抗体的各自含量在体外间接Coombs实验结果为阴性。

[0037] 本发明也涉及制备免疫球蛋白G的方法，通过该方法有可能不产生多反应性抗体，这些多反应性抗体与天然和抗个体型抗体相比更不太好耐受。因此，通过该方法获得的IgIV比其它试验的IgIV有着更低的多反应性。

[0038] 本发明这些浓缩物的IgG优选从已富集IgG的血浆或血浆成分中获得多克隆IgG。治疗用途的IgG浓缩物具有的IgG浓度为目前经常使用的浓度，优选在50和100g/l之间。这些浓缩物将用于临床使用，特别是可由静脉途径注射。为此，它们必需对病毒安全，可以任意含有赋形剂，如符合临床使用的稳定剂。

[0039] 本申请人已发现可以提供所述IgG浓缩物，其含有抗A和抗B抗体含量大大低于标准IgG浓缩物中的含量，标准IgG浓缩物即通过乙醇分馏法和/或使用色谱分析相关纯化技术获得的浓缩物，如上所述，并不考虑经过附加处理以以除去抗体的浓缩物。此外它们的含量远低于欧洲药典接受的下限，其很显著地限制了一些接受治疗患者溶血的风险。当本发明的IgG浓缩物进行试验以评估抗A和抗B抗体数量时，可以观察到抗人类IgG抗体存在的情况下，A，B和/或AB型体外红细胞凝集试验结果显示为系统阴性，特别是在欧洲药典方法规定的起始浓度30g/l条件下。因此用本发明的IgG浓缩物，甚至使用同样即非稀释的IgG样品进行前面定义的间接Coombs实验得到系统阴性结果。因此表明在这些浓缩物中抗A和抗B抗体的含量通过ICT实验已经检测不到。

[0040] 假如在IgG浓缩物中抗A和抗B抗体的水平非常低，那么IAT实验就不能再使用，甚至在欧洲药典规定的条件下也不能使用，这是因为不再发生红细胞凝集反应了，甚至在加入抗人类IgG抗体的条件下也不再发生，这是由于抗A和抗B抗体的稠密度太小以至于不允许红细胞之间通过固定到红细胞和抗人类IgG抗体的抗A和抗B抗体的结合形成桥结构。

[0041] 然而有可能检验到这些抗A和/或抗B抗体以非常低浓度存在，这是通过引起固定这些抗体的红细胞的免疫性溶血，以及通过对与传统浓缩物相比较的消耗的测定来检验，该传统浓缩物未经过除去抗A和抗B抗体处理。免疫性溶血是种特殊的免疫反应，其发生在抗体附着于补体因子出现的靶。补体活动的活化引起穿孔蛋白的释放，其会穿透红细胞膜让血红蛋白逸出。那需要敏感的方法如利用放射性示踪剂(参见下文)来测量释放血红蛋白量，正比于存在的抗A和抗B抗体量。

[0042] 本申请人已用特别方便的方法证明本发明的IgG浓缩物含抗A抗体不超过23ng/mg，特别是在19和23ng/mg之间，含抗B抗体不超过20ng/mg，特别是在12和20ng/mg之间。

[0043] 有利地，本申请人发现也可提供具有极低含量的多反应性IgG的所述IgG浓缩物，特别是通过制备方法产生的IgG浓缩物，从而赋予该浓缩物接近非多反应性特性，该浓缩物与现有技术中的IgG浓缩物一样对于免疫疗法的治疗有效。生产方法所导致的多反应活性的IgG的显著减少，使得在需要高剂量浓缩物的治疗后发生副作用的危险降低。

[0044] 另外，有利的方面是有可能改善副作用，该副作用是由制备方法而产生的IgG浓缩物中的多反应性IgG的存在所引起的，多反应性IgG的存在尤其是在纯化法过程中氧化“应激”和羟基化作用所产生。

[0045] 多反应性IgG残留含量优选包含在0.01％和0.1％之间，尤其在0.07和0.1％之间。在本发明条件下，多反应性IgG含量意指摩尔或重量百分数。由申请人在专利申请1 059 
088描述的方法确定该含量。

[0046] 因此，通过有效成分中几乎不含有抗A和抗B抗体来定义本发明的IgG浓缩物，其直接针对红细胞出现的抗原决定基。

[0047] IgG浓缩物存在于合适的稳定剂中，可以为液态或冻干粉形式，也可以储存以备后用。申请人在其专利申请WO 2004/091656 A2中公开了那些有利的稳定剂，即糖醇的混合物，优选甘露醇、山梨醇或它们的异构体，甘氨酸和非离子去污剂如 80、20、 X100或 F68的混合物，所有三种化合物都是药学上可
接受的。

[0048] 申请人确定浓缩物的制剂是稳定的液态和/或冻干形式。

[0049] 浓缩物中最终甘露醇的浓度优选在30g/l和50g/l之间，去污剂的浓度在20和50ppm之间，以及甘氨酸的浓度在7g/l和10g/l之间。这些化合物的浓度表示在IgG浓缩物的最终浓度。

[0050] 所述IgG浓缩物用于治疗用途，特别如前面所示，可经静脉内途径注射。为此，本发明的IgG浓缩物在使用传统溶剂－去污剂处理方法时必需是病毒安全的，例如现有技术中公知的如使用 80/TnBP或 X100/TnBP的混合物、和/或过滤步骤以任意除去病毒和/或其他的大分子，它们可能在溶剂－去污剂杀病毒剂处理时没被除去，例如，蛋白感染素－传播海绵状脑病的重要因素。

[0051] 本发明还涉及获得例如上述IgG浓缩物的方法，其包括以下步骤：

[0052] a)通过乙醇分馏法和/或层析分离制备IgG浓缩物，联合病毒灭活步骤，[0053] b)通过介质载体的混合物对所述IgG浓缩物渗滤，以进行免疫亲和层析，该介质载体的基质用类似A和B血型抗原的低聚糖组接枝，并

[0054] c)过滤以除去病毒和/或超过20nm大小的颗粒。

[0055] 申请人发现用非凡的方法，不仅可以有利于工业销售，而且结合各种步骤可以用特殊的步骤除去抗A和抗B抗体，以制备IgG浓缩物。有可能获得本发明的用于治疗用途的IgG浓缩物，也可以优选包含多反应性IgG的含量相对于总IgG含量低于0.1％。另外，在所述的浓缩剂中，不希望含有的抗A和抗B抗体的含量低于欧洲药典实验所述的下限，甚至所述非稀释样品的ICT实验结果为阴性。

[0056] 优选的该方法的步骤a)本身是获得如前面提及的IgG浓缩物的一种方法。它涉及到由Cohn等发展的乙醇分馏法或层析分离法，在EP 0 703 922和WO 99/64462有叙述的例子。特别优先的是申请人在专利申请WO 94/29334和WO 02/092632 A1公开的方法，更具体的是在WO 02/092632 A1所描述的。在这种情况下，本发明方法的步骤a)包含通过沉淀来自血浆或来自血浆IgG富集成分的脂质污染物的预纯化，在碱性PH下进行单个阴离子交换树脂色谱分析，在一个步骤中使用PH值为4-7的合适的缓冲液选择性洗脱IgG。

[0057] 本方法的步骤a)包括病毒灭活处理，优选使用如Horowitz在专利US 4 764 369中描述的溶剂-去污剂法。明智的是在步骤a之前进行，或者如果适宜的话在随后色谱法步骤前进行，以除去这一处理化学残留物。

[0058] 收集的IgG成分已充分浓缩，然后可以通过超滤和灭菌过滤进行其它浓缩步骤。

[0059] 然后在两种介质混合物上对该浓缩物进行免疫亲和层析，该介质混合物用与A和B血型相似的抗原组接枝，优选使用载有所述介质混合物的柱子。

[0060] 色析法的介质优选包含琼脂糖型的天然交联聚合物基质，其上间隔基或偶联臂随后用低聚糖接枝，优选的是相应于A和B血型抗原决定基的三糖。特别地，使用所述相应于血型A的抗原决定基的三糖的介质获得了非常好的结果，其结构为N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)-半乳糖(Gal)-岩藻糖(Fuc)，而且那些相应于血型B的抗原决定基的具有半乳糖-半乳糖-岩藻糖结构。所述介质为非常方便的从市场购买的凝胶或树脂，其商品名是Glycorex Transplantation AS(Sweden)的GLYCOSORB

[0061] 例如，如果使用该介质，符合血型A的抗原决定基的三糖具有如下结构：

[0062]

[0063] N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)

[0064] 半乳糖(Gal)

[0065] 岩藻糖(Fuc)

[0066] 例如，如果使用该介质，符合血型B的抗原决定基的三糖具有如下结构：

[0067]

[0068] 优选的，与A血型和B血型类似的抗原接枝的介质混合物，其比例各自为25/75和75/25(v/v)之间。根据供者人口的血型分布，尽可能有效的调整两种介质载体的比例。对于通常的使用，层析柱优选装载50/50(v/v)的上述各自具体介质混合物。分析柱为15-25cm长，使用的直径可为0.5-1cm。对于中试规模的应用，能够使用的层析柱长度为40-60cm，宽度为40-60mm。在这种情况下，层析柱可能装载600ml的免疫亲和介质。

[0069] 在使用的两次循环间，所述的介质储存在1M NaOH中。使用前用水洗涤。

[0070] 免疫亲和层析柱装载IgG浓缩物，优选比例为每毫升介质0.2到4升，优选为1到2升。填装IgG成分前不需要所述介质的特异性，即通过现有技术已知的血浆分馏技术获得的任何IgG成分或浓缩物是合适的。

[0071] 浓缩物的过滤不需要洗脱机理。因此，无须考虑IgG浓缩物获得的方法，随意使用泵使其滤过层析柱。过滤允许留下抗A和抗B抗体以及多反应性IgG。优选的,然后用水洗涤柱以收集仍然停留在柱中死体积内的IgG。

[0072] 在过滤IgG浓缩物后，除去抗A和抗B抗体以及除去从制备方法中获得多反应性IgG，得到IgG成分。抗A和抗B抗体保留在色层分离介质的抗原基序上，其修饰了它们的构象。因此，制备方法中产生的多反应性IgG同时保留在这种构象变化暴露的位点上。其次保留的这些多反应性IgG亲和性比抗A和抗B抗体低得多。IgG通过后用分馏法就能够洗脱，通过使用如含有碱土金属盐的洗脱缓冲液，其浓度为0.1到0.5M，PH为3-8。

[0073] 在步骤b)之后，该方法可以包括超滤和灭菌滤过的浓缩步骤。

[0074] 色谱柱和介质然后通过如甘氨酸-HCI，PH为2.8的一种酸性溶液洗涤，以吸附留在介质的抗A和抗B抗体。介质在用水冲洗后，用1M NaOH处理。

[0075] 对高度除去抗A和抗B抗体以及多反应性IgG的IgG浓缩物进行过滤以除去耐受溶剂-去污剂处理的任何病毒和/或除去其他超过20nm的颗粒如蛋白感染素、制备步骤中产生的IgG聚合物、胶束脂多糖类、聚集的核苷酸和蛋白。优选地，所述处理是带有从100到15nm减少孔率的过滤器的纳滤，特别是安排的连续3个过滤器，依次减少的界限是100，50和20nm。

[0076] 在步骤c)之后，本方法可以包括一个补充的步骤，首先加入稳定剂以确保IgG浓缩物在储存中的稳定性，其次是冷冻干燥以阻止IgG在与之相关不同相态下的变性。优选加入药学上可接受的单一的稳定剂，达到IgG在两种储存形式下稳定的目标，两种储存形式即液态和冻干粉态的形式，以及达到保持和甚至改善这些IgG的治疗效果的目标，这在专利申请WO 2004/091656A2中描述过。

[0077] 根据其它实施方案，如专利WO 02/092632 A1所描述，其它免疫球蛋白的选择性收集也是可以的。

[0078] IgG浓缩物用超滤法任意进行随后的浓缩步骤，接着进行灭菌滤过并可以储存在瓶中，优选温度为4℃。

[0079] 如上大量的说明，本发明的IgG浓缩物中抗A和B抗体的含量比欧洲药典可接受的界限要低很多。因此，其中描述的测定方法2.6.20(1997)用在本发明的IgG浓缩物中在抗体含量非常低的水平下检测抗体被证明不够灵敏。因此，发展这些抗体测定方法是必需的，其需要比欧洲药典ICT实验结果更低的检测界限用于检测抗A和抗B抗体。

[0080] 所述测定本发明IgG浓缩物中抗A和/或B抗体方法包括以下步骤：

[0081] a)制备和标定A，B和/或O血型恒河猴的红细胞悬浮液，

[0082] b)制备单克隆抗D抗体溶液，其浓度为在生物学可接受的缓冲范围的从0到200ng/ml的浓度范围，

[0083] c)用IgG溶液样品或单克隆抗D抗体溶液接触所述红细胞，并且在预定时间内培养所获得的红细胞混合物，

[0084] d)将抗人类IgG抗体F(ab')2片段加入各个红细胞混合物中，并以荧光染料做标记，然后培养所述红细胞，

[0085] e)对在步骤d)中获得的每组红细胞混合物进行流式细胞计数，

[0086] f)测定IgG浓缩物中抗A和/或抗B抗体的含量。

[0087] 所述测定抗A抗体和抗B抗体含量的方法的一个实施方案，包括制备1％v/v的A、B和/或O型血的红细胞悬液，置于pH值在7.0-7.4之间并包含0.8-1.5重量％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，然后用本领域技术人员公知的普通流式细胞仪检测出悬液的红细胞数量，然后悬液被标定为37-43.106个红细胞/毫升的悬浮液。

[0088] 制备单克隆抗D抗体的溶液，浓度范围为0-200ng/ml缓冲液，优选PBS缓冲液的PH值在7.0-7.4之间，任意包含0.8-1.5重量％的牛血清蛋白BSA。因此各自溶液用吸收测定法来测定它的摩尔消光系数(ε)。

[0089] 然后使用pH值为7.0-7.4之间的、包含0.8-1.5重量％的BSA的PBS缓冲液，将本发明的IgG浓缩物浓度范围调节在1-5mg/ml之间，优选1mg/ml。

[0090] 将各自血型的50-100μl血细胞悬液置于微孔板的每个孔中，例如96孔微孔板，然后在血细胞悬液中注入50-100μl的IgG溶液，或者注入50-100μl的抗D抗体。

[0091] 整个溶液培养1.5h-2.5h，特别是在培养2h，通常温度处于30-40℃之间，优选37℃。

[0092] 然后优选用包含BSA的PBS缓冲液冲洗在微孔板中的各种红细胞混合物，离心；再向每个置于微孔板的微孔中的红细胞混合物中加入用荧光染料例如藻红素标记了的50-100μl F(ab'2)羊抗人IgG抗体，其存在于前面定义的PBS和BSA缓冲液。

[0093] 将整个溶液在黑暗中培养大约20-30分钟。

[0094] 然后再次冲洗因此获得的各种红细胞混合物，并使用任意合适的包含检测分析化合物荧光的设备的市售仪器进行流式细胞计数。

[0095] 给出的平均荧光强度(MFI)与单克隆抗D抗体的浓度有关，并使用Excel软件得到线性回归方程。然后对于每个样品，使用线性回归方程获得抗D抗体当量的浓度。因为测定了三批量样品，使用Excel软件确定平均浓度和计算变异系数。

[0096] 从其中可以推论本发明的IgG浓缩物中抗A和抗B抗体的含量，其方便得到以上含量。

[0097] 在这个方法中优选使用适应于该实验的流式细胞仪，该实验是使用人A型血和B型血的血红细胞，并根据具体的抗A抗体和抗B抗体成分，运用荧光标记来检测这些抗体的比例。

[0098] 所述测定方法步骤如下：

[0099] a)准备并标定A型血和B型血的红细胞悬液，

[0100] b)用稀释过的IgG溶液接触所述红细胞悬液，并用一段预定时间培养获得的混合物，

[0101] c)在用荧光剂标记过的抗IgG抗体存在下培养所述红细胞，和

[0102] d)用流式细胞计测定在步骤c)中获得的红细胞悬浮液。

[0103] 制备1％v/v的A、B和/或O型血的红细胞悬液，置于pH值在7.0-7.4之间并包含0.8-1.5重量％牛血清白蛋白(BSA)的PBS缓冲液中，然后用本领域技术人员公知的普通流式细胞仪检测出悬液的红细胞数量，然后悬液被标定为37-43.106个红细胞/毫升的悬浮液。

[0104] 将50-100μl的血红细胞悬液被放置于96孔微孔板的每个孔中，然后在悬液中注入50-100μl被稀释了的IgG溶液，该溶液通过增量稀释，从浓度为30g/l一直稀释到浓度为
0.234g/l。

[0105] 将整个液体培养1.5-2.5小时之间，特别是两个小时，温度控制在30-40℃之间，优选37℃。

[0106] 然后用包含BSA的PBS缓冲液冲洗红细胞混合物，离心后，再在每个孔中加入用荧光染料例如藻红素标记的50-100μl F(ab'2)羊抗人IgG抗体。

[0107] 整个步骤(步骤c)培养大约20-30分钟，避光。

[0108] 然后冲洗得到的悬浮液，并使用任意合适的包含检测分析化合物荧光的设备的市售仪器进行流式细胞计数。

[0109] 例如，3种IgG浓缩物的抗A和抗B抗体含量称为B1、B2和B3，和，分别用乙醇分馏按照Cohn法(引用所述)(B1)，根据专利号WO 02/092632(B2)，以及根据专利号WO 02/092632，并继之以免疫亲和层析(B3)来除去抗A和抗B抗体，如下面表1所示。

[0110] 显示的结果与样品B1中的抗A抗体和抗B抗体的控制滴度相关，样品B1中的抗体的含量任意设定为1以作为参考。

[0111] 表1

[0112]

[0113]

[0114] 该表格的结果首先显示了用Cohn法制备的IgG浓缩物(B1)中的抗A抗体和抗B抗体含量约四倍小于用WO 02/092632描述的方法制备的IgG浓缩物(B2)中的含量。此外，随后对这些IgG浓缩物用特异性免疫亲和柱进行的处理降低了抗A抗体的滴定度，其系数接近于5，抗B抗体的系数接近于7(B3)。

[0115] 可以方便地实施另外一种测定抗A抗体和抗B抗体含量的方法，包括为本领域技术人员所公知的补体体外溶解，但已经被特定设计以满足本发明的需要。

[0116] 所述测定方法包括下列步骤：

[0117] a)用合适的放射性标记物放射性标记预先计算的选自A、B、AB和O血型番木瓜酶治疗的红细胞悬浮液，

[0118] b)用预定用量IgG浓缩物的样品接触放射性标记的红细胞，

[0119] c)加入与步骤b)相同体积的血型AB的正常血清，

[0120] d)培养在步骤c)获得混合物一段预定时间，和

[0121] e)测定因此获得的培养溶液的放射性。

[0122] 用A、B、AB或O型血制备用番木瓜酶处理的红细胞的1％(v/v)悬液，然后在Malassez细胞中得到了106个红细胞。加入含51Cr(1体积/1红细胞体积)的100μCi。全部溶液培养1-2个小时，然后冲洗放射性标记过的血红细胞4-6次。

[0123] 放射性标记过的血红细胞然后和IgG浓缩物的样品接触，该IgG浓缩物浓度优选为1-3mg/ml，例如特别是在100μl体积中为1.2mg/ml每4-6.106个放射性标记过的血红细胞。

[0124] 对于在前的体积是相等的体积的，例如100μl的AB血型的常规血清然后被加到在前的混合物中以提供不同的补体因子。

[0125] 然后培养得到的反应混合物，优选时间包括3-5小时之间，特别是在4小时，温度通常包括30-40℃之间，优选37℃。

[0126] 然后反应混合物优选离心，可以用合适的市售设备来测定培养溶液的放射性。所测溶液的放射性与被处理过的红血球的溶血程度成正比，也和抗体A和抗体B的含量成正比。

[0127] 举例来说，考虑到本发明的IgG浓缩物(B3)和所有市售浓缩物中溶血水平最低的现有技术的IgG浓缩物(C1)，则所获得的A型血，B型血和AB型血的红血球的溶血程度如以下表2所示。

[0128] 表2

[0129]红血球的溶血百分比 B3 C1(现有技术)
A型血 6 13
B型血 5 11
AB型血 6 13

具体实施方式

[0130] 以下的实施例阐明了本发明的实施方案，但是并没有限定其范围。

[0131] 实施例1

[0132] 按照WO 02/092632所述的方法得到40g/l的IgG浓缩物(B2)的样品。

[0133] 长度为50cm、直径为44mm的色谱柱装载了50/50(v/v)的GLYCOSORB ABO介质混合物，该介质被移植入了相当于A型血和B型血表位的三糖，然后要预先用1200ml的水将其冲洗。

[0134] 用泵按照0.2l/ml介质的比例注入B2IgG浓缩物。一旦内容物渗透过所述圆柱体，圆柱体就会用最小体积的可注射备用水(IP)冲洗，以收集柱死体积中存在的IgG。

[0135] 除去抗体A和抗体B以及多反应性IgG，从中收集到约40g/l的B3 IgG浓缩物，然后使用超滤得到60g/l的浓缩物，在三台系列过滤器上通过纳米过滤除去病毒，并获得100、50和20nm不断降低的存留性极限。

[0136] 稳定赋形剂由甘氨酸(7g/l)、甘露醇(30g/l)和20ppm的吐温80(Tween 80)的混合物组成，其溶入60g/l的IgG浓缩物，并且使用PI水设备将IgG浓缩物调节为50g/l，然后浓缩物被过滤除菌，并被分装到瓶子中。

[0137] 实施例2：在IgIVs中抗A/Bs的定量分析

[0138] 1)试验原理

[0139] 1-1)准备人体红血球

[0140] 将A Rhesus+、B Rhesus+或O Rhesus+血型的人红血球悬浮液规格化为40x 106红血球/ml pH＝7.4的PBS缓冲剂+1％BSA的浓度。

[0141] 1-2)准备单克隆D抗体范围

[0142] 准备单克隆D抗体(称为R297)用于检测在280nm相对于pH值为7.4的PBS缓冲液的吸光度(OD)。相对于在不同氨基酸中组合物，计算蛋白的摩尔消光系数(ε)，并通过下式来得到单克隆抗D的浓度：

[0143] C＝OD/E1，其中1等于用于OD测定容器的宽度。

[0144] 一个从0到200ng/ml范围的单克隆抗D抗体可以在12个点上产生(200；150；100；75；50；25；12.5；6.25；3.13；1.56；0.78和0ng/ml)。

[0145] 1-3)准备免疫球蛋白溶液

[0146] 检测市售的不同的静脉免疫球蛋白，这些免疫球蛋白的主要特性详见下表：

[0147]

[0148] *按照WO 02/092632所描述的方法，根据实施例1描述的免疫亲合性步骤来获得。

[0149] **按照WO 02/092632里所描述的方法，无实施例1描述的免疫亲合性步骤来获得。

[0150] 使用pH＝7.4、PBS+1％BSA缓冲液，将不同的免疫球蛋白配制调整为1mg/ml的浓度。

[0151] 1-4)敏化红血球

[0152] 下列物体堆积在圆底的微孔微孔板上。

[0153] -50μl A Rhesus+、B Rhesus+或O Rhesus+红血球细胞的悬浮液，其浓度为40x 106红血球/毫升，

[0154] -待测50μl抗-D或50μl IgIV样品。

[0155] 将要测定的样品分三份放置。

[0156] 然后，在37℃、搅拌下将微孔板培养两小时。

[0157] 1-5)洗液

[0158] 将微孔板在770g时离心1分钟。通过翻转除去上清液，然后在各自孔中加入200μl的PBS+1％BSA。该操作重复3遍。

[0159] 1-6)加入共轭物和洗液

[0160] 将带有藻红蛋白(PE)(Beckmann Coulter,Ref:PN IM0550)的羊抗人IgG F(ab'2)(Fc specific)在PBS+1％BSA缓冲剂中稀释为1/20th，pH 7.4,在每孔内存放50μl溶液。然后，将微孔板置于无光室温状态下反应20到30分钟。按照1-5)描述的三个连续步骤清洗。

[0161] 1-7)流式细胞计读数

[0162] 红血球的悬浮液读数是利用适当程序从流式细胞计(Beckmann Coulter FC500)上读取的。在50000events上进行读取，该装置自动计算各个点或样本的荧光强度平均值(MFI)。

[0163] 1-8)结果分析

[0164] 得到的MFI值和单克隆抗-D抗体浓度有关，利用Excel软件可以得到直线回归方程。然后，通过直线回归方程得到各个样品的当量抗-D抗体的浓度。因为将样本分成三份进行化验，那么，利用Excel软件就可以测定出其平均浓度，计算出其变异系数(CV)。

[0165] 2)结果

[0166] 2-1)抗-A抗体里的浓度

[0167]

[0168] ns＝无明显异常

[0169] 2-2)抗-B抗体里的浓度

[0170]

[0171] ns＝无明显异常

[0172] 3)结论

[0173] 亲和性步骤确实有助于去除抗-A和抗-B抗体。对市售的众多不同种类的免疫球蛋白检测中，产品IgNG2是测验出含有最少数目抗-A和抗-B抗体的产品。

[0174] 实施例3

[0175] 在含有1wt.％的牛血清蛋白(BSA)、pH 7.4的PBS缓冲剂中制备A血型中1％(v/v)的红细胞悬浮液。取出50μl的红细胞悬浮液，加入流式细胞管(Beckmann-Coulter Epics XL))和50μl的内标溶液测量流量。该悬浮液刻度校准为40.106红细胞/毫升。

[0176] 用从实例1中得到的IgG浓缩物(v/v)(B3)因子2连续稀释的方式来制备八份IgG溶液，浓度最大的一份为30g/l，稀释度最大的为0.234g/l。然后，将50μl体积的悬浮液放入96孔(well)微孔板的每个孔中，然后加入50μl不同稀度的IgG溶液。

[0177] 在温度为37℃下，搅拌下让全部溶液培养2小时。

[0178] 用200μl包括前述BSA的PBS缓冲剂清洗每个孔，微孔板在2000rpm下离心1分钟。清除上清液后，通过加入PBS-BSA将羊抗人IgG F(ab'2)抗体稀释至1/20，由藻红蛋白荧光色素(Beckmann Coulter)进行标记。

[0179] 将全部溶液置于无光处培养30分钟。

[0180] 然后如前所述冲洗悬浮液。

[0181] 将每个孔中的残留物溶解在100μl的PBS－BSA中，将包含在微孔板各孔的内容物转移至一个试管中，向其加入(Coulter)500μl Isoflow鞘液，然后用Coulter-Beckmann Epics XL仪器上的流式细胞计分析，该仪器本身包含数据采集和结果分析软件。用荧光测定法测定每个样液。

[0182] 采取相同程序分析B型血的红细胞。

[0183] 该操作模式针对IgG(B3)三个不同批次溶液，也应用于根据Cohn法(以上所引用)(B1)乙醇分馏制备的三个不同批次IgG。

[0184] 得到的结果如下表3所示：

[0185] 表3

[0186]样液 抗A抗体滴定度 抗B抗体滴定度
B1 1 1
B2(3批次) 3.80；3.55；3.59 3.80；4.45；3.31
B3(3批次) 0.66；0.68；0.69 0.33；0.73；0.50

[0187] 实施例4

[0188] 制备番木瓜酶处理A、B、AB或O型血红细胞的1％(v/v)悬浮液，以马氏细胞计数得到106个红细胞。加入100μCi的51Cr的(1体积/1体积红细胞)。得到的溶液培养1小时，然后将具有放射性标记的红细胞冲洗5次。

[0189] 然后将放射性标记的红细胞与实施例1中所得的IgG浓缩物样品(B2)接触，浓度为1.2mg/ml 5.106个放射性标记红细胞,在100ul体积下。

[0190] 然后将上述同样容量的100ul AB型血正常血清加入前述混合液中，以提供不同的补体因子。

[0191] 得到的反应混合液在37℃下培养4小时。

[0192] 然后以2000rpm离心处理混合液1分钟，用市售的合适仪器检测培养上清液的放射性。所得放射性强度与红细胞溶血程度成正比例，因而与抗A抗体和抗B抗体的含量成正比例。

[0193] 采用相同的步骤分析Rh阳性的B、AB和O型血的红细胞，并分析O+型血清的样品。这个操作模式应用于三个不同批次的IgG(B2)

[0194] 此外，该程序应用于三批次IgG浓缩液的商业样品，表示为C2-C4，以及包括作为阴性对照的O+型血清样品表示为C5。

[0195] 溶液测量的放射性与红细胞的溶血度成正比，因此与结合到红血球上的抗A抗体和抗B抗体的数量成正比。

[0196] 溶血结果如下表4所示：

[0197] 表4

[0198]

[0199] 所得结果显示IgG浓缩物B3，根据该发明使用了亲和层析法，包含极低数量的抗A抗体和抗B抗体，因为该液体造成的各血型的红细胞溶血比例最低。

[0200] 在作为阴性对照的表型O+型血中，没有发现溶血现象。

[0201] 实施例5：

[0202] 实施例1中已描述了对IgG浓缩物B2(使用免疫亲和层析法前)和B3(免疫亲和层析法后)多反应性的检测。

[0203] 根据专利EP1 059 088的方法，使用与多反应性的IgG起反应的两种抗原对这些IgG浓缩物进行多反应性的检测。该两种抗原是肌凝蛋白和二硝基苯基修饰的白蛋白(DNP白蛋白)。

[0204] 表5显示了实施例3样品B2、B3和B4中多反应性IgG的富集因子，其IgG含量任意设定为1作为参考。

[0205] 这些检测是针对所考虑的三个不同批次IgG浓缩物。

[0206] 表5

[0207]样液 肌凝蛋白 DNP白蛋白
B1 1 1
B2(3批次) 1.2；0.8；1.2 3.2；1.0；2.0
B3(3批次) 0.4；0.4；0.4 1.0；1.0；1.0
C4(3批次) 2.0；2.0；2.0 8.0；6.0；7.0