一株荧光假单胞菌及其应用

摘要

本发明公开了一株荧光假单胞菌及其应用。该菌株为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pt4，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.7597。本发明还公开了一种含有该菌株的微生物菌剂及制备方法。实验表明：本发明的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pt4发酵液中含有大量解磷菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的溶磷功能，在提高磷肥的利用率，提高作物的产量及品质方面具有重要的意义。

权利要求

1.荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株pt4，所述菌株的保藏编号为CGMCC No.7597。

2.权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株pt4在提高磷肥的利用率、改善土壤结构方面的用途。

3.权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株pt4在提高作物的产量及品质方面的用途。

4.一种微生物菌剂，含有权利要求1所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）菌株pt4。

5.一种制备权利要求4所述的微生物菌剂的方法，其特征是，包括以下步骤：（1）摇瓶培养：将活化好的荧光假单胞菌菌株pt4接种到装有NA液体培养基的三角瓶中，30℃200r/min振荡培养12h；所述NA液体培养基为：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，

0.5%NaCl，蒸馏水，pH调至7.0；

（2）种子罐发酵：将步骤（1）制备好的摇瓶种子液按体积比1%的接种量接种至装有种子罐液体发酵培养基的种子罐中进行发酵至菌体进入对数生长期；发酵温度为30-32℃，通风比为0.5～0.8：1；

所述种子罐液体发酵培养基为：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，NaCl0.1g，水1000mL，pH调至7.5；

（3）发酵罐：将步骤（2）种子罐的种子液按体积比10%的接种量接种至发酵罐进行发酵，发酵20～30h后；所述发酵条件及培养基成分同步骤（2）。

6.权利要求4所述的微生物菌剂在提高磷肥的利用率、改善土壤结构方面的用途。

7.权利要求4所述的微生物菌剂在提高作物的产量及品质方面的用途。

说明书

一株荧光假单胞菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于解磷微生物肥料领域。具体而言，本发明涉及一株能够高效解磷细菌荧光假单胞菌及其用途，以及采用该荧光假单胞菌制备的生物磷肥。

背景技术

[0002] 磷是植物细胞中遗传物质DNA和能量物质ATP的基本构成元素，在植物的整个生命过程中起着重要的作用，磷是植物生长发育的必需元素之一，高能磷酸键是能量的载体，植物的光合作用和体内的生化过程都必须有磷参加。磷既是农业生产的重要物质保证，又是不可再生的矿质资源。我国耕地土壤中全磷的质量分数一般在0.2～1.1g/kg（土）之间变动，许多土壤磷素供应不足，因此利用解磷微生物定向地调节土壤磷素状况和提高磷肥利用率是达到作物高产、品质优良的重要途径之一。

[0003] 荧光假单胞菌是革兰氏阴性好氧细菌类群，它包含了极其多样化的一群微生物。该属中有许多是致病菌，能引起人、动物及植物发病。但也有相当一部分属于有益菌，尤其在植物根围部分所筛选到的具有生防活性的细菌绝大部分属于假单胞菌属。这类细菌营养需求简单，在自然界中分布广泛。荧光假单胞菌属于假单胞菌属的rRNA同源组I，杆状，具有极生鞭毛、化能异养型。与该属下其它种类的典型区别在于能产生水溶性的黄绿荧光色素。

[0004] 细菌溶磷机理非常复杂，有些细菌溶磷主要是质子起作用，有些主要是有机酸起作用，而有些菌株则两种机制都存在，还有些菌株由于生长过程中产生其它的螯合物质，从而导致磷矿粉的溶解。充分利用解磷微生物这一特性，不仅可以利用固定态、吸附态的磷，有效缓解土壤中缺磷的现状，而且对提高磷肥利用率，减少磷肥的使用所造成的环境污染，甚至对提高作物产量及其品质，都具有重要的现实意义。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种用于高效解磷细菌——荧光假单胞菌菌株pt4。本发明的荧光假单胞菌菌株具有生长速度快、解磷能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

[0006] 本发明的另一个目的是提供一种采用该新的荧光假单胞菌制备的能够高效解磷的微生物菌剂。

[0007] 本发明所提供的菌株为荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）pt4，是从湖北省洪湖市土壤中分离获得的，已于2013年5月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCC No.7597。其具有以下生物学特性：在NA培养基上，在30℃培养时，菌落较规则，边缘较整齐，表面光滑较湿润，不凸起，半透明，颜色为淡黄色。菌体呈直杆状，（0.5～1.0）μm×（1.5～5.0）μm，革兰氏染色阴性，产生荧光色素、不产生类胡萝卜素和脓青素；可以利用柠檬酸盐，对青霉素有抗性；氧化酶、接触酶和精氨酸双水解酶阳性，明胶液化、吲哚反应阳性，水解淀粉、反硝化、V-P反应阴性。

[0008] 本发明荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescensis）菌株pt4的培养方法或繁殖方法包括：

[0009] （1）普通培养保存采用NA培养基（Nutrient agar），配方：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%NaCl，1.5%琼脂，蒸馏水，pH调至7.0。

[0010] （2）实验室液体培养采用NA培养基：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%NaCl，蒸馏水，pH调至7.0。

[0011] （3）种子罐液体发酵培养基，配方：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，NaCl0.1g，水1000mL，pH调至7.5。

[0012] （4）大量发酵培养基同种子罐液体发酵培养基。

[0013] 本发明还提供一种能够高效解磷的微生物菌剂，所述微生物菌剂含有所述的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescensis）菌株pt4。

[0014] 本发明还提供了上述荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescensis）菌株pt4或者微生物菌剂在提高磷肥的利用率，改善土壤结构，提高作物的产量及品质方面的应用。

[0015] 上述微生物菌剂的制备方法，包括：

[0016] （1）摇瓶培养：将活化好的荧光假单胞菌菌株pt4接种到装有NA液体培养基的三角瓶中，30℃200r/min振荡培养12h；

[0017] （2）种子罐发酵：将步骤（1）制备好的摇瓶种子液按1%（v/v）的接种量接种至装有种子罐液体发酵培养基的种子罐中进行发酵至菌体进入对数生长期；发酵温度为30-32℃，通风比为0.5～0.8：1；

[0018] 所述种子罐液体发酵培养基为：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，NaCl0.1g，水1000mL，pH调至7.5。

[0019] （3）发酵罐：将步骤（2）种子罐的种子液按10%（v/v）的接种量接种至发酵罐进行8
发酵，发酵20～30h后，菌体量达到50～80×10cfu/mL，即可出罐。发酵条件及培养基成分同步骤（2）。

[0020] 实验表明：本发明的荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescensis）菌株pt4发酵液中含有大量解磷菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的溶磷功能，在提高磷肥的利用率，提高作物的产量及品质方面具有重要的意义。

附图说明

[0021] 图1为磷标准曲线。

具体实施方式

[0022] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是示例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

[0023] 实施例1高效解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4的筛选和分离[0024] 本发明的荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4是从土壤中采用稀释平板法和平板划线法分离获得的，分离方法为：采用蒙金娜无机磷培养基进行筛选。土样的采集，样品采集地点为湖北省洪湖市，采样时间为2012年2月13号，采用5点取样法，分别采集地块四周和中央深度在10～20cm范围内的土壤适量，等量混匀。标明采集地点、时间和采集-2人。称取1g土样于100mL无菌水中，置于30℃摇床中150r/m震荡10min，取100μL10 、-3 -4
10 、10 稀释液涂布于蒙金娜无机磷固体培养基平板上，每个梯度涂布三个平行，在30℃培养7d后，观察有无溶磷圈，并根据溶磷圈直径(D)与菌落直径(d)比值的大小来初步确定解磷能力将有溶磷作用的菌株作好记录备用。

[0025] 本发明人通过大量筛选工作得到一株能够高效解磷的荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4。实验证明，具有生长速度快、解磷能力强、抗逆性强，在植物根际能够快速大量定殖等特点，因此具有良好的应用前景。

[0026] 解磷菌筛选采用蒙金娜无机磷固体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4.7H2O0.03g，MgSO4.7H2O0.3g，MnSO4.4H2O0.03g，Ca3(PO3)210g，酵母浸提物0.4g，琼脂20g，去离子水1000mL，pH调至7.0。

[0027] 实施例2高效解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4的菌株鉴定[0028] （1）微生物学特性：在NA培养基上，在30℃培养时，菌落较规则，边缘较整齐，表面光滑较湿润，不凸起，半透明，颜色为淡黄色。菌体呈直杆状，（0.5～1.0）μm×（1.5～5.0）μm，革兰氏染色阴性，产生荧光色素、不产生类胡萝卜素和脓青素；可以利用柠檬酸盐，对青霉素有抗性；氧化酶、接触酶和精氨酸双水解酶阳性，明胶液化、吲哚反应阳性，水解淀粉、反硝化、V-P反应阴性。

[0029] （2）分子生物学特性

[0030] 该菌株的16s rDNA基因序列测定结果如下（SEQ No.1）：

[0031] CTATACATGCAAGTCGAGCGGGGTTAGTTAGAAGCTTGCTTCTAACTAACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGCAACCTGCCCACAAGACAGGGATAACTACCGGAAACGGTAGCTAATACCCGATACATCCTTTTCCTGCATGGGAGAAGGAGGAAAGGCGGAGCAATCTGTCACTTGTGGATGGGCCTGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGCCAGGGAAGAACGCTTGGTAGAGTAACTGCTCTTGAGGTGACGGTACCTGAGAAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGCTCTTTAAGTCTGGTGTTTAATCCCGAGGCTCAACTTCGGGTCGCACTGGAAACTGGGGAGCTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGGCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTAGGGGTTTCGATACCCTTGGTGCCGAAGTTAACACATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCAGTGGAGTATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCCTCTGACCGGTCTAGAGATAGGCCTTTCCTTCGGGACAGAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGCTTAGTTGCCAGCAGGTCAAGCTGGGCACTCTAAGCAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTACTACAATGGCCGGTACAACGGGAAGCGAAGCCGCGAGGTGGAGCCAATCCTAGAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTCGGAATTGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTACAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCGCAAGGAGCCAGCCGCCGAAG

[0032] 实施例3高效解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4解磷能力的测定[0033] 采用蒙金娜无机磷液体培养基测定解磷菌的解磷能力，先将斜面上保存的荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4接种到NB液体培养基中作为种子，于30℃，180r/min恒温摇床中振荡培养12h，随后按1%的接种量（v/v）将培养好的菌液接种到250mL含100mL蒙金娜无机磷液体培养基三角瓶中，以接种1%的无菌NB液体培养基到蒙金娜无机磷液体培养基作为空白对照，于30℃，180r/min恒温摇床中振荡培养7d。

[0034] 采用钼锑抗比色法测定发酵液中的有效磷含量，解磷菌发酵液有效磷含量越高表明该解磷菌解磷能力越强。将发酵液摇匀，取20mL到离心管中，8000r/min，离心10min；吸取0.5～2mL上清液到50mL的容量瓶中，加入蒸馏水至体积约为30mL，加入2滴2.6-二硝基酚指示剂，逐滴加入4mol/L的NaOH溶液至液体呈现黄色，再加入1滴1mol/L的H2SO4至溶液黄色刚好退去，接着加入5mL的钼锑抗试剂，用水定容至刻度，在25℃下显色30min，然后在721型紫外可见分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm。根据标准曲线计算出对应的有效磷含量。

[0035] 磷标准曲线的绘制：将50mg/L的磷标液稀释10倍，为5mg/L，分别吸取5mg/L的磷标液0、2、4、6、8、10mL至50mL容量瓶中，加入蒸馏水至体积约为30mL，加入2滴2.6-二硝基酚指示剂，逐滴加入4mol/L的NaOH溶液至容量瓶中液体呈现微黄色，再加入1滴1mol/L的H2SO4至黄色刚刚消去，接着加入5mL钼锑抗试剂，并用蒸馏水定容至刻度。在25℃下显色30min，然后与上述样品的显色液同在721型紫外可见分光光度计上测定吸光度值，波长设定为700nm。以磷浓度为横坐标，以吸光度值为纵坐标，绘制磷标准曲线，如图1所示。

[0036] 不接菌的空白对照溶液中的有效磷浓度为83.6mg/L，解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4的发酵液中有效磷含量为579.4mg/L，表明解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4是一株高效解磷细菌。

[0037] NB液体培养基：0.5%蛋白胨，0.3%牛肉膏，0.5%NaCl，其余为蒸馏水，pH调至7.0。

[0038] 蒙金娜无机磷液体培养基：葡萄糖10g，(NH4)2SO40.5g，NaCl0.3g，KCl0.3g，FeSO4.7H2O0.03g，MgSO4.7H2O0.3g，MnSO4.4H2O0.03g，Ca3(PO3)210g，去离子水1000mL，pH调至7.0，用于定量测定解磷微生物的解磷能力。

[0039] 实施例4高效解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4的大量液体发酵[0040] ①斜面种子：解磷细菌菌种荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4保存在NA培养基上，贮存在4℃恒温箱内，使用前取出在NA培养基上活化两次。

[0041] ②种子摇瓶：将活化好的解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4接种到装液量为200mL含NA液体培养基的500mL三角瓶中，30℃200r/min振荡培养12h。

[0042] ③种子罐发酵：将步骤（1）制备好的摇瓶种子液按1%（v/v）的接种量接种至装有种子罐液体发酵培养基的种子罐中进行发酵；

[0043] 所述种子罐液体发酵培养基为：玉米粉15g，葡萄糖4g，豆饼粉21g，鱼粉4g，CaCO39g，(NH4)2SO41.5g，K2HPO40.5g，MgSO4·7H2O0.1g，NaCl0.1g，水1000mL，pH调至7.5。

[0044] 发酵条件：温度为30～32℃，罐压为0.5kg/cm2，通风量0.5～0.8：1；接种后，每间隔2小时取样一次，用灭菌水稀释10～100倍后，在显微镜下用血球计数器计数菌体细胞，并采用结晶紫染色法，用油镜观察细胞生长是否正常，是否污染等。若菌体大小基本一致，并且数量突然增多时，即进入对数生长期（约需要12h），此时可以向生产罐接种。

[0045] ④发酵罐：将上述种子罐的种子液按10%（v/v）的接种量接种至发酵罐进行发酵，8
在确定没有污染，发酵正常情况下，发酵20～30h后，菌体量应该达到50～80×10cfu/mL。
发酵条件及培养基成分同种子罐发酵。

[0046] 实施例5高效解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4小区试验[0047] 试验材料：荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4的发酵液，具有溶磷的功效，有8
效活菌数大于50×10cfu/mL。

[0048] 试验时间：2012年4月～2012年9月

[0049] 试验地点：山东省林业科学研究院中试基地

[0050] 供试作物：玉米（鲁单6076）

[0051] 试验土壤：菜园土

[0052] 试验设计：以不同稀释度（10倍、20倍、30倍）的荧光假单胞菌（P.fluorescensis）发酵液拌种玉米作为示范，以基质培养基拌种玉米作为对照（CK），每个处理三个平行，小区2
面积20m，随机分布。

[0053] 施肥量与施肥方法：播种前，采用不同稀释度（10倍、20倍、30倍）的荧光假单胞菌（P.fluorescensis）发酵液和基质培养基拌种，其他措施同当地，统一浇水、间苗、除草等田间管理措施。

[0054] 农艺性状及产质量调查：于收获前一天测量全株叶片数、株高、穗位、穗长、穗粗、穗行数、穗粒数、出籽率、千粒重。

[0055] 表1玉米农艺性状调查表

[0056]

[0057] 注：pt4是指高效解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）菌株[0058] 从表1数据可以看出，采用解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4发酵液的稀释液拌种的玉米，其农艺性状比用基质培养基拌种的玉米有很明显的优势。

[0059] 玉米收获后，测量各小区的产量，同时统计不同试验处理方式，玉米产量的差异。

[0060] 表2玉米产量调查表

[0061]

[0062] 从表2数据可以看出，采用解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）的发酵液拌种的玉米，比用基质培养基拌种的玉米的产量高，其中采用解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）发酵液的10倍、20倍和30倍的稀释液拌种，其玉米的产量分别比用基质培养基拌种的对照增加21.3%、16.6%和14.8%。采用解磷细菌荧光假单胞菌（P.fluorescensis）发酵液的10倍稀释液拌种的玉米产量极显著高于其30倍稀释液和对照，增产效果十分明显。

[0063] 因荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4发酵液中含有大量解磷菌，对土壤改良有一定的积极作用，其所具有的溶磷功能，对改善土壤结构，增强作物对肥料的吸收率等有很大的积极影响。

[0064] 施用荧光假单胞菌（P.fluorescensis）pt4发酵液，对土壤的改良及作物的生长都具有非常大的积极作用。