狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用

摘要

本发明提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用，具体是指一种狂犬病病毒aG株人二倍体细胞（2BS）适应株，该狂犬病病毒人二倍体细胞适应株的保藏编号为CGMCC No.7307。本发明还提供了该适应株的制备方法、该适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用、以及以该适应株制备人二倍体细胞狂犬病疫苗的方法和所制备得到的狂犬病疫苗。

权利要求

1.一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，该适应株的保藏编号为CGMCC No.7307。

2.权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。

3.一种制备人二倍体细胞狂犬病疫苗的方法，该方法包括：反应器或细胞工厂培养人二倍体细胞-2BS，接种权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，收获单次病毒收获液，将病毒收获液合并，进行超滤浓缩，利用柱层析法纯化，之后灭活病毒，并添加保护剂，冻干，即为冻干人二倍体细胞狂犬病疫苗。

4.一种人二倍体细胞狂犬病疫苗，其是利用权利要求1所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株制备得到的。

5.根据权利要求4所述的人二倍体细胞狂犬病疫苗，其是按照权利要求3所述的方法制备得到的。

说明书

狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用

技术领域

[0001] 本发明是关于一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其制备方法与应用，具体是指一种狂犬病病毒aG株人二倍体细胞(2BS)适应株、该适应株的制备方法以及该适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。

背景技术

[0002] 狂犬病(rabies)是由狂犬病病毒感染所导致的以损害中枢神经系统为主要症状的急性传染病，属人兽共患的自然疫源性疾病，一旦发病，病死率100％，目前尚无特效药物用于治疗，接种狂犬病疫苗是预防狂犬病的有效方法。

[0003] 在我国，目前上市的狂犬病疫苗主要有三种，分别为Vero传代细胞、原代地鼠肾细胞和原代鸡胚细胞疫苗。

[0004] Vero细胞生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。Vero细胞系是从非洲绿猴的肾脏上皮细胞中分离培养出来的，Vero细胞系是连续的非整倍体细胞。由于是传代细胞系，有一定的致肿瘤性；疫苗必须纯化，且细胞DNA含量须达到标准(10ng/剂)。

[0005] 原代地鼠肾细胞生产用毒种为狂犬病病毒固定毒aG株或经批准的其他地鼠肾细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。由多种类型的细胞组成，细胞种类比较复杂，细胞间特性存在差异；动物的个体间存在差异，难以保证细胞质量的一致性；需要建立符合要求的动物繁殖设施，污染环境有悖3R原则，原代细胞培养的营养条件要求较高，不能进行生物反应器现代化大规模培养，外源致病微生物污染的风险较大。

[0006] 而进口鸡胚细胞狂犬病疫苗采用的是狂犬病病毒Flury LEP。SPF鸡蛋成本高，疫苗价格高；鸡蛋过敏者仍须慎重使用；病毒株在鸡胚细胞中产量较低，生产成本较高；剂量大，每剂量1ml。

[0007] 人二倍体细胞来源于人胚肺，为人正常核型细胞，无致癌性，无病毒外源因子和外源动物杂质污染，是疫苗生产的最安全细胞基质。人二倍体细胞狂犬病疫苗于20世纪60年代由美国Wistar研究所Wiktor等人首创，1974年在法国首次获准生产上市，1977年WHO推荐使用，主要由法国、德国生产，仅在美国、欧洲等发达国家以及部分亚洲国家使用，目前已接种150多万人群。人二倍体细胞狂犬病疫苗具有高免疫原性和良好的耐受性，无严重的不良反应，不含外源因子，预防性接种产生高滴度的中和抗体，对暴露后人群的治疗安全有效，被认为是狂犬病疫苗的黄金标准。但目前的人二倍体细胞狂犬病疫苗生产技术仍存在产能不高的问题，且疫苗质量有待更进一步提高。

[0008] 目前我国还没有人二倍体细胞狂犬病疫苗上市的报道。生产人二倍体细胞狂犬病疫苗首要条件为建立狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。

发明内容

[0009] 本发明的一个目的即在于提供一种人二倍体细胞适应株，以进一步提供安全、有效、与人类抗原性高度一致的狂犬病疫苗。

[0010] 本发明研究采用人二倍体细胞株——2BS株，对狂犬病病毒aG株进行传代适应性研究，通过带毒细胞传代与挑斑相结合的方法，挑选出了病毒滴度高、免疫原性好的狂犬病病毒适应毒种，建立了狂犬病病毒aG株在人二倍体细胞2BS上的适应株。本发明将该适应株命名为2aG4-B(B为2BS中的B)。本发明的适应株已于2013年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.7307。

[0011] 根据本发明的具体实施方案，本发明采用的狂犬病病毒为固定毒aG株，来源于武汉生物制品研究所，适应前代次为2aG4。毒种2aG4采用在2BS细胞上传代与挑斑相结合的方法，在传代至第40代时建立了本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。按照《中华人民共和国药典》对该第40代进行毒种检定，免疫原性保护指数为270以上，鉴别试验显示所有的病毒被抗狂犬病血清所中和，中和指数高，无外源病毒污染，无菌检查、支原体检查及病毒外源因子检查均合格。此外，通过病毒RNA序列的测定显示适应前后有16个碱基发生了变化，但未对病毒关键序列造成影响，病毒毒力和抗原性无变异。抗狂犬病病毒单克隆IgG荧光显色显示狂犬病病毒阳性。

[0012] 根据病毒传代稳定性研究结果显示，第40代至第46代病毒，病毒滴度、免疫原性、鉴别试验及RNA序列等无差别，作为毒种均可以生产人二倍体细胞狂犬病疫苗，因此，第40代至第46代七个代次的病毒均被定义为狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。

[0013] 本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株具有优异的对细胞的亲和性强、传代稳定、无变异、抗原性好、培养产毒量高等特性，能生产出病毒滴度高、效价高、安全性好的狂犬病疫苗。

[0014] 从而，一方面，本发明提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，该适应株的保藏编号为CGMCC No.7307。

[0015] 另一方面，本发明提供了所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株的制备方法，该方法包括：采用狂犬病病毒固定毒aG株在人二倍体细胞2BS细胞上传代与挑斑相结合的方法，即当病毒传代至病毒滴度达到一定水平后，将10倍系列稀释的病毒液与消化分散的2BS细胞同种于6孔板进行挑斑，挑选到抗原含量高的病毒克隆后继续在小方瓶中传代适应，得到狂犬病病毒人二倍体细胞适应株CGMCC No.7307。

[0016] 另一方面，本发明还提供了所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株在制备人二倍体细胞狂犬病疫苗中的应用。

[0017] 另一方面，本发明还提供了一种制备人二倍体细胞狂犬病疫苗的方法，该方法包括：

[0018] 反应器或细胞工厂培养人二倍体细胞-2BS，将本发明的的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株以合适的MOI接种到人二倍体细胞上，收获单次病毒收获液，将病毒收获液合并，进行超滤浓缩，利用柱层析法纯化，之后灭活病毒，并添加保护剂，冻干，即为冻干人二倍体细胞狂犬病疫苗。

[0019] 另一方面，本发明还提供了一种人二倍体细胞狂犬病疫苗，其是利用本发明所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株制备得到的。

[0020] 更具体地，本发明的人二倍体细胞狂犬病疫苗是按照上述方法制备得到的。该疫苗效价高、安全性好。

[0021] 综上所述，本发明提供了一种狂犬病病毒人二倍体细胞适应株CGMCC No.7307，采用本发明的适应株，为生产人二倍体细胞狂犬病疫苗提供了毒种。以此毒种生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗无外源因子污染，制品质量高，免疫效果好，质量高度可控，生产纯化时无须考虑细胞DNA，与人类抗原性一致，过敏反应小，安全可靠；且目前狂犬病疫苗市场需求大。

附图说明

[0022] 图1为本发明的病毒传代方式流程示意图。

[0023] 图2为2aG4传代与挑斑各培养代次病毒滴度和抗原含量曲线图。

[0024] 图3A～图3C为适应株的稳定性：免疫原性、鉴别试验和病毒滴度检测曲线图。

[0025] 图4为不同稀释度的适应株在BHK-21细胞上培养3天后的荧光染色图。其中，图-3 -4 -5 -6片A：10 ；图片B：10 ；图片C：10 ；图片D：10 ；图片E：正常细胞对照。狂犬病病毒阳性显现绿色荧光。

[0026] 图5为实验样品抗原含量和效价曲线图。

[0027] 用于专利程序的微生物保存：

[0028] 保藏日期：2013年2月28日

[0029] 保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

[0030] 保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所[0031] 保藏编号：CGMCC NO.7307

[0032] 分类命名：狂犬病病毒。

具体实施方式

[0033] 为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中所用各原始试剂、材料均可商购获得；实施例中未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照制造商或提供商所建议的条件。

[0034] 实施例1 狂犬病病毒人二倍体细胞适应株的建立

[0035] 请参照图1所示的病毒传代流程示意图，取狂犬病病毒2aG4毒种(来源自武汉生2
物制品研究所的固定毒aG株，代次为2aG4)1ml，与1：2分种率的2BS细胞同种至25cm小方瓶中(2瓶)，记为2aG4-B1(B为2BS中的B，B1表示狂犬病病毒在2BS细胞上传一代)，生长液为含8-10％新生牛血清、pH7.2-7.4的GIBCO MEM，于37±0.5℃培养三天，换含
0.05-0.2％人血白蛋白、pH7.0-7.6的GIBCO MEM维持液35±0.5℃继续培养。至6-8天，混合收获病毒液，其中一瓶以0.25％胰酶消化，以1：2的分种率进行带毒细胞传代，并补加
5
正常2BS细胞约1×10个/瓶(以后视细胞病变程度增减细胞补加量)，同时接种病毒液
1ml/瓶，记为2aG4-B2(B2表示狂犬病病毒在2BS细胞上传二代，依次类推)，另一瓶换新鲜维持液继续培养。以上为一个完整的病毒传代方式。

[0036] 病毒滴度按照NIH法脑内接种11-13g小鼠，0.03ml/只，每个稀释度6只，测定小鼠脑内毒力。病毒收获液采用56℃水浴30分钟的灭活方法，ELISA法检测狂犬病病毒抗原含量。

[0037] 2aG4在2BS细胞上传至第10代，病毒滴度达到了4.17LogLD50/ml，此时采用挑斑法对第10代病毒进行克隆优选。由于狂犬病病毒很难在2BS细胞上形成蚀斑，所以采用与BHK-21细胞相同的挑斑方法，在6孔培养板上进行盲挑。具体方法是：

[0038] 1、将2BS细胞消化分散后以0.5-2×105个/ml的细胞量加入NUNC六孔板，并立即加入在2BS细胞上培养的狂犬病病毒收获液，置含5％CO2培养箱37±0.5℃培养过夜；

[0039] 2、第二天弃去培养液，覆盖0.5-1％的甲基纤维素，继续培养6-8天，于镜下能够看到细胞病变或疑似病变时(病毒在逐步适应过程中，病变会越来越明显)，于病变部位进行挑斑；

[0040] 3、用微量加样枪无菌吸取病变部位内容物，至已事先加好2BS细胞悬液的96孔板，于含5％CO2培养箱37±0.5℃培养6-8天；

[0041] 4、吸取96孔板上病变孔病毒液，至已事先加好2BS细胞悬液的24孔板，于含5％CO2培养箱37±0.5℃培养6-8天；

[0042] 5、每孔吸取100ul病毒液检测狂犬病病毒抗原，挑选抗原OD值较高孔直接回人二倍体细胞小方瓶继续传代培养；

[0043] 6、挑斑回传2BS细胞后，传3代检测病毒滴度，根据滴度选择高滴度的病毒液继续传代，其它则终止。在进行克隆优选过程中，病毒基本都在2BS细胞上繁殖约7天，因此同样累计病毒传代代次。

[0044] 在毒种传代过程中，分别于第10、19、33代挑斑，病毒滴度呈台阶状上升趋势，每次挑斑后，病毒滴度逐渐下降，传几代后，滴度开始上升，至第40代，病毒滴度达到了7.27LogLD50/ml，继续传代至第47代，7代病毒滴度均维持在7.0LogLD50/ml以上，而抗原含量在第40代以后也维持在较高水平(见图2)，且免疫原性较好。

[0045] 将第40代病毒液按照《中华人民共和国药典三部》进行一系列毒种检定，免疫原性保护指数为270以上(>100)，鉴别试验显示所有的病毒被抗狂犬病血清所中和，中和指数高达316,23以上，无外源病毒污染，无菌检查、支原体检查及病毒外源因子检查均合格。此外，通过病毒RNA序列的测定显示适应前后有16个碱基发生了变化，但未对病毒关键序列造成影响。抗狂犬病病毒单克隆IgG荧光显色显示狂犬病病毒阳性。相关实验显示，按照上述挑斑传代培养方法得到的第40代病毒株已经能够相对稳定地传代培养，因此，本发明中将第40代病毒液建立为本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株，于-60℃以下保存。

[0046] 将适应株继续传代进行毒种稳定性研究，发现在第55代之前，毒种病毒滴度基本维持在7.0LogLD50/ml以上，且免疫原性较高，因此进行三级毒种库的建立，将第40代(2aG4-B40)建立为原始代，2aG4-B44建立为主代(2aG4-B41至2aG4-B44均可视为主代)、2aG4-B46建立为工作代(2aG4-B45至2aG4-B46均可视为工作代)。根据病毒传代稳定性研究结果显示，第40代至第46代病毒，病毒滴度、免疫原性、鉴别试验及RNA序列等无差别，作为毒种均可以生产人二倍体细胞狂犬病疫苗，因此，第40代至第46代七个代次的病毒均被定义为狂犬病病毒人二倍体细胞适应株。

[0047] 本发明的该狂犬病病毒人二倍体细胞适应株已于2013年02月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号：CGMCC No.7307。

[0048] 实施例2 狂犬病病毒人二倍体细胞适应株及其后各代病毒的各项检定[0049] 本实施例中，各代次病毒液的收集参见实施例1。本实施例中的各项检定，除RNA序列测定及荧光染色之外，其他实验全部严格按照现行版《中华人民共和国药典》进行，在此不再对具体的操作步骤进行赘述。

[0050] 1、适应株及后其后各代病毒的各项检查：

[0051] 病毒滴定、免疫原性检查、鉴别试验分别见图3A、图3B、图3C，无菌检查、支原体检查全部合格，病毒外源因子检查关键代次检查合格。

[0052] 2、狂犬病病毒RNA序列的测定

[0053] 采用天根病毒RNA提取试剂盒提取病毒收获液中的病毒RNA，将病毒RNA干冰寄至宝生物工程(TaKaRa)大连有限公司，委托该公司采用PCR扩增方法进行病毒RNA序列的测定。所测代次为2aG4(G0)、2aG4-B10(G10)、2aG4-B19(G19)、2aG4-B31(G31)、2aG4-B40(G40)、2aG4-B45(G45)、2aG4-B46(G46)、和2aG4-B60(G60)，其中2aG4、2aG4-B40、
2aG4-B45、2aG4-B46、和2aG4-B60测定RNA全序列，其余仅测糖蛋白序列GP。

[0054] 表1：狂犬病病毒RNA(GP)测序结果

[0055]代次 TaKaRa编号 全长序列(bp) 突变位点(bp) 同源性
G0 CTD 758 11877 / /
G10 CTD 976-10 1575 2 99.87*
G19 CTD 976-19 1575 3 99.81*
G31 CTD 976-31 1575 3 99.81*
G40 CTD 974 11859 16 99.87
G45 CTD 975 11845 16 99.87
G46 CTF464-46 11877 16 99.87
G60 CTF464-60 11877 15 99.87

[0056] *：仅GP序列比较。

[0057] 根据文献显示，狂犬病病毒与中和抗体结合的主要部位是GP分子上330-357位氨基酸区段的第三(GⅢ)和34-200位氨基酸区段的第二(GⅡ)抗原部位(Lafon M,L Edelman,J P Bouvet et al.Human monoclonal antibodies specific for the rabies virus glycoprotein and N protein[J].J Gen Virol,1990,71:1689-1696)，其中333位氨基酸Arg(R精氨酸)被认为是狂犬病病毒嗜神经性和毒力的关键残基，如果该部位R被Q(谷氨酰胺)、L(亮氨酸)或G(甘氨酸)取代，病毒的毒力将会大大降低(Sief L,Coulon P,Rollin PE et al.Rabies virulence:effect on pathogenicity and sequence characterization of rabies virus mutations affecting antigenic site Ⅲ of the glycoprotein[J].J Virol,1985,53(3)926～934)。GP抗原性变化经常是因为GⅡ位点上34-42和198-200位氨基酸以及GⅢ位点上330-340位氨基酸的改变造成。本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株GP序列氨基酸变化发生在368位以后，对狂犬病病毒的毒力和抗原性不造成影响。

[0058] 本发明的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株其他碱基序列的改变，均未对病毒关键序列造成影响，这些序列的改变有可能在狂犬病病毒对2BS细胞的逐步适应中起作用，使得狂犬病病毒对细胞的亲和性增强，滴度提高。

[0059] 3、荧光法对适应株进行鉴别

[0060] 将适应株2aG4-B40病毒液进行10倍系列稀释，吸取100ul与消化分散的BHK-21细胞0.5-2ml同时接种于荧光反应板(板孔中有盖玻片)，混匀后于二氧化碳培养箱培养，3天后将盖玻片用PBS冲洗2-4次，置37℃5-10分钟，于冷丙酮中固定5-20分钟，后置37℃避光5-10分钟，加入FITC标记的抗狂犬病病毒抗体，37℃孵育30-45分钟，FA洗液冲洗2-4次后，将盖玻片吸干并加甘油与FA，置载玻片上10-20分钟后，荧光显微镜下观察。结果均-3显示狂犬病病毒阳性。图4示例性地显示了2aG4-B46荧光显色结果，其中，图片A：10 ；图-4 -5 -6
片B：10 ；图片C：10 ；图片D：10 ；图片E：正常细胞对照；可以看出，本发明的狂犬病病毒阳性，显现绿色荧光。

[0061] 4、国家权威机构的检定结果

[0062] 将工作种子批2aG4-B46，批号：20110704，送至中国药品生物制品检定研究院检验，检品编号：SHBE201101391，检验结果如下：

[0063] 表2 中国药品生物制品检定研究院工作毒种检验结果

[0064]检验项目 标准规定 检验结果
鉴别试验 中和指数应不低于500 31623

[0065]病毒滴度(lgLD50/ml) ≥7.0 7.1
无菌试验 应无细菌及真菌生长 符合规定
支原体检查(培养法) 应无支原体生长 符合规定
支原体检查(DNA染色法) 阴性 符合规定

[0066] 实施例3 狂犬病病毒疫苗的制备

[0067] 1、取人二倍体细胞工作细胞库的1支或几支细胞管，细胞复苏、扩增至篮式反应器或细胞工厂上；

[0068] 2、按0.01-0.1MOI接种本发明所述的狂犬病病毒人二倍体细胞适应株工作代毒种(2aG4-B46)，置37±0.5℃培养3-6天后，弃去培养液，用PBS冲洗去除新生牛血清，加入适量MEM病毒维持液，置35±0.5℃继续培养；

[0069] 3、培养2-4天后，根据细胞病变情况进行病毒液收获，根据细胞生长情况进行单次或多次收获；

[0070] 4、病毒液的合并与超滤浓缩，超滤膜包为Millipore Pellicon膜包，分子截留量为300KD；

[0071] 5、浓缩液的柱层析纯化，层析柱根据病毒浓缩液量采用GE XK系列或BPG系列柱子，层析填料为sepharose 4FF；

[0072] 6、纯化后加入含有乳糖、蔗糖、甘氨酸和精氨酸的保护剂，按1：4000的比例加入β-丙内酯，置2-8℃24小时灭活病毒，并于37℃水浴2小时水解β-丙内酯；

[0073] 7、配制：根据蛋白质含量及抗原量进行配制，未加入人血白蛋白前蛋白质含量不高于80μg/剂。

[0074] 8、西林瓶分装并冻干，复溶后每瓶0.5ml。每1次人用剂量为0.5ml，狂犬病疫苗效价应不低于2.5IU。

[0075] 9、人二倍体细胞狂犬病疫苗实验批抗原含量及效价见下表，采用适应株生产的人二倍体细胞狂犬病疫苗，效价较高，不同温度下疫苗质量稳定。见图5。