一种蝇蛆肽的制备方法

摘要

本发明提供了一种蝇蛆肽的制备方法，其步骤为：a、将产蛋白酶的微生物菌种接种到固体培养基中，通气培养，得到微生物孢子；b、将微生物孢子接种到以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基中，发酵培养，固液分离，收集上清液；c、将上清液浓缩、低温干燥，得到蝇蛆肽。本发明所述方法步骤简单、成本低廉、产物收率高。

权利要求

1.一种蝇蛆肽的制备方法，其包括以下步骤：

a、将可产生蛋白酶的微生物菌种接种到无菌培养基中，通气培养，得到微生物孢子或菌体；

b、将微生物孢子或菌体接种到以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基中，发酵培养12~100小时，去除菌丝球或菌体，获得蝇蛆肽溶液；所述以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基，其制备方法是向新鲜蝇蛆或干蝇蛆充分浸泡后加入生理盐水或0.1-0.2mol/L pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲液，于4-10℃下，匀浆或研磨10-20h，离心或过滤，除去固体不溶物，收集液体，调节至蛋白质浓度为20-30mg/mL，向其中加入碳水化合物，使碳水化合物的质量浓度为2-8%；

c、将蝇蛆肽溶液，低温干燥，得到蝇蛆肽。

2.根据权利要求1所述蝇蛆肽的制备方法，其特征在于：所述可产蛋白酶的微生物菌种是米曲霉、黑曲霉、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、放线菌中任意一种。

3.根据权利要求1或2所述蝇蛆肽的制备方法，其特征在于：a步骤所述培养基是察氏培养基、PDA培养基、麸皮豆粕培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基中任意一种。

4.根据权利要求3所述蝇蛆肽的备方法，其特征在于所述麸皮豆粕培养基，其配方以质量百分比计为，豆粕30-40%， 麸皮10-15%，发酵豆粕浸提物0.1-1.0%，其余为水。

5.根据权利要求1或2所述蝇蛆肽的制备方法，其特征在于：a步骤所述通气培养，其温度为20-40℃，时间为2-7天。

6.根据权利要求1所述蝇蛆肽的制备方法，其征在于：所述碳水化合物为蔗糖、葡萄糖、糖蜜、淀粉、转化糖中任意一种。

7.根据权利要求1所述蝇蛆肽的制备方法，其征在于：所述磷酸盐缓冲液为磷酸氢二钠-磷酸二氢钠、磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲液中任意一种。

8.根据权利要求1或2所述蝇蛆肽的制备方法，其征在于：b步骤所述发酵培养，其条件为20-40℃，10-400r/min摇瓶震荡，通气培养12-100h。

说明书

一种蝇蛆肽的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体地说，涉及一种由蝇蛆蛋白发酵生产抗氧化活性肽的方法。

背景技术

[0002] 蝇蛆是家蝇(Musca domestica Linnaeus) 的幼虫，其体内（干物质）含蛋白质59-65 %，脂肪10-14 %，甲壳素8-10 %，此外，还含有多种维生素、微量元素等营养成分。蝇蛆蛋白具有抗菌、抗病毒和清除自由基的作用，但受传统观念的影响，市场对蝇蛆产品的接受度较低，因此蝇蛆粉通常作为动物饲料添加剂来使用。为了进一步有效利用蝇蛆蛋白，有研究人员将蝇蛆蛋白酶解，由此得到蝇蛆肽。蝇蛆肽具有良好的抗氧化、提高免疫功能的活性，其在医药、化妆品等行业有巨大的市场潜力。但现有的酶解制备方法工艺繁琐、转化率低、成本昂贵，不适宜工业化应用。

发明内容

[0003] 本发明的目的是提供一种工艺简单、成本低廉、且转化率高的蝇蛆肽的制备方法。

[0004] 为实现本发明目的，本发明所提供的蝇蛆肽的制备方法，包括以下步骤：

[0005] a、将可产生蛋白酶的安全微生物菌种接种到无菌培养基中，通气培养，得到微生物孢子或菌体；

[0006] b、将微生物孢子或菌体接种到以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基中，发酵培养2~4天，去除菌丝球或菌体，获得蝇蛆肽溶液；

[0007] c、将蝇蛆肽溶液，低温干燥，得到蝇蛆肽。

[0008] 本发明方法中的a步所述固体培养基在接种前要保持无菌状态，故可 0.1 MPa灭菌20 min，制成斜面备用。

[0009] 所述可产生蛋白酶的安全微生物菌种为米曲霉（Aspergillus oryzae）、黑曲霉（Aspergillus niger）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）、地衣芽孢杆菌（ Bacillus licheniformis）、放线菌（Actinomycete）中任意一种。

[0010] 本发明方法中所述固体培养基可以是任何一种适合于上述微生物生长的营养介质，如察氏培养基、PDA培养基、麸皮豆粕培养基、牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基等。其中以麸皮豆粕培养基为优选。

[0011] 麸皮豆粕培养基的配方以质量百分比计为：

[0012] 豆粕30-40%， 麸皮10-_15_%，发酵豆粕浸提物0.1-1.0_%，水40-50_%。

[0013] 配制方法为：称取一定质量的发酵豆粕浸提物，加入水中搅拌均匀，加入豆粕，室温浸泡至透，最后加入麸皮，拌匀，0.1 Mpa条件下灭菌20 min。

[0014] 本发明方法所述以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基，是在蝇蛆蛋白浸提液中加入碳水化合物（如蔗糖、葡萄糖、糖蜜或淀粉转化糖的任意一种，也可再加入一些其他微生物碳源），在20-40℃，10-400r/min摇瓶震荡通气，培养12-100小时。其制备方法是向新鲜蝇蛆中或干蝇蛆充分浸泡后加入pH6.5-8.0的缓冲液或生理盐水，于4-10℃下，匀浆、研磨、浸提10-20h，离心或过滤，除去固体不溶物，收集液体，调节至蛋白质浓度为20-30mg/mL，向其中加入碳水化合物，使碳水化合物的质量浓度为2-8%，优选5%，得到以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基。

[0015] 上述用于浸提蝇蛆蛋白的溶液可以是生理盐水或pH6.5-8.0的磷酸盐缓冲液中任意一种，优选0.2 mol /L pH6.9磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液。

[0016] 本发明方法中更为优选的以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基配方为：以质量百分含量计，蝇蛆蛋白2-3%，葡萄糖或其他糖1-3%，磷酸氢二钠1.0 -2.0%，磷酸二氢钠0.5-1.5%，其余为水。

[0017] 制备方法:称取一定质量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶于水，加入新鲜蝇蛆或干蝇蛆浸泡透加入，匀浆，除去固形物，测定蛋白质浓度，使之在2-3%，加入1-3%葡萄糖或其他糖，搅拌均匀，0.1 Mpa灭菌20 min。

[0018] 本发明方法更为优选的条件是：

[0019] a步骤所述通气培养，其温度最好为20-40℃，时间最好为30~48h。

[0020] 本发明b步骤所述发酵培养，其条件最好为20-40℃下，10-400r/min摇瓶震荡，通气培养12-100h。

[0021] 本发明采用微生物发酵法生产制备蝇蛆肽，其方法简单，制造成本低，转化率高（大于30%）。

[0022] 现有方法制备的蝇蛆蛋白一般是分子量为91.8 kD的大分子蛋白为主，其余分子量较小的蝇蛆肽含量极低。本发明方法将蝇蛆蛋白经微生物转化为蝇蛆肽，经10%SDS-PAGE检测产品中蝇蛆肽分子量范围为65.9-22.4kD，经Tricine-SDS-PAGE检测，产品中还含有分子量范围20.2-5.9kD的多种蝇蛆肽。制备的蝇蛆肽具有优良的抗氧化活性及抗衰老作用。

附图说明

[0023] 图1是10%分离胶SDS-PAGE检测本发明所生产的蝇蛆蛋白及蝇蛆肽的电泳图谱。其中a、蝇蛆蛋白条带；b、抗氧化活性肽条带；

[0024] 图2是Tricine-SDS-PAGE检测蝇蛆肽的的电泳图谱，其中浓缩胶4%，夹层胶10%，致密胶16.5%； 1为：小分子量Marker，2-5为转化不同时间的蝇蛆肽。

[0025] 图3是本发明制备的蝇蛆肽对雌果蝇存活时间的影响曲线图。

[0026] 图4是本发明制备的蝇蛆肽对雄果蝇存活时间的影响曲线图。

具体实施方式

[0027] 下面用具体实施例来进一步说明本发明的内容，但并不以任何方式意味着对本发明进行限制。下列实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。

[0028] 实施例1

[0029] PDA培养基在0.1 MPa灭菌20 min，铺成斜面备用。

[0030] 以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基的制备：以质量百分含量计，蝇蛆蛋白2-3%，葡萄糖或其他糖1-3%，磷酸氢二钠1.0 -2.0%，磷酸二氢钠0.5-1.5%，其余为水。

[0031] 制备方法:称取一定质量的磷酸氢二钠和磷酸二氢钠，溶于水，加入新鲜蝇蛆或干蝇蛆浸泡透加入，匀浆，除去固形物，测定蛋白质浓度，使之在2-3%，加入1-3%葡萄糖或其他糖，搅拌均匀，0.1 Mpa灭菌20 min。

[0032] 蝇蛆肽的制备：

[0033] a、将米曲霉（Aspergillus oryzae）3042接种到上述PDA培养基中，于32℃下，通气培养48-72h，得到米曲霉孢子；

[0034] 米曲霉（Aspergillus oryzae）3042从市场销售渠道购得。

[0035] b、将米曲霉孢子接种到上述蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基中，于20℃下，10-400r/min摇瓶震荡，通气培养96h，6000r/min离心20min，去除不溶性的固体菌丝球，获得蝇蛆肽溶液；

[0036] c、将上述蝇蛆肽溶液，低温干燥，得到粉末状的蝇蛆肽。

[0037] 经两种电泳法测定，本实施例所得蝇蛆肽分子量范围为65.9-5.9kD（如图、图2所示）。蛋白转化率为30.6%。

[0038] 实施例2

[0039] a、试管内装入适量察氏培养基，0.1 MPa灭菌20 min，制成斜面备用；将保存的Aspergillus oryzae（3.042） 接入斜面，32 ℃的恒温培养箱中培养至长满孢子。

[0040] b、将长好的Aspergillus oryzae 3.042，接入适量到以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基的三角瓶中，32 ℃，180 r/min震荡培养96小时。6000r/min离心20min，去除菌丝体，上清液为蝇蛆肽溶液；

[0041] 上述以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基的制备方法：将新鲜蝇蛆或干蝇蛆充分浸泡后加入pH6.5缓冲液，匀浆，不离心，调整其蛋白质浓度为2.5%，加入2%葡萄糖，每500mL三角瓶装入50mL，0.1 MPa灭菌30 min。

[0042] c、双缩脲法测得上清液的肽浓度为7.89mg/mL，低温干燥，获得蝇蛆肽粉。

[0043] 经两种电泳法测定，本实施例所得蝇蛆肽分子量范围为65.9-5.9kD（如图、图2所示）。微生物转化蝇蛆蛋白形成蝇蛆肽的转化率为31.6%。

[0044] 实施例3

[0045] a、将黑曲霉（Aspergillus niger）3350接种到察氏斜面培养基中，于30℃下，通气培养4天，得到黑曲霉孢子；

[0046] b、将黑曲霉孢子接种到蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基中，于30-32℃下， 200r/min摇瓶震荡，通气培养80-100h，6000r/min离心20min，去除不溶性的固体菌丝，收集上清液（即蝇蛆肽溶液）；

[0047] 上述以蝇蛆蛋白为唯一氮源的培养基的制备方法是：

[0048] 将新鲜蝇蛆或干蝇蛆充分浸泡后加入自来水，匀浆，不离心，使可溶性蛋白质浓度在2.0-4.5%范围，直接加入1-3%的蔗糖或糖蜜，盐酸调节pH至5.5左右，每500mL三角瓶装液50mL，0.1 MPa灭菌30 min。

[0049] c、本实施例所得抗氧化活性肽，经双缩脲法测定蛋白转化率为31.1%。

[0050] 将上清液浓缩、低温干燥，可得到粉末状的蝇蛆肽。

[0051] 经两种电泳法测定，本实施例所得蝇蛆肽分子量范围为65.9-5.9kD（如图、图2所示）。

[0052] 实施例4

[0053] a、菌株活化：试管内装入适量牛肉膏蛋白胨培养基，0.1 MPa灭菌20 min，制成斜面备用；将保存的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌株接入斜面，32 ℃的恒温培养箱中培养。

[0054] b、培养种子： 8%玉米粉，12%豆饼粉，磷酸二氢钾1.2克，磷酸氢二钠.12H2O，1.8克， 氯化锌0.5克，其余为自来水，调节pH8.0。上述种子培养基0.1 MPa灭菌30 min。接种2环活化的枯草芽孢杆菌，37℃，200r/min摇瓶培养24-48小时。

[0055] c、蝇蛆蛋白转化：将新鲜蝇蛆或干蝇蛆充分浸泡后加入自来水，匀浆，不离心，使可溶性蛋白质浓度在2.0-4.5%范围，直接加入1-3%的蔗糖或糖蜜，调节初始pH至pH7.5-9.0，每500mL三角瓶装液50mL，0.1 MPa灭菌30 min。按1-3%接种，在温度40-50℃，200r/min摇瓶震荡培养3天。

[0056] d、收获蝇蛆肽：将枯草杆菌发酵液6000r/min离心20min，去除菌体，收集上清液（即蝇蛆肽溶液）；可将蝇蛆肽溶液低温冻干，得蝇蛆肽粉。

[0057] 经两种电泳法测定，本实施例所得蝇蛆肽分子量范围为65.9-5.9kD（如图、图2所示）。双缩脲法测定蝇蛆肽的收率为29.8%。

[0058] 实施例5

[0059] a、菌株活化：试管内装入适量牛肉膏蛋白胨固体培养基，0.1 MPa灭菌20 min，制成斜面备用；将保存的地衣芽孢杆菌( Bacillus licheniformis)2709接入斜面，32 ℃的恒温培养箱中培养。

[0060] b、种子培养：从活化的地衣芽孢杆菌斜面，取2环接种于种子培养基，37℃，200r/min摇瓶培养24-48小时。种子培养基的配方采用牛肉膏蛋白胨液体培养基。

[0061] c、蝇蛆蛋白转化为蝇蛆肽：按2%接种量接入种子到蝇蛆蛋白为唯一氮源的液体培养基中，37℃，200r/min摇瓶震荡培养48h。蝇蛆蛋白为唯一氮源的液体培养基的制备方法：将新鲜蝇蛆或干蝇蛆充分浸泡后加入自来水，匀浆，不离心，使可溶性蛋白质浓度在2.0-4.5%范围，直接加入1-3%的蔗糖或糖蜜，调节初始pH至pH7.59.0，每500mL三角瓶装液50mL，0.1 MPa灭菌30 min。发酵液6000r/min离心20min，去除菌体，收集上清液（即蝇蛆肽溶液）；可将蝇蛆肽溶液低温冻干，得蝇蛆肽粉。经两种电泳法测定，本实施例所得蝇蛆肽分子量范围为65.9-5.9kD（如图1、图2所示）。双缩脲法测定蝇蛆肽的收率为33.4%。

[0062] 实施例6

[0063] 米曲霉Aspergillus oryzae 3042转化蝇蛆蛋白形成的蝇蛆肽提高果蝇生存寿命的实验。

[0064] 选取24 h内羽化未交配的雌雄果蝇各400只，乙醚麻醉后按性别随机分组。雌性果蝇编号为：对照♀、96 h低♀、96 h中♀、96 h高♀；雄性果蝇编号为：对照♂、96 h低♂、96 h中♂、96 h高♂。将蝇蛆肽加入基础培养基中，加量分别占培养基的1 %，2 %，4 %（g/g），以基础培养基为对照组，将果蝇置于温度(25±1) ℃，湿度55 %～65 %的隔水式恒温培养箱中进行培养。每24 h观察记录各组果蝇死亡数目，记录存活天数，直至果蝇全部自然死亡。每组最后死亡的5只果蝇的平均寿命，作为其平均最高寿命。采用SPSS10.0进行数据分析。

[0065] 结果见表1、图3、图4：

[0066] 表1 蝇蛆肽对果蝇的延寿作用

[0067]

[0068] a : P < 0.05，b: P < 0.01

[0069] 从表1、图3、图4可以看出，米曲霉Aspergillus oryzae 3042转化蝇蛆蛋白96h形成的蝇蛆肽，在本实验的中、高浓度组，对果蝇寿命有极显著延长作用。说明蝇蛆肽有良好的抗衰老作用。