一种检测儿童哮喘的标志物及引物

摘要

本发明公开了属于儿童哮喘辅助诊断技术领域的一种检测儿童哮喘的标志物及引物。本发明通过从哮喘组儿童血液中提取基因组DNA，采用PCR方法分析了GATA3基因5’启动子区的SNP290G/A位点的基因型，并与中国北京汉族儿童哮喘的关系进行了评估。关联性研究结果显示，GATA3基因的SNP290G/A单核苷酸多态性与北京地区儿童哮喘相关，是儿童哮喘的高风险因素，与检测总IgE相比，其敏感性更高。

权利要求

1.一种检测儿童哮喘的标志物，其特征在于，所述标志物为GATA3基因5’启动子的SNP

290G/A位点，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

说明书

一种检测儿童哮喘的标志物及引物

技术领域

[0001] 本发明属于儿童哮喘辅助诊断技术领域，具体涉及一种检测儿童哮喘的标志物及引物。

背景技术

[0002] 支气管哮喘是当前世界威胁公共健康最常见的慢性肺部疾病，哮喘的发生可影响人类各年龄层，可在婴幼儿起病，并以儿童多发。2009年全球哮喘防治创议(GINA)指出，近20年来各年龄段哮喘发病率明显升高，尤其是儿童。20世纪90年代对我国0～14岁儿童[1]
哮喘患病情况的抽样调查显示，我国儿童哮喘患病率为0.11％～2.03％ ，而2000年的调查显示，我国儿童哮喘患病率为0.25％～4.63％，因此，我国儿童哮喘的发病情况同样严[2]
峻 。哮喘不仅严重危害儿童的健康成长，对其整个一生的生存质量产生远期影响，而且给我国带来沉重的经济损失和社会负担，影响社会稳定和国民经济的可持续发展。

[0003] 哮喘的病因和发病机制十分复杂，是免疫、遗传和环境因素综合作用的结果。一般认为哮喘在儿童5岁左右有两个发病高峰。临床上大多数患者是从隐匿发病开始，逐渐加重的。儿童因年龄、生理解剖、免疫功能、变应原接触量、环境情况等因素致喘，致喘因素复[3]杂，故儿童哮喘在发作诱因、频度、轻重上不同于成人 。儿童哮喘诊断主要有以下几点难点：：1、儿童哮喘的诊断需除外其他疾病，但要除外的疾病种类相当庞大，需要临床工作者丰富的工作经验和审慎的工作态度。2、5岁以下的儿童肺功能测定及支气管激发试验难于开展，加大了儿童哮喘的诊断难度。3、对反复喘息的认识有一定难度，如对患儿既往喘息次数的正确掌握应该依据医疗病历记载而并非家长主诉，但在我国许多家 长特别是来自农村的家长对医疗病历保管不当经常遗失，因此对患儿既往喘息情况不得而知。诊断主要依据症状、体征，缺乏诊断方法和指标的金标准。特应性变应原检测、总IgE和特异性IgE的检测、肺功能的检测、支气管舒张试验和支气管激发试验(后3项检查尤其适用于5岁以上儿童)对儿童哮喘的诊断具有重要的作用，但并非所有患儿均具有上述指标异常。

[0004] 因此，迫切需要更好的早期检测儿童哮喘的方法。哮喘候选基因研究表明基因的多态性特征与儿童哮喘的易感性及哮喘严重程度相关，遗传度为70％～80％，存在显著的[4-5]种族差异 。目前报道有25条与哮喘相关的候选基因，其中部分候选基因的SNP与呼吸[6]
系统疾病相关，并在呼吸系统中发挥重要作用 。通过对哮喘相关候选基因SNP与儿童哮喘易感性的研究，能够为儿童哮喘的诊断、预防与治疗提供技术支撑。因此，对于儿童哮喘的早期诊断及靶向治疗具有重要意义。

[0005] GATA3是1993年发现的一种细胞谱系特异性因子，属于GATA转录因子家族[7]，是T细胞发育中最重要的转录调节因子之一，已确定它为早期定向的T细胞和双阴性胸腺细胞的发育和存活所必需。Th2细胞因子的转录都需要GATA3的参与。通过反义寡核苷酸特异性阻断GATA3表达可以抑制哮喘小鼠气道炎症、BALF和肺间质中Th2细胞因子的数量和[8]AHR 。因此，GATA3在哮喘发病过程中也起着重要作用。但GATA3基因多态性与哮喘的关系还尚未被广泛研究。仅有研究发现GATA3基因多态性在芬兰人群中与伴有高水平IgE的[8] [9]
哮喘患者相关 ，而GATA3基因的多态性与德国哮喘儿童没有相关性 。这与研究选取的SNP位点均位于基因的内含子区和基因的非翻译区(3’-UTR)可能有关。因此，进一步发现和探讨GATA3基因的多态性与我国儿童哮喘的关联对儿童哮喘的早期诊断及靶向治疗具有重要意义。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供所设计的特异性检测GATA3的5’启动子区SNP290G/A位点的引物。

[0007] 本发明的目的还在于在于提供所设计的检测GATA3的5’启动子区的SNP290G/A位点的靶序列。

[0008] 本发明通过Haploview4.1下载中国人(CHB+JPT)GATA3基因5’启动子区域SNPs，2
并参考美国国家生物技术信息中心(NCBI)SNP数据库，设MAF大于5％、r大于0.8，筛选该基因的标签SNP。选定1个与调控转录活性密切相关的位于GATA3基因5’启动子的SNP290G/A。

[0009] 一种检测儿童哮喘的标志物，所述标志物为GATA3基因5’启动子的SNP290G/A位点，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，长度为584bp。

[0010] 一种检测儿童哮喘标志物的引物，所述引物包括上游引物F1和下游引物R1，上游引物F1的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示，下游引物R1的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

[0011] 上述引物在制备检测儿童哮喘的试剂盒中的应用。

[0012] 本发明的有益效果：本发明通过从哮喘组儿童血液中提取基因组DNA，采用PCR方法分析了GATA3基因5’启动子区的SNP290G/A位点的基因型，并与中国北京汉族儿童哮喘的关系进行了评估。关联性研究结果显示，GATA3基因的SNP290G/A单核苷酸多态性与北京地区儿童哮喘相关，是儿童哮喘的高风险因素，与检测总IgE相比，其敏感性更高。

附图说明

[0013] 图1 GATA3基因的SNP290G/A的PCR结果；

[0014] 其中，1-12为以哮喘组基因组DNA为模板的PCR产物；M为DL2000分子量标准(由下至上分别为100、250、500、750、1000和2000bp)。

具体实施方式

[0015] 下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步说明。

[0016] 实施例1：哮喘患儿及对照的选择

[0017] 按照儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2008年修订)的诊断标准，在儿童医院呼吸科及首都儿科研究所，由临床医生选择符合标准的哮喘患儿，年龄≤15岁，共230例患儿。选取与哮喘组儿童年龄、性别、相匹配的健康儿童205例作为对照组。

[0018] 病例的判定依据儿童年龄选择不同的判定标准：

[0019] 婴幼儿哮喘诊断标准：(1)年龄＜3岁，喘息发作≥3次；(2)发作时双肺闻及呼气相哮鸣音，呼气相延长；(3)具有特应性体质，如过敏性湿疹、过敏性鼻炎等；(4)父母有哮喘病史或其他过敏史；(5)除外其他引起喘息的疾病。凡具有(1)、(2)、(5)条即可诊断哮喘。如喘息发作2次，并具有第(2)、(5)条，诊断为可疑哮喘或喘息性支气管炎(＜3岁)。如同时具有第(3)和/或第(4)条时，可考虑给予哮喘治疗性诊断。

[0020] 儿童哮喘的诊断标准：(1)年龄≥3岁，喘息呈反复发作者(如发作1次，若可追溯与某种变应原或刺激因素有关，亦可考虑)；(2)发作时双肺闻及以呼气相为主的哮鸣音，呼气相延长；(3)支气管扩张剂有明显的疗效；(4)除外其他引起喘息的疾病。

[0021] 实施例2：血样的收集及生物指标的检测

[0022] 抽取研究对象静脉血检测血清中总IgE，该部分检测工作由医院协助完成。

[0023] 分析方法：采用免疫印迹法定量检测血清中总IgE水平。

[0024] 具体操作方法：抽取病人静脉血1ml，分离血清，取250μL与吸附有特异性过敏原的硝酸纤维素膜于反应槽内室温孵育45min，洗涤后加入标记了生物素的抗人IgE抗体，室温孵育45min，洗脱未结合的二抗，加入结合有碱性磷酸酶标记的链霉亲和素，再室温孵育20min，洗去未结合酶，加入底物显色。所有孵育在混匀器(120次振/min)上完成。显色深浅与血清中sIgE含量成正比，通过CCD相机照相，将结果导入软件系统，并计算出总IgE的分级和浓度数值(IU/ml)。

[0025] 实施例3：血样采集与保存

[0026] 抽取静脉血1ml至EDTA抗凝管中，颠倒混匀，防止血液凝结成块。将血转至1.5ml离心管中，2000rpm离心10分钟，留下层血浆用于DNA的提取。如果不能当天对抽取的血样进行基因组DNA的提取，一周之内进行提取的血样可置于冰箱4℃存放，一个月之内进行提取的血样需要置于冰箱-20℃存放，时间更长进行提取的血样则应放置于-70℃冰箱储存。

[0027] 实施例4：提取基因组DNA

[0028] 按照博迈德生物科技有限公司生产全血基因组DNA提取试剂盒说明书的步骤进行DNA的提取，并对提取的DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，利用紫外分光光度仪检测其浓度。

[0029] 实施例5：引物设计

[0030] 从NCBI基因库中下载所研究的GATA3基因5’启动子的SNP290G/A位点所在基因的序列，利用GeneTool2.0软件在选定SNPs位点的上下游分别设计PCR引物，上游引物为F1：5′GGGCTGGTTTCCTTGACTGTGG3′(SEQ ID No.2)，下游引物为R1：5′GCGCTCTGGCCCTTTAAATGTG3′(SEQ ID No.3)。设计好的引物由MerMade192DNA合成仪采用固相亚磷酰胺三酯法合成，合 成完毕的引物干粉用灭菌的双蒸水溶解，使用浓度为
20nmol。

[0031] 实施例6：PCR反应及结果分析方法

[0032] 采用PCR方法，操作步骤如下：

[0033] 以提取的基因组DNA为模板，模板为1μl，用相应GATA3基因5’启动子的SNP290G/A基因引物(f1和r1)进行PCR反应，反应体系(50μL)如下：

[0034]

[0035] PCR反应条件为：94℃预变性5min；循环过程为94℃30s，58℃30s，72℃50s，35个循环；最后在72℃延伸5min。取1μl的PCR产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测，目的条带大小为584bp。目测估计目的条带的浓度，如果浓度达到100μg/μl，可送公司进行测序。并用凝胶成像系统照相(图1)。

[0036] 实施例7：SNP的分析

[0037] 利用GeneTool2.0分析软件对测序结果与标准序列进行比对，同时查看测序彩图，观察是否在目标SNP位点存在单核苷酸多态性。在测序彩图上，如果检测位点处为单峰，表明该位点为纯合，如果是双峰表明该位点为杂合。对于SNP290G/A，如果在测序结果的290位是G(或A)单峰，则该位点为GG(或AA)纯合基因型，如果是G和A的杂合双峰，则该位点为GA杂合基因型。

[0038] 实施例8：SNP与哮喘易感性的分析

[0039] 8.1利用SAS9.0软件通过chisq分析和logistic stepwise分析各基因型与儿童哮喘之间的关系，以P＜0.05判定该基因型为哮喘的高风险因素。本研究结果显示，哮喘儿童与对照儿童的SNP290G/A基因频率的分析显示，二者的基因频率存在显著差异，基因A的频率显著低于正常对照(表1)；经显性、隐性、超显性及逻辑加模型拟合，哮喘儿童与正常对照的SNP290G/A的纯合基因型GG频率存在显著差异，GG基因型患哮喘的风险显著高于对照(OR为10.0132，P＜.0001)，哮喘儿童携带GA杂合基因型的频率显著低于正常对照(OR为0.0999，P＜.0001)(表2)，表明携带GG纯合子是哮喘的一个高风险因素，因此可以用来进行哮喘病的辅助诊断。

[0040] 8.2哮喘儿童中检测总IgE水平与检测GATA3基因SNP290GG纯合子基因型的比较，按总IgE水平的高低分成三级，＜100IU/ml的为正常，在100-200IU/ml之间的为增加，＞200IU/ml为显著增加。比较在哮喘组儿童GATA3基因SNP290GG纯合子基因型及总IgE水平升高百分比，本组有11例(27.3％)哮喘儿童IgE正常，总IgE水平升高占90.1％，而GATA3基因SNP290GG纯合子基因型占97.3％。卡方分析两种检测方法均有显著差异(P＜0.001)(表3)。说明GATA3基因SNP290GG纯合子基因型在哮喘反应中较总IgE检测更为敏感，因此可以用来进行哮喘病的辅助诊断。

[0041] 表1 GATA3的5’启动子区的SNPs的等位基因频率

[0042]

[0043] 表2 哮喘儿童与对照儿童SNP290G/A的基因型分析

[0044]

[0045] 表3.哮喘组儿童中检测总IgE水平与检测GATA3基因SNP290基因型的比较[0046]

[0047] 注：1表示GATA3基因SNP290GG纯合子基因型所占哮喘组百分比。

[0048] 2表示总IgE升高所占哮喘组百分比。

[0049] 参考文献

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