一种马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法

摘要

本发明公开了一种马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法：（1）、提取马氏珠母贝基因组DNA；（2）、双酶切基因组DNA并与引物接头进行连接；（3）、建立预扩增反应体系和反应程序（4）、建立选择扩增反应体系和反应程序（5）、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。本发明的马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法可为开展马氏珠母贝DNA甲基化遗传机理研究、基因表达的DNA甲基化调控及外界环境变化引起DNA甲基化变化提供分析依据。本发明适用于马氏珠母贝种质分析及鉴定、DNA甲基化分子标记开发、基因表达与DNA甲基化关联分析。

权利要求

1.一种马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)、提取马氏珠母贝基因组DNA；

(2)、将步骤(1)的基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与引物接头进行连接，得到连接产物；所述的双酶切，其反应体系为：300ng DNA,5U Hpa Ⅱ或5U Msp Ⅰ，TM

5U EcoR Ⅰ，2μl 10×Buffer Tango ，加ddH2O至总体积为20μl，酶切时间为4h，酶切后70℃温浴15min；所述的将得到的酶切产物与引物接头进行连接，其反应体系为：5μl酶切产物，50pmol HM接头，10pmol EcoRⅠ接头，0.5μl T4 DNA ligase，4μl 10×T4 DNA ligase Buffer,加ddH2O至20μl，16℃连接过夜；所述的HM接头，其左引物为：

5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’，右引物为：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’；所述的EcoR Ⅰ接头，其左引物为：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，右引物为：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；

(3)、建立预扩增反应体系和反应程序，预扩增步骤(2)的连接产物得到预扩增产物；

所述的预扩增反应体系为：Premix Ex Taq 10.5μl，稀释10倍的连接产物1μl，20pmol/μl的引物EcoR Ⅰ+A 1μl，20pmol/μl的引物HM+T 1μl，加ddH2O 6.5μl，体系为

20μl；所述的反应程序为：94℃5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min 20个循环；最后

72℃10min；所述的引物EcoR Ⅰ+A为：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’，所述的引物HM+T为：

5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGT-3’；

(4)、建立选择扩增反应体系和反应程序，扩增步骤(3)的预扩增产物得到PCR产物；

所述的选择扩增反应体系为：Premix Ex Taq 10.5μl，稀释10倍的预扩增产物1μl，

20pmol/μl选择扩增引物En 0.5μl，其选择性碱基个数为3，20pmol/μl选择扩增引物HMn 2μl，其选择性碱基个数为2或3，加ddH2O 6μl，体系为20μl；所述的反应程序为：第一步为94℃30s，65℃30s，72℃1min，13个循环，每个循环降低0.7℃，直至降到56℃；第二步为94℃30s，56℃30s，72℃1min，27个循环；最后72℃5min；所述的选择扩增引物En序列为：5’-GACTGCGTACCAATTCAXX-3’或5’-GACTGCGTACCAATTCAX-3’，选择扩增引物HMn序列为：5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTXX-3’或5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTX-3’，引物序列中X代表A，T，C，G四种碱基中的任意一种；

(5)、将步骤(4)的PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色，所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，其步骤为：将PCR产物按照体积比为3:1的比例加入甲酰胺上样缓冲液，然后95℃加热变性10min，每管取3μl上样于6％SDS-PAGE凝胶并200V电泳3h至溴酚蓝指示带到达凝胶底部为止；所述的银染显色，包括以下步骤：(1)、用双蒸水将用于染色的塑料盘及胶板进行冲洗；(2)、将SDS-PAGE凝胶取下放入500ml双蒸水中并在摇床中30r/min摇动漂洗90s；(3)、用双蒸水配制的2.5％的乙醇溶液固定5min；(4)、分别用250ml的双蒸水漂洗2次，每次45s；(5)、用0.8％硝酸水溶液浸泡5min；(6)、分别用

250ml的双蒸水漂洗2次，每次45s；(7)、用双蒸水配制的0.5％硝酸银溶液在摇床上30r/min摇动染色12min；(8)、双蒸水漂洗40s；(9)、配制显色液：含无水碳酸钠20g、37％甲醛

500μl、20mg/ml硫代硫酸钠溶液500μl，加双蒸水至总体积为1L，经冰预冷后用于显色；

(10)、待条带显现后倒尽显色液并用500ml双蒸水漂洗SDS-PAGE凝胶停止显色；(11)、拍照。

说明书

一种马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子标记技术的建立方法，具体涉及一种马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法。

背景技术

[0002] 马氏珠母贝是世界上海水珍珠培育的主要种类，广泛分布于我国南方海区。由于长期存在的不科学育种方法、海区无序养殖及环境胁迫等共同影响，马氏珠母贝种质资源出现退化，普遍存在亲贝生长慢、易发病、个体变小、珍珠质量下降等问题。对马氏珠母贝进行遗传改良、培育抗病抗逆性强的新品种是解决上述问题的主要途径之一。在马氏珠母贝遗传育种改良方面已经开展了染色体组型研究、同属不同种间的杂交育种、多倍体育种、选择育种和种群间杂交育种结合分子标记辅助育种等工作，其中将传统的杂交育种技术同不断发展的生物技术结合来获得优良性状是遗传改良的工作重点。目前虽然已在马氏珠母贝遗传育种改良方面开展了大量相关工作，但是从DNA甲基化这一表观遗传调控层面出发并应用于分子标记辅助育种方面的研究尚未见报导。

[0003] DNA甲基化是最早发现的表观遗传修饰途径之一，能引起染色质结构、DNA构象、DNA稳定性及DNA与蛋白质相互作用方式的改变，进而影响基因表达，是大多数生物体生长发育过程中不可缺少的一部分。甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术是一种对基因组DNA甲基化进行分析的相对简单且较常用的方法。根据Hpa Ⅱ及Msp Ⅰ这两种酶对基因组中“5’-CCGG-3’”位点中胞嘧啶甲基化状态不同而具有不同的酶切活性，可以酶切产生多态性的DNA片段并最终通过比较PCR扩增产物电泳图谱来分析DNA甲基化状况。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种客观、科学、准确的马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法。该方法可以获得银染背景低、目的条带清晰的DNA甲基化图谱，具有甲基化位点易于检测的优点且可在未知基因组序列的情况下对全基因组甲基化开展研究。

[0005] 本发明的马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法，包括以下步骤：

[0006] （1）、提取马氏珠母贝基因组DNA；

[0007] （2）、将步骤（1）的基因组DNA双酶切得到酶切产物，将得到的酶切产物与引物接头进行连接，得到连接产物；

[0008] （3）、建立预扩增反应体系和反应程序，预扩增步骤（2）的连接产物得到预扩增产物；

[0009] （4）、建立选择扩增反应体系和反应程序，扩增步骤（3）的预扩增产物得到PCR产物；

[0010] （5）、将步骤（4）的PCR产物进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色。

[0011] 步骤（2）中所述的双酶切，反应体系优选为：300ng DNA,5U Hpa Ⅱ或5U Msp Ⅰ，TM5U EcoR Ⅰ，2μl10×Buffer Tango ，加ddH2O至总体积为20μl；酶切时间优选为0～
16h，且酶切后70℃温浴15min使酶失活。

[0012] 上述酶切时间，优选为4h。

[0013] 步骤（2）中所述的将得到的酶切产物与引物接头进行连接，反应体系优选为：5μl酶 切产 物，50pmol HM接头，10pmol EcoR Ⅰ接 头，0.5μl T4DNA ligase，4μl10×T4DNA ligase Buffer,加ddH2O至20μl，16℃连接过夜。所述的HM接头，其左引物为：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’，右引物为：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’；所述的EcoR Ⅰ接头，其左引物为：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，右引物为：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’。

[0014] 步骤（3）中所述的预扩增反应体系，优选为：Premix Ex Taq（组成为：Takara Ex2+
Taq1.25U/25μl，dNTP mixture2×conc.，各0.4mM；Ex Taq Buffer2×conc.，含4mM Mg ）
10.5μl，稀释0～50倍的连接产物1μl，20pmol/μl的引物EcoR Ⅰ+A1μl，20pmol/μl的引物HM+T1μl，加ddH2O6.5μl，体系为20μl；所述的反应程序，优选为：94℃5min；
94℃30s，56℃30s，72℃1min20～35个循环；最后72℃10min。所述的引物EcoR Ⅰ+A为：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’，所述的引物HM+T为：5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGT-3’。

[0015] 上述预扩增反应体系中的稀释0～50倍的连接产物，优选为稀释10倍的连接产物；预扩增反应程序中的循环，优选20个循环。

[0016] 步骤（4）中所述的选择扩增反应体系，优选为：Premix Ex Taq（组成为：Takara Ex2+
Taq 1.25U/25μl；dNTP mixture2×conc.，各0.4mM；Ex Taq Buffer2×conc.，含4mM Mg ）
10.5μl，稀释0～100倍的预扩增产物1μl，20pmol/μl选择扩增引物En0.25～0.5μl，
20pmol/μl选择扩增引物HMn1～2μl，加水6μl，体系为20μl；所述的反应程序，优选为：第一步为13个循环（94℃30s；65℃30s；72℃1min），每个循环降低0.7℃，直至降到
56℃；第二步20～35个循环（94℃30s；56℃30s；72℃1min）；最后72℃5min；所述的选择扩增引物En序列为：5’-GACTGCGTACCAATTCAXX-3’或5’-GACTGCGTACCAATTCAX-3’，选择扩增引物HMn序列为：5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTXX-3’或5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTX-3’（引物序列中X代表A，T，C，G四种碱基中的任意一种）。

[0017] 上述选择扩增反应中的稀释0～100倍的预扩增产物，优选为稀释10倍的预扩增产物；20pmol/μl选择扩增引物En优选为0.5μl，其选择性碱基个数优选为3，20pmol/μl选择扩增引物HMn优选为2μl，其选择性碱基个数优选为2或3；选择扩增反应程序中第二步优选27个循环。

[0018] 步骤（5）中所述的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，优选：将PCR产物按照体积比为3:1的比例加入甲酰胺上样缓冲液，然后95℃加热变性10min，每管取3μl上样于6%SDS-PAGE凝胶并200V电泳3h至溴酚蓝指示带到达凝胶底部为止。

[0019] 步骤（5）中所述的银染显色，优选，包括以下步骤：（1）、用双蒸水将用于染色的塑料盘及胶板进行冲洗；（2）、将SDS-PAGE凝胶取下放入500ml双蒸水中并在摇床中30r/min摇动漂洗90s；（3）、用双蒸水配制的2.5%的乙醇溶液固定5min；（4）、分别用250ml的双蒸水漂洗2次，每次45s；（5）、用0.8%硝酸水溶液浸泡5min；（6）、分别用250ml的双蒸水漂洗2次，每次45s；（7）、用双蒸水配制的0.5%硝酸银溶液在摇床上30r/min摇动染色12min；
（8）、双蒸水漂洗40s；（9）、配制显色液：含无水碳酸钠20g、37%甲醛500μl、20mg/ml硫代硫酸钠溶液500μl，加双蒸水至总体积为1L，经冰预冷后用于显色；（10）、待条带显现后倒尽显色液并用500ml双蒸水漂洗SDS-PAGE凝胶停止显色；（11）、拍照。

[0020] 本发明的马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法，在提取了马氏珠母贝基因组DNA并检测质量后分别优化了双酶切时间及酶量、预扩增模板浓度及扩增反应程序、选择扩增模板浓度和引物用量、引物选择性碱基个数及选择扩增反应程序、银染时间及银染试剂的组成，确定了酶切体系及时间、预扩增及选择扩增的扩增反应体系及反应程序、PCR产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色的条件。

[0021] 本发明的马氏珠母贝MSAP技术体系的建立方法可为开展马氏珠母贝DNA甲基化遗传机理研究、基因表达的DNA甲基化调控及外界环境变化引起DNA甲基化变化提供分析依据。本发明适用于马氏珠母贝种质分析及鉴定、DNA甲基化分子标记开发、基因表达与DNA甲基化关联分析。

[0022] 本发明建立了一种客观、科学、准确的马氏珠母贝DNA甲基化分析技术体系，可以获得银染背景低、目的条带清晰的DNA甲基化图谱，具有可在未知基因组序列的情况下对全基因组甲基化开展研究且甲基化位点易于检测的优点。

附图说明

[0023] 图1是马氏珠母贝MSAP技术预扩增琼脂凝胶电泳图，其中，泳道Marker为100bp的Marker，条带从小到大依次为100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1500、2000、3000bp，泳道1～12依次为6个不同马氏珠母贝个体基因组DNA经双酶切后的预扩增产物，预扩增模板为稀释10倍的连接产物、预扩增循环数为20；其中泳道1、3、5、7、
9、11为经EcoR Ⅰ和Msp Ⅰ双酶切后的基因组DNA的预扩增产物，泳道2、4、6、8、10、12为经EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ双酶切后的基因组DNA的预扩增产物；

[0024] 图2是马氏珠母贝MSAP技术选择扩增SDS-PAGE电泳图，其中，箭头所示为DNA甲基化多态性扩增条带。

具体实施方式

[0025] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。下列实施例中未注明具体实验条件和方法，所采用的技术手段通常为本领域技术人员所熟知的常规手段。

[0026] 实施例1：

[0027] 一、马氏珠母贝基因组DNA的提取及质量检测

[0028] 采用软体动物DNA提取试剂盒（购自Omega Bio-Tek公司）提取马氏珠母贝基因组DNA的提取，选取的组织为马氏珠母贝闭壳肌。选择OD260/OD280为1.7～1.9之间的DNA作为双酶切的样品，用于双酶切的每份DNA样品的总量为300ng。

[0029] 二、基因组DNA双酶切及与引物接头进行连接

[0030] 用EcoR Ⅰ和Msp Ⅰ，EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ对两份DNA样品分别进行双酶切反应。对酶切反应时间进行优化：两份DNA样品分别进行0h，2h，4h，6h，8h，10h和16h酶切实验以寻找最佳酶切时间，酶切后70℃温浴15min使酶失活，分别得到两份酶切产物。结果表明4h酶切时间能保证酶切充分且耗时少。

[0031] 引物接头退火实验：EcoR Ⅰ接头（10pmol/μl）：等体积的10pmol/μl EcoR Ⅰ接头左引物及10pmol/μl EcoR Ⅰ接头右引物混合后退火；HM接头（50pmol/μl）：等体积的50pmol/μlHM接头左引物及50pmol/μl HM接头右引物混合后退火；退火程序：94℃10min后冷却至室温。接头引物序列分别为：EcoR Ⅰ接头左引物：5’-CTCGTAGACTGCGTACC-3’，EcoR Ⅰ接头右引物：5’-AATTGGTACGCAGTCTAC-3’；HM接头左引物：5’-GATCATGAGTCCTGCT-3’；HM接头右引物：5’-CGAGCAGGACTCATGA-3’。

[0032] 分别将两份酶切4h后的酶切产物与引物接头进行连接，连接反应体系为：4μl双酶切产物，50pmol HM接头，10pmol EcoR Ⅰ接头，T4DNA ligase（购自宝生物工程(大连)有限公司）（350U/μl）分别为0.5μl、1μl，4μl10×T4DNA liagase buffer，加ddH2O至总体积为20μl，16℃连接过夜，得到两种连接产物。通过预扩增检验效果显示不同酶用量差别不大，为节约起见采用0.5μl酶用量。

[0033] 三、预扩增反应体系和反应程序的建立

[0034] 将上述两种连接产物分别设立不稀释、稀释10倍、稀释20倍、稀释30倍、稀释50倍共5种处理，用于预扩增反应。预扩增反应体系20μl：Premix Ex Taq（购自Takara公司）（组成为：Takara Ex Taq1.25U/25μl；dNTP mixture2×conc.，各0.4mM；2+
Ex Taq Buffer2×conc.，含4mM Mg ）10.5μl，连接产物1μl，20pmol/μl引物EcoR Ⅰ+A1μl，20pmol/μl引物HM+T1μl，加ddH2O6.5μl。反应程序为：94℃5min；94℃30s，
56℃30s，72℃1min，循环数分别设20、25、30、35共4种；最后72℃10min，得到预扩增产物。结果显示连接产物稀释10倍作预扩增模板，反应程序采用20个循环的组合效果最佳，结果如图1所示。预扩增引物分别为：EcoR Ⅰ+A：5’-GACTGCGTACCAATTCA-3’，HM+T：
5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGT-3’。

[0035] 四、选择扩增反应体系和反应程序的建立

[0036] 对上述以稀释10倍连接产物做模板、采用20个循环得到的预扩增产物分别设立不稀释、稀释10倍、稀释20倍、稀释30倍、稀释50倍、稀释100倍共6种处理。选择扩增反应体系20μl：Premix Ex Taq（购自Takara公司）（组成为：Takara Ex Taq1.25U/25μl；2+
dNTP mixture2×conc.，各 0.4mM；Ex Taq Buffer2×conc.，含4mM Mg ）10.5μl，预扩增产物1μl，20pmol/μl的选择扩增引物En0.5μl，20pmol/μl的选择扩增引物HMn2μl（选择扩增引物En分别设计为：EcoR Ⅰ+3个选择性碱基，EcoR Ⅰ+2个选择性碱基；选择扩增引物HMn分别设计为：HM+3个选择性碱基，HM+2个选择性碱基；选择扩增引物用量设置两种组合：1、20pmol/μl选择扩增引物En0.5μl，20pmol/μl选择扩增引物HMn2μl；2、20pmol/μl选择扩增引物En0.25μl，20pmol/μl选择扩增引物HMn1μl），加ddH2O6μl。反应程序包括两步：第一步为13个循环（94℃30s；65℃30s；
72℃1min），每个循环降低0.7℃，直至56℃。第二步分别设置20、23、27、30、35共5种循环（94℃30s；56℃30s；72℃1min），最后72℃5min，得到PCR产物。结果表明采用稀释
10倍的预扩增产物1μl，20pmol/μl的选择扩增引物En0.5μl，20pmol/μl的选择扩增引物HMn2μl，PCR反应程序第二部循环数采用27时效果最佳；对以上四种类型的引物分别进行组合SDS-PAGE电泳及银染检测表明其中EcoRⅠ+3个选择性碱基同HM+3个选择性碱基以及EcoRⅠ+3个选择性碱基同HM+2个选择性碱基这两组引物组合适合MSAP技术体系。EcoR Ⅰ+3引物序列为：5’-GACTGCGTACCAATTCAXX-3’，EcoR Ⅰ+2引物序列为
5’-GACTGCGTACCAATTCAX-3’，HM+3引物序列为：5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTXX-3’，HM+2引物序列为：5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTX-3’（引物序列中X代表A，T，C，G四种碱基中的任意一种）。

[0037] 五、变性聚丙烯酰胺凝胶电泳及银染显色

[0038] 将上述以稀释10倍预扩增产物为模板、采用20pmol/μl的选择扩增引物En0.5μl（EcoR Ⅰ+3个选择性碱基引物）和20pmol/μl的选择扩增引物HMn2μl（HM+2个选择性碱基引物或HM+3个选择性碱基引物）、PCR反应程序第二部循环数采用27得到的PCR产物分别按照体积比为3:1的比例加入甲酰胺上样缓冲液，然后95℃加热变性10min，每管取3μl上样于6%SDS-PAGE凝胶并200V电泳3h至溴酚蓝指示带到达凝胶底部为止。

[0039] 银染显色：（1）、用双蒸水将用于染色的塑料盘及胶板进行冲洗；（2）、将上述SDS-PAGE凝胶取下放入500ml双蒸水中并在摇床中30r/min摇动漂洗90s；（3）、用双蒸水配制的2.5%的乙醇溶液固定5min；（4）、分别用250ml的双蒸水漂洗2次，每次45s；（5）、用0.8%硝酸水溶液浸泡5min；（6）、分别用250ml的双蒸水漂洗2次，每次45s；
（7）、用双蒸水配制的0.5%硝酸银溶液在摇床上30r/min摇动染色12min；（8）、双蒸水漂洗40s；（9）、配制显色液：含无水碳酸钠20g、37%甲醛500μl、20mg/ml硫代硫酸钠溶液
500μl，加双蒸水至总体积为1L，经冰预冷后用于显色；（10）、待条带显现后倒尽显色液并用500ml双蒸水漂洗SDS-PAGE凝胶停止显色；（11）、拍照并记录实验结果。结果如图2所示，泳道1、3、5、7对应为基因组DNA经EcoR Ⅰ和Msp Ⅰ双酶切并经选择扩增的产物，泳道2、4、6、8对应为基因组DNA经EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ双酶切并经选择扩增的产物；泳道1、
2所用选择扩增引物为：EcoR Ⅰ+3个选择性碱基引物（5’-GACTGCGTACCAATTCATC-3’）和HM+3个选择性碱基引物（5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTAG-3’）；泳道3、4所用选择扩增引物为：EcoR Ⅰ+3个选择性碱基引物（5’-GACTGCGTACCAATTCATT-3’）和HM+2个选择性碱基引物（5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTT-3’）；泳道5、6所用选择扩增引物为：
EcoR Ⅰ+3个选择性碱基引物（5’-GACTGCGTACCAATTCATA-3’）和HM+3个选择性碱基引物（5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTCC-3’）；泳道7、8所用选择扩增引物为：EcoR Ⅰ（5’-GACTGCGTACCAATTCACG-3’）+3个选择性碱基引物和HM+2个选择性碱基引物（5’-ATCATGAGTCCTGCTCGGTA-3’）。从图2可以看到清晰的DNA甲基化多态性扩增条带。