大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途

摘要

大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途，它涉及大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途。本发明是要解决现有心气虚证大鼠模型缺少统一、量化、特异性强、快速和无创伤的评价方法的问题，本发明的评价方法为：采用UPLC-HDMS仪器采集心气虚证大鼠模型中大鼠尿液，通过markerlynx软件分析大鼠尿液中17个生物标记物的含量；17个生物标记物的含量符合要求，则心气虚证动物模型成功。本发明通过机体终端产物尿液中内源性生物标记物含量的变化，评价心气虚大鼠模型，从而建立全面统一评价机体变化，可量化，与传统取血检测生化指标或取脏器观察病理切片相比，具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点。

权利要求

1.大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途，其特征在于所述的17个生物标记物用于建立心气虚证大鼠模型；所述的17个生物标记物为3-Oxohexadecanoic acid、7-Ketodeoxycholic acid、3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、Glyceric acid 1,3-biphosphate、3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、

13S-hydroxyoctadecadienoic acid、L-Carnitine、3-Hydroxyoctadecanoic acid、Uric acid、Tetracosatetraenoic acid、12(13)Ep-9-KODE、Stearic acid、α-dimorphecolic、

9,10,13-TriHOME、9-HODE，9,12,13-TriHOME和3-Hydroxykynurenine；

其中，17个生物标记物用于建立气虚证大鼠模型的方法如下：采用UPLC-HDMS仪器采集心气虚证大鼠模型中大鼠尿液，通过markerlynx软件分析大鼠尿液中17个生物标记物的含量；

若模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到380～

420；

7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到230～270；

3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到130～

170；

Glyceric acid 1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到80～120；

3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到80～

120；

13S-hydroxyoctadecadienoic acid的含量从正常大鼠的150下降到80～120；

L-Carnitine的含量从正常大鼠的300下降到180～220；

3-Hydroxyoctadecanoic acid的含量从正常大鼠的50下降到10～20；

Uric acid的含量从正常大鼠的100下降到20～30；

Tetracosatetraenoic acid的含量从正常大鼠的20下降到0～0.5；

12(13)Ep-9-KODE的含量从正常大鼠的30下降到10～20；

Stearic acid的含量从正常大鼠的100下降到60～100；

α-dimorphecolic的含量从正常大鼠的1750下降到180～220；

9,10,13-TriHOME的含量从正常大鼠的1250下降到0～0.5；

9-HODE的含量从正常大鼠的500下降到0～0.5；

9,12,13-TriHOME的含量从正常大鼠的500下降到0～0.5；

3-Hydroxykynurenine的含量从正常大鼠的250下降到0～0.5，则心气虚证动物模型成功。

2.根据权利要求1所述的大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途，其特征在于所述的

17个生物标记物用于建立气虚证大鼠模型的方法如下：采用UPLC-HDMS仪器采集心气虚证大鼠模型中大鼠尿液，通过markerlynx软件分析大鼠尿液中17个生物标记物的含量；

若模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到400；

7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到250；

3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到150；

Glyceric acid 1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到100；

3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到100；

13S-hydroxyoctadecadienoic acid的含量从正常大鼠的150下降到100；

L-Carnitine的含量从正常大鼠的300下降到200；

3-Hydroxyoctadecanoic acid的含量从正常大鼠的50下降到20；

Uric acid的含量从正常大鼠的100下降到30；

Tetracosatetraenoic acid的含量从正常大鼠的20下降到0；

12(13)Ep-9-KODE的含量从正常大鼠的30下降到20；

Stearic acid的含量从正常大鼠的100下降到80；

α-dimorphecolic的含量从正常大鼠的1750下降到200；

9,10,13-TriHOME的含量从正常大鼠的1250下降到0；

9-HODE的含量从正常大鼠的500下降到0；

9,12,13-TriHOME的含量从正常大鼠的500下降到0；

3-Hydroxykynurenine的含量从正常大鼠的250下降到0，则心气虚证动物模型成功。

说明书

大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途

技术领域

[0001] 本发明涉及大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途。

背景技术

[0002] 心气虚证作为胸痹的临床常见证型之一，严重威胁人类的健康，是近年来临床、科研热点关注的心系证候。为了更好的进行实验研究，推动临床治疗的进步，心气虚动物模型的复制评价成为技术关键。目前，临床诊断主要参照1990年中国中西医结合虚证与老年病专业委员会修订的“中医虚证辨证参考标准”，规定心气虚证的诊断标准为：气虚兼有心悸者。气虚的共性表现为疲乏、气短、舌质淡胖嫩或有齿印、脉沉细，或结代、促脉；动物实验中，除参考临床标准外，还采用心功能指标(最大心室内压、平均心室内压、心室峰压平均值、心率、平均+dp/dtmax、最小舒张压、舒张间期平均值、平均-dp/dtmax)，生化指标(cAMP、cGMP、血栓素、内皮素、血管紧张素II、心钠素、前列环素、肌钙蛋白、一氧化氮、一氧化氮合酶、TG、IgG、IgM、IgE等)，心肌病理指标(病理切片中心肌超微结构中线粒体的改变)对心气虚动物模型进行评价。以上方法主要是基于动物的外在表现包括毛色、体重、精神状态等以及现代西医学的诊断指标进行动物模型与临床病人的关联分析。显然，由于人与动物的巨大行为差异，不太可能通过“望、闻、问、切”等手段对动物模型的“证候”进行类似临床的诊断分析，而中医证与现代西医诊断指标之间的不确定性关系，导致基于病理、生化指标来评价心气虚证缺乏特异性及公信力。并且传统取血检测生化指标或取脏器观察病理切片评价方法需要较长时间，同时给模型动物带来创伤。目前尚缺少统一、量化、特异性强、快速、无创伤的心气虚证模型评价指标，对心气虚证模型评价标准化的要求更加迫切。

[0003] 大鼠在医学研究中作为实验动物的历史已较长，是医学实验研究中用途最广范和最常用的动物。能够评价治疗心气虚证的药物作用效果，且费用相对较低、周期相对较短。

发明内容

[0004] 本发明是要解决现有心气虚证大鼠模型缺少统一、量化、特异性强、快速和无创伤的评价方法的问题，提供了大鼠心气虚证17个生物标记物的新用途。

[0005] 本发明一种心气虚证大鼠模型的评价方法，是通过以下步骤进行的：采用UPLC-HDMS仪器采集心气虚证大鼠模型中大鼠尿液，通过markerlynx软件分析大鼠尿液中17个生物标记物的含量；

[0006] 其中17个生物标记物为3-Oxohexadecanoic acid、7-Ketodeoxycholic acid、3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、Glyceric acid 1,3-biphosphate、
3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、13S-hydroxyoctadecadienoic acid、L-Carnitine、3-Hydroxyoctadecanoic acid、Uric acid、Tetracosatetraenoic acid、
12(13)Ep-9-KODE、Stearic acid、α-dimorphecolic、9,10,13-TriHOME、9-HODE，
9,12,13-TriHOME和3-Hydroxykynurenine；

[0007] 若模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到380～420；

[0008] 7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到230～270；

[0009] 3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到130～170；

[0010] Glyceric acid 1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到80～120；

[0011] 3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到80～120；

[0012] 13S-hydroxyoctadecadienoic acid的含量从正常大鼠的150下降到80～120；

[0013] L-Carnitine的含量从正常大鼠的300下降到180～220；

[0014] 3-Hydroxyoctadecanoic acid的含量从正常大鼠的50下降到10～20；

[0015] Uric acid的含量从正常大鼠的100下降到20～30；

[0016] Tetracosatetraenoic acid的含量从正常大鼠的20下降到0～0.5；

[0017] 12(13)Ep-9-KODE的含量从正常大鼠的30下降到10～20；

[0018] Stearic acid的含量从正常大鼠的100下降到60～100；

[0019] α-dimorphecolic的含量从正常大鼠的1750下降到180～220；

[0020] 9,10,13-TriHOME的含量从正常大鼠的1250下降到0～0.5；

[0021] 9-HODE的含量从正常大鼠的500下降到0～0.5；

[0022] 9,12,13-TriHOME的含量从正常大鼠的500下降到0～0.5；

[0023] 3-Hydroxykynurenine的含量从正常大鼠的250下降到0～0.5，则心气虚证动物模型成功。

[0024] 本发明所利用的代谢组学技术手段被视为生物体整体功能状态的“生化表型”,能够即时、灵敏、真实表征在各种外界因素刺激下生物体整体功能状态的应答与调节,这与中医辨证通过“望、闻、问、切”等手段获得对人体整体功能状态的认识相一致，克服了中医凭借经验辩证及现代西医诊断指标与中医证之间的不确定性导致无法全面反映中医整体观的弊端。利用代谢组学技术方法找到大鼠心气虚模型生物标记物，本发明通过机体终端产物尿液中内源性生物标记物含量的变化，评价心气虚大鼠模型，从而建立全面统一评 价机体变化，可量化，同时针对心气虚证的特异性的模型评价方法。本发明利用代谢组学方法，对心气虚造模前及结束后大鼠尿液的ESI质谱代谢轮廓进行非监督型PCA分析，查看造模前后大鼠尿液代谢轮廓的变化轨迹；然后通过PLS-DA和OPLS-DA分析，分别观察正负离子扫描模式下的loading plot和S-plot，查找VIP值较大，载荷图中距离原点越远，对聚类分组的贡献较大的离子即为差异代谢物，可能成为潜在的生物标记物。利用masslynx软件系统所嵌套的element composition analysis和massfragment功能，结合Chemspider、HMDB等数据库，对潜在生物标记物的化学结构进行初步确认，最终鉴定出大鼠心气虚证模型的17个潜在生物标记物，分别是3-Oxohexadecanoic acid，7-Ketodeoxycholic acid，3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid，Glyceric acid1,3-biphosphate，3α,7α,1
2β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid，13S-hydroxyoctadecadienoic acid(13S-HODE)，L-Carnitine，3-Hydroxyoctadecanoic acid，Uric acid，Tetracosatetraenoic acid，
12(13)Ep-9-KODE，Stearic acid，α-dimorphecolic(9S-HODE)，9,10,13-TriHOME，
9-HODE，9,12,13-TriHOME及3-Hydroxykynurenine；同时阐明了17个生物标记物在不同组别的相对含量变化，在心气虚模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到400，7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到250，3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到150，Glyceric acid1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到100，3α,7α,12β-Trihydroxy-
5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到100，13S-hydroxyoctadecadienoic acid(13S-HODE)的含量从正常大鼠的150下降到100，L-Carnitine从正常大鼠的300下降到200，3-Hydroxyoctadecanoic acid从正常大鼠的50下降到20，Uric acid从正常大鼠的100下降到30，Tetracosatetraenoic acid从正常大鼠的20下降到0，12(13)Ep-9-KODE从正常大鼠的30下降到20，Stearic acid从正常大鼠的100下降到80，α-dimorphecolic(9S-HODE)从正常大鼠的1750下降到200，9,10,13-TriHOME从正常大鼠的1250下降到0，9-HODE从正常大鼠的500下降到0，9,12,13-TriHOME从正常大鼠的500下降到0，3-Hydroxykynurenine从正常大鼠的250下降到0。对17个生物标记物能成为心气虚模型大鼠尿液代谢组明显变化的关键代谢产物的有效性进行验证，发现造模前后尿液中17个生物标记物表达水平的变化一定程度上反映了心气虚模型大鼠尿液代谢轨迹变化趋势。本发明与传统取血检测生化指标或取脏器观察病理切片相比，具有高效、快速、无创伤、特异性强等优势。

附图说明

[0025] 图1为尿液代谢正离子模式所鉴定生物标记物不同组别的相对含量变化；其中POS_1的柱状图为3-Oxohexadecanoic acid的相对含量变化；POS_2的柱状图为7-Ketodeoxycholic acid的相对含量变化；POS_3的柱状图为3b,7b,12a-Trihydroxy-5b-cholanoic acid的相对含量变化；POS_4.Glyceric acid1,3-biphosphate的相对含量变化；POS_5的柱状图为3a,7a,12b-Trihydroxy-5b-cholanoic acid的相对含量变化；
POS_6的柱状图为13S-hydroxyoctadecadienoic acid(13S-HODE)的相对含量变化；POS_7的柱状图为L-Carnitine的相对含量变化；POS_8的柱状图为3-Hydroxyoctadecanoic acid的相对含量变化；POS_9的柱状图为Uric acid的相对含量变化；POS_10的柱状图为Tetracosatetraenoic acid的相对含量变化；POS_11的柱状图为12(13)Ep-9-KODE的相对含量变化；POS_12的柱状图为Stearic acid的相对含量变化；

[0026] 图2为空白组和模型组的尿液代谢负离子模式所鉴定生物标记物不同组别的相对含量变化；其中NEG_1的柱状图为α-dimorphecolic(9S-HODE)的相对含量变化；NEG_2的柱状图为9,10,13-TriHOME的相对含量变化；NEG_3的柱状图为9-HODE的相对含量变化；NEG_4的柱状图为9,12,13-TriHOME的相对含量变化；NEG_5的柱状图为
3-Hydroxykynurenine的相对含量变化；

[0027] 图3为试验1对照组中空白组正常大鼠的左心室内压图；

[0028] 图4为试验1对照组中模型组正常大鼠的左心室内压图；

[0029] 图5为试验1对照组中空白组大鼠心肌组织形态图；

[0030] 图6为试验1对照组中模型组大鼠肌纤维间毛细血管扩张充血图；

[0031] 图7为试验1对照组中模型组大鼠小灶性肌纤维溶解变性图；

[0032] 图8为试验1对照组中模型组大鼠灶性肌萎缩间质充血图；

[0033] 图9为试验1对照组中模型组大鼠灶性肌溶解变性图；

[0034] 图10试验1对照组中空白组大鼠心肌在6000倍下的超微结构图；

[0035] 图11试验1对照组中模型组大鼠心肌在11500倍下的超微结构图；

[0036] 图12试验1对照组中空白组大鼠心肌在6000倍下的超微结构图；

[0037] 图13试验1对照组中模型组大鼠心肌在11500倍下的超微结构图。

具体实施方式

[0038] 具体实施方式一：本具体实施方式一种心气虚证大鼠模型的评价方法，是通过以下步骤进行的：采用UPLC-HDMS仪器采集心气虚证大鼠模型中大鼠尿液，通过markerlynx软件分析大鼠尿液中17个生物标记物的含量；

[0039] 其中17个生物标记物为3-Oxohexadecanoic acid、7-Ketodeoxycholic acid、3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、Glyceric acid 1,3-biphosphate、
3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、13S-hydroxyoctadecadienoic acid、L-Carnitine、3-Hydroxyoctadecanoic acid、Uric acid、Tetracosatetraenoic acid、
12(13)Ep-9-KODE、Stearic acid、α-dimorphecolic、9,10,13-TriHOME、9-HODE，
9,12,13-TriHOME和3-Hydroxykynurenine；

[0040] 若模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到380～420；

[0041] 7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到230～270；

[0042] 3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到130～170；

[0043] Glyceric acid 1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到80～120；

[0044] 3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到80～120；

[0045] 13S-hydroxyoctadecadienoic acid的含量从正常大鼠的150下降到80～120；

[0046] L-Carnitine的含量从正常大鼠的300下降到180～220；

[0047] 3-Hydroxyoctadecanoic acid的含量从正常大鼠的50下降到10～20；

[0048] Uric acid的含量从正常大鼠的100下降到20～30；

[0049] Tetracosatetraenoic acid的含量从正常大鼠的20下降到0～0.5；

[0050] 12(13)Ep-9-KODE的含量从正常大鼠的30下降到10～20；

[0051] Stearic acid的含量从正常大鼠的100下降到60～100；

[0052] α-dimorphecolic的含量从正常大鼠的1750下降到180～220；

[0053] 9,10,13-TriHOME的含量从正常大鼠的1250下降到0～0.5；

[0054] 9-HODE的含量从正常大鼠的500下降到0～0.5；

[0055] 9,12,13-TriHOME的含量从正常大鼠的500下降到0～0.5；

[0056] 3-Hydroxykynurenine的含量从正常大鼠的250下降到0～0.5，则心气虚证动物模型成功。

[0057] 本具体实施方式中17种标记物在模型大鼠尿液中的含量都下降到所述的数值范围内，则证明心气虚证动物模型成功。

[0058] 本具体实施方式中的大鼠为Wistar大鼠，雄性，7周龄，清洁级，是在黑龙江中医药大学实验动物中心购买得到。

[0059] 本具体实施方式所利用的代谢组学技术手段被视为生物体整体功能状态的“生化表型”,能够即时、灵敏、真实表征在各种外界因素刺激下生物体整体功能状态的应答与调 节,这与中医辨证通过“望、闻、问、切”等手段获得对人体整体功能状态的认识相一致，克服了中医凭借经验辩证及现代西医诊断指标与中医证之间的不确定性导致无法全面反映中医整体观的弊端。本具体实施方式利用代谢组学技术方法找到大鼠心气虚模型生物标记物，通过机体终端产物尿液中内源性生物标记物含量的变化，评价心气虚大鼠模型，从而建立全面统一评价机体变化，可量化，同时针对心气虚证的特异性的模型评价方法。利用代谢组学方法，对心气虚造模前及结束后大鼠尿液的ESI质谱代谢轮廓进行非监督型PCA分析，查看造模前后大鼠尿液代谢轮廓的变化轨迹；然后通过PLS-DA和OPLS-DA分析，分别观察正负离子扫描模式下的loading plot和S-plot，查找VIP值较大，载荷图中距离原点越远，对聚类分组的贡献较大的离子即为差异代谢物，可能成为潜在的生物标记物。利用masslynx软件系统所嵌套的element composition analysis和massfragment功能，结合Chemspider、HMDB等数据库，对潜在生物标记物的化学结构进行初步确认，最终鉴定出大鼠心气虚证模型的17个潜在生物标记物，分别 是 3-Oxohexadecanoic acid，7-Ketodeoxycholic acid，3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid，Glyceric acid 1,3-biphosphate，3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid，13S-hydroxyoctadecadienoic acid(13S-HODE)，L-Carnitine，
3-Hydroxyoctadecanoic acid，Uric acid，Tetracosatetraenoic acid，12(13)Ep-9-KODE，Stearic acid，α-dimorphecolic(9S-HODE)，9,10,13-TriHOME，9-HODE，
9,12,13-TriHOME及3-Hydroxykynurenine；同时阐明了17个生物标记物在不同组别的相对含量变化，在心气虚模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到400，7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到250，3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到150，Glyceric acid1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到100，3α,7α,12β-Trihydroxy-
5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到100，13S-hydroxyoctadecadienoic acid(13S-HODE)的含量从正常大鼠的150下降到100，L-Carnitine从正常大鼠的300下降到200，3-Hydroxyoctadecanoic acid从正常大鼠的50下降到20，Uric acid从正常大鼠的100下降到30，Tetracosatetraenoic acid从正常大鼠的20下降到0，12(13)Ep-9-KODE从正常大鼠的30下降到20，Stearic acid从正常大鼠的100下降到80，α-dimorphecolic(9S-HODE)从正常大鼠的1750下降到200，9,10,13-TriHOME从正常大鼠的1250下降到0，9-HODE从正常大鼠的500下降到0，9,12,13-TriHOME从正常大鼠的500下降到0，3-Hydroxykynurenine从正常大鼠的250下降到0。对17个生物标记物能成为心气虚模型大鼠尿液代谢组明显变化的关键代谢产物的有效性进行验证，发现造模 前后尿液中17个生物标记物表达水平的变化一定程度上反映了心气虚模型大鼠尿液代谢轨迹变化趋势。本具体实施方式与传统取血检测生化指标或取脏器观察病理切片相比，具有高效、快速、无创伤、特异性强等优势。

[0060] 通过以下试验验证本发明的有益效果：

[0061] 试验1、本试验分为试验组和对照组。

[0062] 大鼠心气虚证模型的建立

[0063] 大鼠进行负重游泳，每日早8:00开始将大鼠负重12g的铅坠(随体重减轻，游泳时间增加后，适量增加重量以保证游泳的体力消耗量)于水温30±2℃、水深60cm的直壁水桶中进行游泳，直至力竭，记录游泳时间。力竭判断标准为鼠耳长时间浸入水中，鼠鼻连续在水面上下浮动3次，或鼠鼻1次沉入水下达10秒钟。将力竭大鼠捞出，用毛巾及电吹风擦/吹干，休息10分钟，再次负重游泳至力竭，记录游泳时间。两次时间相加为该天的游泳时间。模型组大鼠3天适应性游泳后，每天两次负重游泳至力竭，同时控制进食量，每天10.5±0.5g鼠粮，连续21天。另外，从第18天，每日按体重灌服心得安溶液0.5ml/100g(即
2.4mg/100g)，连续4天。

[0064] 试验组心气虚证大鼠模型的评价方法为：

[0065] 本试验心气虚证大鼠模型的评价方法，是通过以下步骤进行的：采用UPLC-HDMS仪器采集心气虚证大鼠模型中大鼠尿液，通过markerlynx软件分析大鼠尿液中17个生物标记物的含量；

[0066] 其中17个生物标记物为3-Oxohexadecanoic acid、7-Ketodeoxycholic acid、3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、Glyceric acid 1,3-biphosphate、
3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid、13S-hydroxyoctadecadienoic acid、L-Carnitine、3-Hydroxyoctadecanoic acid、Uric acid、Tetracosatetraenoic acid、
12(13)Ep-9-KODE、Stearic acid、α-dimorphecolic、9,10,13-TriHOME、9-HODE，
9,12,13-TriHOME和3-Hydroxykynurenine；

[0067] 若模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到400；

[0068] 7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到250；

[0069] 3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到150；

[0070] Glyceric acid 1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到100；

[0071] 3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到100；

[0072] 13S-hydroxyoctadecadienoic acid的含量从正常大鼠的150下降到100；

[0073] L-Carnitine的含量从正常大鼠的300下降到200；

[0074] 3-Hydroxyoctadecanoic acid的含量从正常大鼠的50下降到20；

[0075] Uric acid的含量从正常大鼠的100下降到30；

[0076] Tetracosatetraenoic acid的含量从正常大鼠的20下降到0；

[0077] 12(13)Ep-9-KODE的含量从正常大鼠的30下降到20；

[0078] Stearic acid的含量从正常大鼠的100下降到80；

[0079] α-dimorphecolic的含量从正常大鼠的1750下降到200；

[0080] 9,10,13-TriHOME的含量从正常大鼠的1250下降到0；

[0081] 9-HODE的含量从正常大鼠的500下降到0；

[0082] 9,12,13-TriHOME的含量从正常大鼠的500下降到0；

[0083] 3-Hydroxykynurenine的含量从正常大鼠的250下降到0，则心气虚证动物模型成功。

[0084] 试验组分为空白组和模型组；试验组分为空白组和模型组；空白组和模型组的尿液代谢正离子模式所鉴定生物标记物不同组别的相对含量变化见图1，空白组和模型组的尿液代谢负离子模式所鉴定生物标记物不同组别的相对含量变化见图2，图1和图2的横坐标为生物标记物在空白组及模型组中信息，纵坐标为生物标记物相对含量；由图1和图2可知，正离子模式下，相比较空白组，心气虚模型大鼠尿液中7-Ketodeoxycholic acid，3b,7b,12a-Trihydroxy-5b-cholanoic acid及3a,7a,12b-Trihydroxy-5b-cholanoic acid含量升高，差异具有显著性；而其余9个生物标记物含量降低，差异具有显著性。负离子模式下，相比较空白组，心气虚模型大鼠尿液中5个生物标记物含量均降低，差异具有显著性。

[0085] 从试验组试验结果可知17个生物标记物的含量在心气虚模型大鼠尿液中3-Oxohexadecanoic acid的含量从正常大鼠的700降到400，7-Ketodeoxycholic acid的含量从正常大鼠的0上升到250，3β,7β,12α-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到150，Glyceric acid 1,3-biphosphate的含量从正常大鼠的200下降到100，3α,7α,12β-Trihydroxy-5β-cholanoic acid的含量从正常大鼠的0上升到100，13S-hydroxyoctadecadienoic acid(13S-HODE)的含量从正常大鼠的150下降到
100，L-Carnitine从正常大鼠的300下降到200，3-Hydroxyoctadecanoic acid从正常大鼠的50下降到20，Uric acid从正常大鼠的100下降到30，Tetracosatetraenoic acid从正常大鼠的20下降到0，12(13)Ep-9-KODE从正常大鼠的30下降到20，Stearic acid从正常大鼠的100下降到80，α-dimorphecolic(9S-HODE)从正常大鼠的1750下降到
200，9,10,13-TriHOME从正常大鼠的1250下降到0，9-HODE从正常大鼠的500下降到0，
9,12,13-TriHOME从 正常大鼠的500下降到0，3-Hydroxykynurenine从正常大鼠的250下降到0。因此本试验的大鼠心气虚证模型成功。

[0086] 对照组心气虚证大鼠模型的评价方法为：对照组分为模型组和空白组；

[0087] 将模型组及空白组大鼠用3％戊巴比妥钠按30mg/kg体重腹腔注射麻醉后，固定，剪去颈部的毛，从颈部正中线切开皮肤。沿胸锁乳突肌内缘将筋膜分开，剥离出右侧颈总动脉，结扎远心端，用动脉夹夹住近心端，并在颈总动脉剪一“v”形切口，插入含0.1％肝素生理盐水的细塑料管直至左心室，联结RM-6000型多导生理记录仪的压力换能器，记录左室血流动力学的各项指标。检测完血流动力学指标后，颈动脉取血，一半加肝素，一半不加肝素。静置后，3500r/min，4℃离心15min，分离血浆或血清。同时摘取大鼠心脏，在左心室相同位置取直径1mm小块心肌，分别用甲醛、戊二醛固定，进行心肌病理及电镜检测。按试剂盒方法测定血浆中cAMP、cGMP、ANF，血清中cTn-I、MDA、SOD活性或含量。

[0088] 1、心室血流动力学指标检测

[0089] 心室血流动力学指标检测结果见图3、图4和表1，由图3、4和表1可知与空白组比较，模型组大鼠心率明显减慢，左心室内压及收缩和舒张功能明显下降，差异具有统计学意义(P﹤0.05；0.01)。收缩压最大上升速率及舒张压最大下降速率绝对值均有下降，差异具有统计学意义(P﹤0.01)。

[0090] 表1 心气虚模型组与空白组大鼠心室血流动力学比较(Mean±SD)

[0091]

[0092] 注：与正常组比较，*P﹤0.05，**P﹤0.01。

[0093] 2、生化指标检测

[0094] 本实验选取了心气虚临床及实验中最常用的6个生化指标对大鼠心气虚模型进行初步评价。

[0095] 2.1环磷酸腺苷cAMP和环磷酸鸟苷cGMP含量变化

[0096] 与空白组比较，心气虚模型组大鼠血浆中的环磷酸腺苷cAMP和环磷酸鸟苷cGMP 含量均有增加，差异具有显著性意义(P﹤0.05)。见表2.

[0097] 2.2心钠素ANF含量变化

[0098] 与空白组比较，心气虚模型组大鼠血浆中心钠素ANP含量稍有增加，但差异无显著性意义(P﹥0.05)。见表3.

[0099] 2.3心肌钙cTn-I含量变化

[0100] 与空白组比较，心气虚模型组大鼠血清中心肌钙cTn-I含量稍有增加，但差异无显著性意义(P﹥0.05)。见表3.

[0101] 2.4过氧化脂质MDA含量和SOD活性变化

[0102] 与空白组比较，心气虚模型组大鼠血清中过氧化脂质MDA含量增加，差异具有显著性意义(P﹤0.01)，SOD活性降低，差异具有显著性意义(P﹤0.01)。见表4。

[0103] 表2 空白组、心气虚模型组大鼠血浆cAMP、cGMP含量比较(Mean+SD)[0104]

[0105] 注：与正常组比较，*P<0.05。

[0106] 表3 空白组、心气虚模型组大鼠血浆ANF、cTn-I含量比较(Mean+SD)[0107]

[0108] 表4 空白组、心气虚模型组大鼠血清MDA、SOD含量比较(Mean+SD)

[0109]

[0110] 注：与正常组比较，**P﹤0.01。

[0111] 3、心肌病理学变化

[0112] 心肌病理学变化结果见图5～图9，由图5～图9可知各组心脏灰红色，体积等大，表面光滑，切面灰红色质中，各房、室结构正常，清晰可见。镜下可见，空白组心室肌纤维呈束排列整齐，细胞核椭圆形位于肌纤维中央，肌纤维间散在毛细血管，心肌组织未见病变。模型组可见部分肌纤维萎缩、肿胀，部分肌间血管扩张充血，心肌纤维间充血，可见灶性肌溶解。

[0113] 4、心肌超微结构的变化

[0114] 心肌超微结构的变化见图10～13，由图10～13可知，空白组大鼠心肌纤维排列整齐，肌节各带清晰，线粒体包膜完整，嵴密集，内质网无扩张。心气虚模型组大鼠心肌纤维肌丝闰盘增宽，其它各带模糊，部分线粒体肿胀、膜破损、溶解，嵴紊乱，可见内质网呈空泡化。

[0115] 由对照组结果可知，本试验的大鼠心气虚证模型成功。

[0116] 本试验试验组与对照组相比，具有高效、快速、无创伤、特异性强的优点，试验组利用代谢组学技术方法找到大鼠心气虚模型生物标记物，通过机体终端产物尿液中内源性生物标记物含量的变化，评价心气虚大鼠模型，从而建立全面统一评价机体变化，可量化，同时针对心气虚证的特异性的模型评价方法。

[0117] 本试验中的大鼠为Wistar大鼠，雄性，7周龄，清洁级，是在黑龙江中医药大学实验动物中心购买得到。