治疗癌症的方法

摘要

描述的是用叶酸盐-长春花结合物与至少一种其它化学治疗剂组合治疗上皮肿瘤的方法和组合物，其中所述肿瘤包括卵巢、子宫内膜或非小细胞肺癌肿瘤，包括耐铂的卵巢肿瘤和铂敏感的卵巢肿瘤。

权利要求

1.下式化合物或其药学上可接受的盐与紫杉烷组合在制备用于治疗非小细胞肺癌的药物中的用途，

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述紫杉烷选自多西他赛和紫杉醇。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述紫杉烷是多西他赛。

4.根据权利要求2所述的用途，其中所述紫杉烷是紫杉醇。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述紫杉烷将以所述紫杉烷的最大耐受剂量的50至80％的剂量施用。

6.根据权利要求1所述的用途，其中下式化合物或其药学上可接受的盐和紫杉烷将按治疗有效量施用。

2

7.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗有效量的范围为1μg/m 身体表面积至2

500mg/m身体表面积。

2

8.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗有效量的范围为1μg/m 身体表面积至2

300mg/m身体表面积。

9.根据权利要求6所述的用途，其中所述治疗有效量的范围为10μg/kg患者体重至

100μg/kg患者体重。

10.根据权利要求1所述的用途，其中基于重量百分比，下式化合物或其药学上可接受的盐和紫杉烷具有至少90％的纯度。

11.根据权利要求1所述的用途，其中下式化合物或其药学上可接受的盐呈可复水冷冻干产物的形式。

12.根据权利要求1所述的用途，其中下式化合物或其药学上可接受的盐和紫杉烷在无菌、无热原的水溶液中。

13.根据权利要求1所述的用途，其中下式化合物或其药学上可接受的盐和紫杉烷将以低于它们的最大可耐受剂量的剂量来施用。

14.下式化合物或其药学上可接受的盐在制备用于治疗患者中非小细胞肺癌的药物中的用途，其中在三周循环治疗的第一周和第二周期间，一周两天以静脉内推注向患者施用一剂所述化合物或其药学上可接受的盐；和其中在三周循环治疗的第一天，经1小时向患者施用一剂多西他赛。

15.根据权利要求14所述的用途，其中所述化合物或其药学上可接受的盐的剂量为

2.5mg。

2

16.根据权利要求14所述的用途，其中多西他赛的剂量是75mg/m 身体表面积。

17.根据权利要求1所述的用途，其中下式化合物或其药学上可接受的盐和紫杉烷处于无菌容器或包装中。

说明书

治疗癌症的方法

[0001] 相关申请的引用

[0002] 本申请基于美国法典第35编第119(e)条要求美国临时申请序列号61/413,275的优先权，所述美国临时申请通过引用全文并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及用叶酸盐-长春花结合物与至少一种紫杉烷组合来治疗癌症的方法和组合物。本发明包括治疗肿瘤的方法和组合物，该肿瘤包括卵巢癌、子宫内膜癌或非小细胞肺癌。

[0004] 背景和概述

[0005] 尽管实际上已在抗癌技术中有显著发展，例如放射疗法、化学疗法和激素疗法，但在美国，癌症仍是继心脏疾病之后第二大导致死亡的原因。最经常地，利用高强效药例如丝裂霉素、紫杉醇（paclitaxel）和喜树碱(camptothecin)，通过化学疗法治疗癌症。在许多情况下，这些化学治疗剂显示剂量应答效应，并且细胞杀伤与药物剂量成比例。因此必需高度侵袭性类型的剂量以根除赘生物。然而，高剂量化学疗法收到对癌细胞的差选择性和对正常细胞的严重毒性的阻碍。这种肿瘤特异性治疗的缺乏是目前化学疗法需要克服的许多障碍之一。

[0006] 目前化学疗法限制的一个解决方案将是向具有极高特异性的肿瘤组织递送生物学有效浓度的抗癌剂。为达到这一目标，已进行许多努力通过将抗癌药物结合到这些配位体如激素、抗体、或维生素来发展肿瘤选择性药物。例如，将低分子量维生素化合物（叶酸盐）用作肿瘤靶向剂。

[0007] 克服目前化学疗法限制的另一方法将是递送肿瘤靶向药物与一种或更多种化学治疗剂的组合物，其中肿瘤靶向药物和化学治疗剂的毒性特征是不同的。该方法的另一种改进是以分别低于肿瘤靶向药物或化学治疗剂在单独用于治疗时典型使用的量在组合疗法中使用肿瘤靶向药物和化学治疗剂。

[0008] 叶酸盐是维生素的B家族的成员，并且通过参与核酸和氨基酸的生物合成在细胞存活中起到重要作用。该重要的维生素还是高亲合力配位体，其通过靶向叶酸盐受体(FR)阳性癌细胞增强结合的抗癌药物的特异性。FR（肿瘤相关的糖基化磷脂酰肌醇锚定蛋白）可以经受体介导的胞吞积极地内在化结合叶酸盐和叶酸盐结合化合物。已发现，在大于90%的非粘质卵巢癌中FR被上调。还发现，FR在肾癌、脑癌、肺癌和乳腺癌中处于高至中等水平，并且在大多数普通组织中以低水平存在。当癌症的阶段变得更晚期时，FR密度也似乎增加。

[0009] 已发展叶酸盐靶向药物并且在临床试验中作为癌症治疗剂测试。EC145包含结合至叶酸盐的高效长春花生物碱细胞毒化学治疗剂(去乙酰长春花碱酰肼(DAVLBH))。EC145分子靶向上皮肿瘤表面以高水平发现的叶酸盐受体，所述上皮肿瘤包括非小细胞肺癌(NSCLC)、卵巢癌、子宫内膜癌和肾癌和其它，包括输卵管癌和原发性腹膜癌。不受理论的约束，据认为EC145结合至表达叶酸盐受体的肿瘤，所述叶酸盐受体将长春花部分直接递送至癌细胞同时避免递送至正常组织。刚一结合时，EC145就经由胞吞进入癌细胞，释放DAVLBH并且通过抑制细胞分裂所需的有丝分裂组件的形成导致细胞死亡。EC145具有化学文摘登记号742092-03-1和下式。

[0010]

[0011] EC145

[0012] 如本文中所用，在治疗的方法、用途、组合物、药用组合物、试剂盒、或组合的背景下，术语EC145意思是如上显示的化学治疗剂，或其药用可接受的盐，并且该化学治疗剂可以离子化形式（包括质子化形式）存在于溶液或悬浮液中。例如，通过PCT/US11/037134中所述方法可以合成EC145，所述专利通过引用并入本文。EC145与术语“结合物”在本文中可交换使用。

[0013] 在一种实施方案中，提供一种治疗癌症的方法。该方法包含与一种或更多种化学治疗剂组合施用EC145，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0014] 在另一实施方案中，描述先前的方法，其中一种或更多种化学治疗剂选自由多西TM TM TM他赛（docetaxel）(如TAXOTERE )和紫杉醇(如TAXOL 或ABRAXANE )组成的组。

[0015] 在另一实施方案中，描述EC145与一种或更多种化学治疗剂组合用于治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的用途，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0016] 在另一实施方案中，提供如上所述的用途，其中所述一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0017] 在另一实施方案中，描述EC145用于制造与一种或更多种化学治疗剂组合来治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的药剂的用途，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0018] 在另一实施方案中，描述制造如上所述药剂的用途，其中所述一种或更多种化学治疗剂选自由多西他赛和紫杉醇组成的组。

[0019] 在另一实施方案中，描述一种药用组合物或组合，其包含EC145和一种或更多种化学治疗剂，所述化学治疗剂具有选自由微管分解抑制和有丝分裂抑制组成的组的作用模式。

[0020] 在另一实施方案中，描述在先前实施方案中所述的药用组合物或组合，其中所述一种或更多种化学治疗剂选自由多西他赛和紫杉醇组成的组。

[0021] 在另一实施方案中，描述一种用于治疗癌症的组合物，其包含EC145和一种或更多种化学治疗剂，所述化学治疗剂具有选自由微管分解抑制和有丝分裂抑制组成的组的作用模式。

[0022] 在另一实施方案中，描述在先前实施方案中所述的组合物，其中所述一种或更多种化学治疗剂选自由多西他赛和紫杉醇组成的组。

[0023] 通过以下列举条款描述本发明的若干实施方案：

[0024] 1. 一种治疗癌症的方法，该方法包含与一种或更多种化学治疗剂组合施用EC145的步骤，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0025] 2. 条款1的方法，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0026] 3. 条款1或2的方法，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0027] 4. 条款1或2的方法，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0028] 5. EC145与一种或更多种化学治疗剂组合用于治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的用途，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0029] 6. 条款5的用途，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0030] 7. 条款5或6的用途，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0031] 8. 条款5或6的用途，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0032] 9. EC145用于制造与一种或更多种化学治疗剂组合来治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的药剂的用途，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0033] 10.条款9的用途，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0034] 11.条款9或10的用途，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0035] 12.条款9或10的用途，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0036] 13.先前条款中任一项的方法或用途，其中该表达叶酸盐受体的细胞是上皮肿瘤细胞。

[0037] 14.条款13的方法或用途，其中该上皮肿瘤是卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤或非小细胞肺肿瘤。

[0038] 15.条款13至14中任一项的方法或用途，其中该表达叶酸盐受体的上皮肿瘤是卵巢肿瘤。

[0039] 16.条款13至15中任一项的方法或用途，其中该肿瘤是原发性肿瘤。

[0040] 17.条款13至15中任一项的方法或用途，其中该肿瘤是转移性肿瘤。

[0041] 18.前述条款中任一项的方法或用途，其中该化学治疗剂以针对该化学治疗剂的最大耐受剂量的50-80%的剂量施用。

[0042] 19.一种药用组合物，其包含EC145和一种或更多种化学治疗剂，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0043] 20.条款19的组合物，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0044] 21.条款19至20的组合物，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0045] 22.条款19至20的组合物，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0046] 23.一种用于治疗癌症的组合物，其包含EC145和一种或更多种化学治疗剂，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0047] 24.条款23的组合物，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0048] 25.条款23或24的组合物，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0049] 26.条款23或24的组合物，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0050] 27.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该EC145或该化学治疗剂是肠胃外剂量形式。

[0051] 28.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该剂量形式选自皮内剂量形式、皮下剂量形式、肌肉内剂量形式、腹膜内剂量形式、静脉内剂量形式和鞘内剂量形式。

[0052] 29.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该EC145或该化学治疗剂处于组合物中并且其中该组合物进一步包含药用可接受的载体。

[0053] 30.条款29的组合物、方法或用途，其中该药用可接受的载体是液体载体。

[0054] 31.条款30的组合物、方法或用途，其中该液体载体选自盐水、葡萄糖、醇、乙二醇、酯、酰胺及其组合。

[0055] 32.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该EC145或该化学治疗剂是按治疗有效量施用。

[0056] 33.条款32的组合物、方法或用途，其中有效量的范围为每千克体重约1 ng至约1 mg。

[0057] 34.条款33的组合物、方法或用途，其中有效量的范围为每千克体重约100 ng至约500 µg。

[0058] 35.条款34的组合物、方法或用途，其中有效量的范围为每千克体重约100 ng至约50 µg。

[0059] 36.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该肿瘤是耐铂的卵巢肿瘤。

[0060] 37.一种治疗癌症的方法，该方法包含以下步骤：

[0061] 向患者施用EC145；和

[0062] 向所述患者施用一种或更多种附加化学治疗剂，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0063] 38.EC145与一种或更多种附加化学治疗剂组合用于治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的用途，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0064] 39.EC145用于制造与一种或更多种附加化学治疗剂组合来治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的药剂的用途，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0065] 40.条款37至39中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂是紫杉烷。

[0066] 41.条款37至40中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0067] 42.条款37至41中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂是多西他赛。

[0068] 43.条款37至41中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂是紫杉醇。

[0069] 44.条款38至43中任一项的用途，其中该表达叶酸盐受体的细胞是上皮肿瘤细胞。

[0070] 45.条款44的用途，其中该上皮肿瘤是卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、或非小细胞肺肿瘤。

[0071] 46.条款45的用途，其中该表达叶酸盐受体的上皮肿瘤是卵巢肿瘤。

[0072] 47.条款45的用途，其中该表达叶酸盐受体的上皮肿瘤是非小细胞肺肿瘤。

[0073] 48.条款37或43至43中任一项的方法，其中该癌症是上皮癌。

[0074] 49.条款48的方法，其中该上皮癌是卵巢癌、子宫内膜癌、或非小细胞肺癌。

[0075] 50.条款49的方法，其中该上皮癌是卵巢癌。

[0076] 51.条款49的方法，其中该上皮癌是非小细胞肺癌。

[0077] 52.条款37至51中任一项的方法或用途，其中该癌症或该癌细胞包含原发性肿瘤。

[0078] 53.条款37至51中任一项的方法或用途，其中该癌症或该癌细胞包含转移性肿瘤细胞。

[0079] 54.条款37至53中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂以针对该化学治疗剂的最大耐受剂量的50至80%的剂量施用。

[0080] 55.条款37至54中任一项的方法或用途，其中该EC145和该一种或更多种附加化学治疗剂是肠胃外剂量形式。

[0081] 56.条款55的方法或用途，其中该剂量形式独立选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内和鞘内。

[0082] 57.条款37至56中任一项的方法或用途，其中该EC145处于组合物中并且该附加化学治疗剂处于组合物中，并且其中该组合物还包含药用可接受的载体。

[0083] 58.条款57的方法或用途，其中该药用可接受的载体是液体载体。

[0084] 59.条款58的方法或用途，其中该液体载体独立选自盐水、葡萄糖、醇、乙二醇、酯、酰胺及其组合。

[0085] 60.条款37至59中任一项的方法或用途，其中该EC145和该化学治疗剂是按治疗有效量施用。

[0086] 61.条款60的方法或用途，其中有效量范围为约1μg/m2至约500 mg/m2身体表面积。

[0087] 62.条款61的方法或用途，其中有效量范围为约1μg/m2至约300 mg/m2身体表面积。

[0088] 63.条款60的方法或用途，其中有效量范围为约10 μg/kg至约100 μg/kg患者体重。

[0089] 64.条款50的方法，其中该癌症是耐铂的卵巢癌。

[0090] 65.条款46的用途，其中该肿瘤是耐铂的卵巢肿瘤。

[0091] 66.条款37至65中任一项的方法或用途，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌容器或包装中。

[0092] 67.条款37至66中任一项的方法或用途，其中基于重量百分比，该EC145和该附加化学治疗剂具有至少90%的纯度。

[0093] 68.条款37至67中任一项的方法或用途，其中该EC145呈可复水冷冻干产物的形式。

[0094] 69.条款37至68中任一项的方法或用途，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌、无热原的水溶液中。

[0095] 70.包含EC145和一种或更多种附加化学治疗剂的组合物或组合，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0096] 71.一种用于治疗癌症的组合物或组合，其包含EC145和一种或更多种附加化学治疗剂，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0097] 72.一种试剂盒，其包含EC145和一种或更多种附加化学治疗剂，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0098] 73.条款70至72中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂是紫杉烷。

[0099] 74.条款70至73中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0100] 75.条款70至74中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂是多西他赛。

[0101] 76.条款70至74中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂是紫杉醇。

[0102] 77.条款70至76中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂是肠胃外剂量形式。

[0103] 78.条款77的组合物、组合、或试剂盒，其中该剂量形式独立选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内和鞘内。

[0104] 79.条款70至78中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于药用组合物中，并且该组合物还包含药用可接受的载体。

[0105] 80.条款79的组合物、组合、或试剂盒，其中该药用可接受的载体是液体载体。

[0106] 81.条款80的组合物、组合、或试剂盒，其中该液体载体独立选自盐水、葡萄糖、醇、乙二醇、酯、酰胺及其组合。

[0107] 82.条款70至81中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该化学治疗剂处于治疗有效量。

[0108] 83.条款70至82中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌容器或包装中。

[0109] 84.条款70至83中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中基于重量百分比，该EC145和该附加化学治疗剂具有至少90%的纯度。

[0110] 85.条款70至83中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中基于重量百分比，该EC145和该附加化学治疗剂具有至少95%的纯度。

[0111] 86.条款70至85中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145呈可复水冷冻干产物的形式。

[0112] 87.条款70至86中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌、无热原的水溶液中。

[0113] 88.条款37至59中任一项的方法或用途，其中该EC145和/或该附加化学治疗剂以低于它们的最大可耐受剂量的剂量来施用。

[0114] 89. 一种治疗非小细胞肺癌的方法，该方法包含以下步骤：

[0115] 在三周治疗周期的第一周和第二周期间，一周两天以静脉内推注向患者施用一剂EC145；和

[0116] 在三周治疗周期的第一天，经1小时向患者施用一剂多西他赛。

[0117] 90. 条款89的方法，其中EC145的剂量为2.5 mg。

[0118] 91. 条款89或90的方法，其中多西他赛的剂量是75 mg/m2身体表面积。

[0119] 92.条款70至85中任一项的组合物、组合、或试剂盒或者条款37至67中任一项的方法或用途，其中该EC145呈冷冻干产物的形式。

[0120] 附图简述

[0121] 图1.对具有KB肿瘤(范围144–212 mm3)的nu/nu小鼠测量肿瘤体积(各治疗组中五个动物的平均值) ，所述肿瘤(a)未治疗；或用：(b) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (d) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗，或 (c) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+ 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周。单独采用EC145治疗产生0个部分应答0个完全应答，和1个治愈。用多西他赛单独治疗未产生部分应答、完全应答或治愈。组合疗法产生5个治愈。

[0122] 图2.对具有KB肿瘤(范围144-212 mm3)的nu/nu小鼠测量重量变化百分比(各治疗组中五个动物的平均值) ，所述肿瘤(a)未治疗；或用：(b) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (d) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗；或 (c) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+ 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周治疗。

[0123] 图3.对具有KB肿瘤(范围103-173 mm3)的nu/nu小鼠测量肿瘤体积(各治疗组中五个动物的平均值) ，所述肿瘤(■)未治疗；或用：(●) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 20 mg/kg的Abraxane (即紫杉醇的白蛋白结合形式)，TIW 1周中任一种治疗；或 (▼) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 20 mg/kg的Abraxane(紫杉醇等价物)，TIW 1周。用EC045单独治疗产生0个部分应答0个完全应答，和0个治愈。用Abraxane单独治疗产生1个部分应答、2个完全应答和2个治愈。组合疗法产生2个完全应答和3个治愈。

[0124] 图4.对具有KB肿瘤(范围92-185 mm3)的nu/nu小鼠测量重量变化百分比(各治疗组中五个动物的平均值)，所述肿瘤(■)未治疗；或用：(●) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 20 mg/kg的Abraxane (紫杉醇等同物)，TIW 1周中任一种治疗，或 (▼) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 20 mg/kg的Abraxane(紫杉醇等同物)，TIW 1周。

[0125] 图5.对具有KB肿瘤(范围111-173 mm3)的nu/nu小鼠测量肿瘤体积(各治疗组中五个动物的平均值)，所述肿瘤(■)未治疗；或用：(●) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 克列莫佛（Cremophor）/乙醇中20 mg/kg的紫杉醇，TIW 1周中任一种治疗；或 (▼) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+克列莫佛/乙醇中20 mg/kg的紫杉醇，TIW 1周；或者(◆)单独的克列莫佛/乙醇赋形剂。采用EC045单独治疗产生0个部分应答0个完全应答，和0个治愈。采用紫杉醇单独治疗产生2个完全应答和3个治愈。组合疗法产生1个完全应答和4个治愈。

[0126] 图6.对具有KB肿瘤(范围52-185 mm3)的nu/nu小鼠测量重量变化百分比(各治疗组中五个动物的平均值)，所述肿瘤(■)未治疗；或用：(●) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 20 mg/kg的紫杉醇，在克列莫佛/乙醇中TIW 1周中任一种治疗，或 (▼) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+克列莫佛/乙醇中20 mg/kg的紫杉醇，TIW 1周；或者(◆)单独的克列莫佛/乙醇赋形剂。

[0127] 图7.具有IGR-OV1(人卵巢)肿瘤的小鼠的肿瘤体积(平均值)，所述肿瘤(■)未治疗；或用：(●) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗；或 (▼) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周。

[0128] 图8.具有IGR-OV1(人卵巢)肿瘤的小鼠的重量变化百分比(平均值)，所述肿瘤(■)未治疗；或用：(●) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗；或 (▼) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周。

[0129] 图9.具有M109肿瘤的小鼠的肿瘤体积(平均值)，所述肿瘤(a)未治疗；或用：(b) 2μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (d) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗，或 (c) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周。

[0130] 图10.具有M109肿瘤的小鼠的重量百分比变化(平均值)，所述肿瘤(a)未治疗；或用：(b) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (d) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗，或 (c) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+ 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周。

[0131] 定义

[0132] 如本文中所用，术语“抑制肿瘤生长”意思是肿瘤尺寸减小，肿瘤完全消失，或者经过采用EC145和附加化学治疗药物的治疗过程，患者肿瘤的生长小于30%。

[0133] 如本文中所用，在治疗方法、用途、组合物、药用组合物、试剂盒、或组合的背景下，TM术语多西他赛(如TAXOTERE )意思是一种包含通过化学文摘登记号114977-28-5识别的化学治疗剂、或其药用可接受的盐的组合物。该化学治疗剂(即多西他赛)可以存在于溶液或悬浮体中。

[0134] 如本文中所用，在治疗方法、用途、组合物、药用组合物、组合、或试剂盒的背景下，TM TM术语紫杉醇(如TAXOL 或ABRAXANE )意思是一种包含通过化学文摘登记号33069- 62-
4识别的化学治疗剂、或其药用可接受的盐的组合物。该化该学疗法剂(即紫杉醇)可以存在于溶液或悬浮体中。

[0135] 说明性实施方案的详细说明

[0136] 通过以下列举的条款描述本发明的若干实施方案，并且在本申请的详细说明部分中描述的每个实施方案均适用于每个以下实施方案：1. 一种治疗癌症的方法，该方法包含与一种或更多种化学治疗剂组合施用EC145的步骤，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0137] 2. 条款1的方法，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0138] 3. 条款1或2的方法，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0139] 4. 条款1或2的方法，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0140] 5. EC145与一种或更多种化学治疗剂组合用于治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的用途，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0141] 6. 条款5的用途，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0142] 7. 条款5或6的用途，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0143] 8. 条款5或6的用途，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0144] 9. EC145用于制造与一种或更多种化学治疗剂组合来治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的药剂的用途，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0145] 10.条款9的用途，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0146] 11.条款9或10的用途，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0147] 12.条款9或10的用途，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0148] 13.先前条款中任一项的方法或用途，其中该表达叶酸盐受体的细胞是上皮肿瘤细胞。

[0149] 14.条款13的方法或用途，其中该上皮肿瘤是卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤或非小细胞肺肿瘤。

[0150] 15.条款13至14中任一项的方法或用途，其中该表达叶酸盐受体的上皮肿瘤是卵巢肿瘤。

[0151] 16.条款13至15中任一项的方法或用途，其中该肿瘤是原发性肿瘤。

[0152] 17.条款13至15中任一项的方法或用途，其中该肿瘤是转移性肿瘤。

[0153] 18.前述条款中任一项的方法或用途，其中该化学治疗剂以针对该化学治疗剂的最大耐受剂量的50-80%的剂量施用。

[0154] 19.一种药用组合物，其包含EC145和一种或更多种化学治疗剂，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0155] 20.条款19的组合物，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0156] 21.条款19至20的组合物，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0157] 22.条款19至20的组合物，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0158] 23.一种用于治疗癌症的组合物，其包含EC145和一种或更多种化学治疗剂，所述化学治疗剂具有选自微管分解抑制和有丝分裂抑制的作用模式。

[0159] 24.条款23的组合物，其中该一种或更多种化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0160] 25.条款23或24的组合物，其中该化学治疗剂是多西他赛。

[0161] 26.条款23或24的组合物，其中该化学治疗剂是紫杉醇。

[0162] 27.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该EC145或该化学治疗剂是肠胃外剂量形式。

[0163] 28.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该剂量形式选自皮内剂量形式、皮下剂量形式、肌肉内剂量形式、腹膜内剂量形式、静脉内剂量形式和鞘内剂量形式。

[0164] 29.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该EC145或该化学治疗剂处于组合物中并且其中该组合物进一步包含药用可接受的载体。

[0165] 30.条款29的组合物、方法或用途，其中该药用可接受的载体是液体载体。

[0166] 31.条款30的组合物、方法或用途，其中该液体载体选自盐水、葡萄糖、醇、乙二醇、酯、酰胺及其组合。

[0167] 32.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该EC145或该化学治疗剂是按治疗有效量施用。

[0168] 33.条款32的组合物、方法或用途，其中有效量的范围为每千克体重约1 ng至约1 mg。

[0169] 34.条款33的组合物、方法或用途，其中有效量的范围为每千克体重约100 ng至约500 µg。

[0170] 35.条款34的组合物、方法或用途，其中有效量的范围为每千克体重约100 ng至约50 µg。

[0171] 36.前述条款中任一项的组合物、方法、或用途，其中该肿瘤是耐铂的卵巢肿瘤。

[0172] 37.一种治疗癌症的方法，该方法包含以下步骤：

[0173] 向患者施用EC145；和

[0174] 向所述患者施用一种或更多种附加化学治疗剂，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0175] 38.EC145与一种或更多种附加化学治疗剂组合用于治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的用途，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0176] 39.EC145用于制造与一种或更多种附加化学治疗剂组合来治疗表达叶酸盐受体的癌细胞的药剂的用途，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0177] 40.条款37至39中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂是紫杉烷。

[0178] 41.条款37至40中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0179] 42.条款37至41中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂是多西他赛。

[0180] 43.条款37至41中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂是紫杉醇。

[0181] 44.条款38至43中任一项的用途，其中该表达叶酸盐受体的细胞是上皮肿瘤细胞。

[0182] 45.条款44的用途，其中该上皮肿瘤是卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤、或非小细胞肺肿瘤。

[0183] 46.条款45的用途，其中该表达叶酸盐受体的上皮肿瘤是卵巢肿瘤。

[0184] 47.条款45的用途，其中该表达叶酸盐受体的上皮肿瘤是非小细胞肺肿瘤。

[0185] 48.条款37或43至43中任一项的方法，其中该癌症是上皮癌。

[0186] 49.条款48的方法，其中该上皮癌是卵巢癌、子宫内膜癌、或非小细胞肺癌。

[0187] 50.条款49的方法，其中该上皮癌是卵巢癌。

[0188] 51.条款49的方法，其中该上皮癌是非小细胞肺癌。

[0189] 52.条款37至51中任一项的方法或用途，其中该癌症或该癌细胞包含原发性肿瘤。

[0190] 53.条款37至51中任一项的方法或用途，其中该癌症或该癌细胞包含转移性肿瘤细胞。

[0191] 54.条款37至53中任一项的方法或用途，其中该附加化学治疗剂以针对该化学治疗剂的最大耐受剂量的50至80%的剂量施用。

[0192] 55.条款37至54中任一项的方法或用途，其中该EC145和该一种或更多种附加化学治疗剂是肠胃外剂量形式。

[0193] 56.条款55的方法或用途，其中该剂量形式独立选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内和鞘内。

[0194] 57.条款37至56中任一项的方法或用途，其中该EC145处于组合物中并且该附加化学治疗剂处于组合物中，并且其中该组合物还包含药用可接受的载体。

[0195] 58.条款57的方法或用途，其中该药用可接受的载体是液体载体。

[0196] 59.条款58的方法或用途，其中该液体载体独立选自盐水、葡萄糖、醇、乙二醇、酯、酰胺及其组合。

[0197] 60.条款37至59中任一项的方法或用途，其中该EC145和该化学治疗剂是按治疗有效量施用。

[0198] 61.条款60的方法或用途，其中有效量范围为约1μg/m2至约500 mg/m2身体表面积。

[0199] 62.条款61的方法或用途，其中有效量范围为约1μg/m2至约300 mg/m2身体表面积。

[0200] 63.条款60的方法或用途，其中有效量范围为约10 μg/kg至约100 μg/kg患者体重。

[0201] 64.条款50的方法，其中该癌症是耐铂的卵巢癌。

[0202] 65.条款46的用途，其中该肿瘤是耐铂的卵巢肿瘤。

[0203] 66.条款37至65中任一项的方法或用途，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌容器或包装中。

[0204] 67.条款37至66中任一项的方法或用途，其中基于重量百分比，该EC145和该附加化学治疗剂具有至少90%的纯度。

[0205] 68.条款37至67中任一项的方法或用途，其中该EC145呈可复水冷冻干产物的形式。

[0206] 69.条款37至68中任一项的方法或用途，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌、无热原的水溶液中。

[0207] 70.包含EC145和一种或更多种附加化学治疗剂的组合物或组合，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0208] 71.一种用于治疗癌症的组合物或组合，其包含EC145和一种或更多种附加化学治疗剂，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0209] 72.一种试剂盒，其包含EC145和一种或更多种附加化学治疗剂，所述化学治疗剂具有微管分解抑制的作用模式。

[0210] 73.条款70至72中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂是紫杉烷。

[0211] 74.条款70至73中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂选自多西他赛和紫杉醇。

[0212] 75.条款70至74中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂是多西他赛。

[0213] 76.条款70至74中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该附加化学治疗剂是紫杉醇。

[0214] 77.条款70至76中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂是肠胃外剂量形式。

[0215] 78.条款77的组合物、组合、或试剂盒，其中该剂量形式独立选自皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内和鞘内。

[0216] 79.条款70至78中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于药用组合物中，并且该组合物还包含药用可接受的载体。

[0217] 80.条款79的组合物、组合、或试剂盒，其中该药用可接受的载体是液体载体。

[0218] 81.条款80的组合物、组合、或试剂盒，其中该液体载体独立选自盐水、葡萄糖、醇、乙二醇、酯、酰胺及其组合。

[0219] 82.条款70至81中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该化学治疗剂处于治疗有效量。

[0220] 83.条款70至82中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌容器或包装中。

[0221] 84.条款70至83中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中基于重量百分比，该EC145和该附加化学治疗剂具有至少90%的纯度。

[0222] 85.条款70至83中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中基于重量百分比，该EC145和该附加化学治疗剂具有至少95%的纯度。

[0223] 86.条款70至85中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145呈可复水冷冻干产物的形式。

[0224] 87.条款70至86中任一项的组合物、组合、或试剂盒，其中该EC145和该附加化学治疗剂处于无菌、无热原的水溶液中。

[0225] 88.条款37至59中任一项的方法或用途，其中该EC145和/或该附加化学治疗剂以低于它们的最大可耐受剂量的剂量来施用。

[0226] 89. 一种治疗非小细胞肺癌的方法，该方法包含以下步骤：

[0227] 在三周治疗周期的第一周和第二周期间，一周两天以静脉内推注向患者施用一剂EC145；和

[0228] 在三周治疗周期的第一天，经1小时向患者施用一剂多西他赛。

[0229] 90. 条款89的方法，其中EC145的剂量为2.5 mg。

[0230] 91. 条款89或90的方法，其中多西他赛的剂量是75 mg/m2身体表面积。

[0231] 在本文所述的各种实施方案的任一个中，在适用的情况下，可以存在以下特征，提供本发明的附加实施方案。

[0232] 对所有实施方案，还考虑了实施方案的任何可适用的组合。上述实施方案的任何可适用的组合被认为与本发明一致。

[0233] 在本文所述的方法、用途、组合物、药用组合物、组合、或试剂盒的各种实施方案中，EC145可以单独施用或与一种或更多种紫杉烷(或紫杉烷的任何组合)组合施用。在本文所述的各种实施方案中，其它化学治疗剂可以选自微管分解抑制剂和/或有丝分裂抑制剂的药物。应理解，其它药物可以具有一种以上的作用模式。在一个说明性实施方案中，EC145可以与选自多西他赛和紫杉醇的至少一种化学治疗剂组合施用。

[0234] 在本文所述的组合物、方法、用途、药用组合物、或试剂盒的其它实施方案中，描述本文所述的结合物的药用可接受的盐。本文所述的结合物的药用可接受的盐包括它们的酸加成盐和碱盐。

[0235] 合适的酸加成盐由形成无毒盐的酸形成。说明性实例包括乙酸盐，天冬氨酸盐，苯甲酸酯，苯磺酸盐，碳酸氢盐/碳酸盐，硫酸氢盐/硫酸盐，硼酸盐，樟脑磺酸盐，柠檬酸盐，乙二磺酸盐，乙磺酸盐，甲酸盐，延胡索酸盐，葡庚糖酸盐，葡萄糖酸盐，葡糖醛酸盐，六氟磷酸盐，羟苯酰苯酸盐，盐酸盐/氯化物，氢溴酸盐/溴化物，氢碘酸盐/碘化物，羟乙基磺酸盐，乳酸盐，苹果酸盐，顺丁烯二酸，丙二酸盐，甲磺酸盐，甲基硫酸盐，萘基盐(naphthylate)，2-萘磺酸盐，烟酸盐，硝酸盐，乳清酸盐，草酸盐，棕榈酸盐，扑酸盐，磷酸酯/磷酸氢盐/磷酸二氢盐，蔗糖酸盐，硬脂酸盐，琥珀酸盐，酒石酸盐，甲苯磺酸盐和三氟醋酸盐。

[0236] 本文所述结合物的合适的碱盐由形成无毒盐的碱形成。说明性实例包括精氨酸盐、苄星青霉素G盐、钙盐、胆碱盐、二乙胺盐、二乙醇胺盐、甘氨酸盐、赖氨酸盐、镁盐、葡甲胺盐、乙醇胺盐、钾盐、钠盐、缓血酸胺盐和锌盐。也可形成酸和碱的半盐，例如半硫酸盐和半钙盐。

[0237] 在一个实施方案中，本文所述的结合物或附加化学治疗剂可以作为与一种或更多种药用可接受的载体结合的制剂施用。所述载体可以是赋形剂。载体的选择将很大程度上取决于诸如具体施用模式、载体对可溶性和稳定性的影响和剂量形式的性质之类因素。适于递送本文所述的结合物或附加化学治疗剂的药用组合物和用于其制备的方法将容易对本领域技术人员显而易见。这种组合物和用于其制备的方法可以例如见于：Remington，The Science & Practice of Pharmacy, 21st Edition (Lippincott Williams & Wilkins,2005)，该文献以引用方式并入本文。

[0238] 在一个说明性的方面，药用可接受的载体包括任何和所有溶剂，分散体介质，涂层，抗细菌和抗真菌剂，等渗剂和吸收延迟剂等等，及其组合，它们是生理上可相容的。在一些实施方案中，载体适于肠胃外施用。药用可接受的载体包括无菌水溶液或分散体以及用于即时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉剂。补充活性化合物也可结合到本发明的组合物中。

[0239] 在各种实施方案中，液体制剂可以包括悬浮体和溶液。这种制剂可以包含载体，例如水、乙醇、聚乙二醇、丙二醇、甲基纤维素、或合适的油、和一种或更多种乳化剂和/或悬浮剂。也可通过使例如来自小袋的固体复水，制备液体制剂。

[0240] 在一个实施方案中，水性悬浮体可以含有与适当赋形剂混合的活性物质。这种赋形剂是悬浮剂，例如，羧甲基纤维素钠，甲基纤维素，羟丙基甲基纤维素，藻酸钠，聚乙烯吡咯烷酮，黄蓍胶和金合欢树胶；分散或润湿剂，其可能是天然产生的磷脂，例如卵磷脂；烯化氧与脂肪酸的缩合产物，例如聚氧化乙烯硬脂酸酯；氧化乙烯与长链脂族醇的缩合产物，例如十七乙烯氧基鲸蜡醇；氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨糖醇单油酸酯；或氧化乙烯与衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯。水性悬浮体也可含有一种或更多种防腐剂，例如抗坏血酸、苯甲酸乙酯、苯甲酸正丙酯、或对羟基苯甲酸酯；或一种或更多种着色剂。

[0241] 在一个说明性实施方案中，适于通过水的添加制备水性悬浮体的可分散粉末和颗粒提供与分散或润湿剂、悬浮剂和一种或更多种防腐剂混合的活性成分。也可存在附加赋形剂（例如着色剂）。

[0242] 合适的乳化剂可以是天然产生的树胶，例如金合欢树胶或黄蓍胶；天然产生的磷脂，例如大豆卵磷脂；和酯类，包括衍生自脂肪酸和己糖醇酐的偏酯，例如山梨聚糖单油酸酯；和所述偏酯与氧化乙烯的缩合产物，例如聚氧化乙烯山梨聚糖单油酸酯。

[0243] 在其它实施方案中，等渗剂例如糖类，多元醇例如甘露糖醇、山梨糖醇，或氯化钠可以被包括在组合物内。通过将延迟吸收的药剂例如单硬脂酸盐和白明胶包括在该组合物内，可以引起可注射组合物的延长吸收。

[0244] 在一个方面，本文所述的结合物或附加化学治疗剂可以直接施用到血流中，肌肉中，或体内器官中。用于这种肠胃外施用的合适路径包括静脉内的、动脉内的、腹膜内的、鞘内的、硬膜外的、脑室内的、尿道内的、胸骨内的、颅内的、瘤内的、肌肉内的和皮下的递送。用于肠胃外施用的合适方法包括针(包括显微针)注射器，无针注射器和输注技术。

[0245] 在一个说明性的方面，肠胃外制剂典型地是水溶液，其可以含有载体或赋形剂如盐、碳水化合物和缓冲剂(优选pH为3至9)，但对于某些申请，它们可以更合适地配制为无菌非水性溶液或配制为将与合适的赋形剂例如无菌无热原水结合使用的干燥形式。在其它实施方案中，本文所述的任何液体制剂可以适应于本文所述的结合物或附加化学治疗剂的肠胃外施用。无菌条件下肠胃外制剂的制备，例如无菌条件下通过冷冻干燥制备，可以容易地使用本领域技术人员熟知的标准制药技术来实现。例如，通过美国申请序列号61/474,428中描述的方法，可以冻干EC145，所述申请以引用方式并入本文。在一个实施方案中，EC145可以以可复水冷冻干产物的形式存在。在一个实施方案中，通过使用适当的配制技术，例如结合溶解度增强剂，可以增加肠胃外制剂的制备中使用的结合物或附加化学治疗剂的溶解度。EC145制剂描述于美国申请序列号61/474,428、PCT/US11/037134和WO
2011/014821中，所述专利均以引用方式以其全部并入本文。

[0246] 在各种实施方案中，肠胃外施用的制剂可以被配制用于即释和/或调释。在一个说明性的方面，本发明的活性剂可以以定时释放制剂、例如以包括缓释聚合物的组合物来施用。可以用防止化合物快速释放的载体，如控制释放制剂（包括植入物和微型胶囊递送系统），制备活性化合物。可以使用可生物降解的可生物相容聚合物，如乙烯乙酸乙烯酯，聚酐，聚乙醇酸，胶原，聚原酸酯，聚乳酸和聚乳酸、聚乙醇酸共聚物(PGLA)。用于制备这种制剂的方法通常是本领域技术人员已知的。在另一实施方案中，在适当情况下，本文所述的结合物或附加化学治疗剂或包含该结合物或附加化学治疗剂的组合物可以连续地施用。

[0247] 在一个实施方案中，提供一种试剂盒。如果将施用活性化合物的组合，则可以适于组合物的顺序施用或共同施用试剂盒的形式组合两种或更多种药用组合物。这种试剂盒包含两种或更多种单独的药用组合物，其中至少一种含有本文所述的结合物，以及用于单独地保持该组合物的构件,如容器、分装瓶、或分装箔包。在另一实施方案中，提供在具有标签的容器中的包含本文所述的结合物或附加化学治疗剂的组合物，所述标签提供对结合物治疗的使用说明。说明书还提供待施用的附加化学治疗剂(例如紫杉烷)的用途。

[0248] 在一个实施方案中，通过按需要，将适当溶剂中所需量的活性剂与一种如上所述成份或成份组合合并，随后无菌过滤，可以制备无菌可注射溶液。典型地，通过将活性化合物并入含有分散体介质和如上所述的任何附加成份的无菌赋形剂中，制备分散体。在用于制备无菌可注射溶液的无菌粉剂的情况下，优选的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，其产生活性成分和来自其先前无菌滤液的附加所需成份的粉末，或者所述成份可以一起被无菌过滤。

[0249] 该组合物可以配制为溶液、微乳剂、脂质体、或适于高药物浓度的其它有序结构。载体可为含有(例如)水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇或液体聚乙二醇等等)及其适合的混合物的溶剂或分散体介质。在一个实施方案中，例如，通过使用诸如卵磷脂的涂层，通过在分散体的情况下维持所需粒径和通过使用表面活性剂，可以维持合适的流动性。

[0250] 可以使用用于施用EC145和附加化学治疗剂的任何有效方案。例如，EC145和附加化学治疗剂(即药物)可以作为单剂量施用，或可以作为多次剂量每日方案来分装和施用。此外，交错方案（例如，每周一至五天）可以用作每日治疗的替代形式，并且对本文所述的方法来说，认为这种间歇或交错的日用方案等同于每天治疗并被涵盖。在一个说明性实施方案中，用EC145和附加化学治疗剂的多次注射来治疗患者，以消除肿瘤。在一个实施方案中，例如，以12至72小时间隔或48至72小时间隔，用EC145和附加化学治疗剂对患者多次注射(优选约2次，至多约50次)。可以在初次注射之后按数日或数月的间隔对患者施以EC145和附加药物的额外注射，并且所述额外注射可以防止癌症的复发。在另一实施方案中，用于附加化学治疗剂的方案不同于EC145。

[0251] 在一个实施方案中，在三周周期的第一周和第二周期间，一周两天将EC145作为2
2.5 mg静脉内推注施用。在另一实施方案中，在三周周期的第一天经1小时以75 mg/m施
2
用紫杉烷(如多西他赛)。在又一个实施方案中，可以组合此段中所述的实施方案。mg/m
2
的剂量是基于身体表面积的m计。

[0252] EC145和附加化学治疗剂的单位日剂量可以显著地变化，这取決于患者状态，治疗的疾病情况，化合物的纯度和它们的施用途径和组织分布，以及其它治疗处理（如辐射疗法）的共同使用的可能性。向患者施用的有效量是基于身体表面积、质量和患者状况的医师评估决定。有效剂量范围可以例如为约1 ng/kg至约1 mg/kg，约1μg/kg至约500μg/kg，和约1μg/kg至约100μg/kg。这些剂量是基于约70 kg的平均患者重量，并且所述kg是患者体重(质量)的kg数。

[0253] EC145和附加化学治疗剂可以各自按以下剂量施用：约1.0 ng/kg至约1000 μg/kg，约10 ng/kg至约1000μg/kg，约50 ng/kg至约1000 μg/kg，约100 ng/kg至约1000 μg/kg，约500 ng/kg至约1000 μg/kg，约1 ng/kg至约500 μg/kg，约1 ng/kg至约100 μg/kg，约1 μg/kg至约50 μg/kg，约1 μg/kg至约10 μg/kg，约5 μg/kg至约500 μg/kg，约10 μg/kg至约100 μg/kg，约20 μg/kg至约200 μg/kg，约10μg/kg至约500 μg/kg，或约50 μg/kg至约500 μg/kg。总剂量可以按单独或分开剂量施用，并且可以在医师的判断之下处于在本文中提供的典型范围之外。这些剂量是基于约70 kg的平均患者重量，并且所述"kg"是患者体重的千克数。医师将容易能够确定用于体重在所述范围外的受治疗者例如婴儿和老人的剂量。

[0254] 在另一实施方案中，EC145和附加化学治疗剂可以各自按以下剂量施用：约1μg/2 2 2 2 2 2
m至约500 mg/m ，约1μg/m至约300 mg/m ，或约100μg/m至约200 mg/m 。在其它实施
2 2
方案中，EC145和附加药物可以各自按以下剂量施用：约1 mg/m至约500 mg/m ，约1 mg/
2 2 2 2 2 2 2
m至约300 mg/m ，约1 mg/m至约200 mg/m ，约1 mg/m至约100 mg/m ，约1 mg/m至约
2 2 2
50 mg/m，或约1 mg/m至约600 mg/m 。总剂量可以按单独或分开剂量施用，并且可以在医
2
师的判断之下处于在本文中提供的典型范围之外。这些剂量是基于身体表面积的m数计。

[0255] 本文所述的结合物和化学治疗剂可以含有一个或更多个手性中心，或另外可以能够作为多个立体异构体存在。因此，应理解，本发明包括纯立体异构体以及立体异构体的混合物，如对映体、非对映体以及富含对映体或非对映体的混合物。本文所述的结合物和化学治疗剂可以能够作为几何异构体存在。因此，应理解，本发明包括纯几何异构体或几何异构体的混合物。

[0256] 应理解，本文所述的结合物和化学治疗剂可以非溶剂化形式以及溶剂化形式（包括水合形式）存在。一般说来，溶剂化形式等同于非溶剂化形式并且涵盖在本发明范围之内。本文所述的结合物和化学治疗剂可以以多种结晶或非晶形式存在。一般说来，所有物理形式对本发明所涵盖的用途是等同的，并且旨在处于在本发明范围之内。

[0257] 在另一实施方案中，用于EC145或附加化学治疗剂的施用的组合物和/或剂量形式是由纯度至少约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%、或约99.5%的化合物制备的。在另一实施方案中，用于EC145或附加药物的施用的组合物和/或剂量形式是由纯度至少约90%、或约95%、或约96%、或约97%、或约98%、或约99%、或约99.5%的化合物制备的。

[0258] 如本文中所用，纯度测定可以基于重量百分比、摩尔百分比等等。另外，纯度测定可以基于某些预定成分的缺乏或基本缺乏，如但不限于，叶酸，含有不含长春花药物的成分的二硫化物，氧化产物，不含有叶酸盐的二硫化物成分等等。还应当理解，纯度测定适用于由本文所述的方法纯化的化合物和组合物的溶液。在那些情况下，纯度测定（包括重量百分比和摩尔百分比测定）涉及除去溶剂的溶液的成分。在另一实施方案中，将EC145提供于无菌容器或包装中。

[0259] EC145或附加药物的纯度可以使用任何常规技术测定，所述技术包括各种色谱或光谱技术，如高压或高性能液相色谱法(HPLC)，核磁性共振波谱法，TLC，紫外线吸收光谱法，荧光光谱学等等。

[0260] 表面表达的维生素受体（如高亲合力叶酸盐受体）在癌细胞上过表达。卵巢、乳腺、结肠、肺、鼻、喉部和脑部的上皮癌均被报告表达高水平的叶酸盐受体。实际上，已知所有人卵巢肿瘤中的大于90%表达大量的这种受体。因此，本文所述的组合疗法可用于治疗各种各样的肿瘤细胞类型。

[0261] 本文所述的疗法可以用于人临床医学应用和兽医应用。因此，隐匿致病细胞种群并且用组合疗法治疗的寄主动物可以是人(即患者)，或在兽医应用的情况下，可以是实验室动物、农业动物、驯养动物或野生动物。本文所述的方法可以应用于人，实验室动物如啮齿类(例如小鼠、大鼠、仓鼠等)、兔子、猴子、黑猩猩，家畜如狗、猫和兔子，农业动物如奶牛、马、猪、绵羊、山羊，和圈养野生动物如熊、大熊猫、狮子、老虎、豹、象、斑马、长颈鹿、大猩猩、海豚和鲸。

[0262] 在一个方面，利用实体肿瘤的应答评价标准(RECIST)来表征治疗的应答。说明性地，该标准已从原WHO手册 (3)改编，考虑了对所有靶标损伤的最长直径的测量：完全应答(CR)—所有靶标损伤的消失；部分应答(PR)—靶向损伤的最长直径的总和降低至少30%，取基线总和最长直径作为参考；稳定疾病(SD)—不足以收缩到符合PR又不足以增加到符合PD，取治疗开始后的最小总和最长直径作为参考；渐进性疾病( PD)—靶向损伤的最长直径的总和增加至少20%，取治疗开始后记录的最小总和最长直径或一个或更多个新损伤的表观作为参考。其它标准包括总肿瘤应答率(ORR = CR + PR)，疾病控制率(DCR = CR + PR + SD)，和总存活率(OS)—给定患者的死亡时间定义为从患者接受治疗方案的第一天到患者死亡的日期的天数。

[0263] 在一个实施方案中，提供一种在需要治疗的患者中治疗表达叶酸盐受体的上皮肿瘤的方法，所述方法包含结合治疗有效量的附加化学治疗剂施用治疗有效量的EC145。EC145和附加化学治疗剂可以以一种或更多种组合物同时施用，或顺序地施用。另一个实施方案是EC145与附加化学治疗剂组合用于治疗患者中表达叶酸盐受体的上皮肿瘤的用途。
进一步的实施方案是EC145用于制造与附加化学治疗剂组合疗法患者中表达叶酸盐受体的上皮肿瘤的药剂的用途。

[0264] 对于本文所述的任何方法、用途、组合物、药用组合物、组合、或试剂盒，表达叶酸盐受体的上皮肿瘤的实施方案是卵巢肿瘤、子宫内膜肿瘤或非小细胞肺(NSCLC)肿瘤。NSCLC的治疗可以在任何阶段进行，包括0期、I期、II期、IIIA期、IIIB期、或IV期。对于任何上述方法、用途、组合物、药用组合物、组合、或试剂盒，表达叶酸盐受体的上皮肿瘤的另一个实施方案是卵巢肿瘤。卵巢肿瘤可以是耐铂的或铂敏感的。

[0265] 在另一实施方案中，对于任何方法、用途、组合物、药用组合物、组合、或试剂盒，EC145是具有下式的化合物或其药用可接受的盐。

[0266]

[0267] 如本文中所用，EC145可以离子形式（包括质子化形式）存在于溶液或悬浮体中。

[0268] 在一个实施方案中，提供在需要治疗的患者中治疗耐铂卵巢癌的方法，所述方法包含结合治疗量的附加化学治疗剂施用治疗量的EC145。在另一实施方案中，提供EC145与附加化学治疗剂组合用于治疗患者中的耐铂卵巢癌的用途。在另一实施方案中，提供EC145用于制造与附加化学治疗剂组合用于治疗患者中耐铂卵巢癌的药剂的用途。

[0269] 对于上文关于使用与附加化学治疗剂组合的EC145治疗耐铂卵巢癌所述的任何方法、用途、药用组合物、组合物、组合、或试剂盒，一个实施方案是其中EC145或附加药物的纯度为至少90%的实施方案。另一个实施方案是其中将EC145或附加化学治疗剂提供在水性无菌液体制剂中的实施方案。

[0270] 在另一实施方案中，描述选择用于治疗的患者的方法，其中该方法包含以下步骤：向患者施用包含与锝的同位素组合的EC20的组合物，如PCT/US2010/043992中所述(EC20结构描述于PCT/US2010/043992，现作为WO 2011/014821公布)，其公开内容以引用方式全文并入本文，其中如果患者表达的叶酸盐受体达到至少FR+ (即至少一个损伤表达叶酸盐受体)或FR++ (即所有损伤表达叶酸盐受体)的水平，则将所述患者选择用于疗法。在该成像程序的一个实施方案中，用0.5 mg叶酸注射该患者，随后1至3分钟内，注射由20至
99m
25 mCi的 Tc标记的0.1 mg EC20 1至2 mL，并且随后执行1至2小时成像。在一个实施方案中，成像法选自平面成像、SPECT成像、和SPECT/CT成像。

[0271] 在另一实施方案中，本文所述的方法、组合物、药用组合物、组合、试剂盒和用途包括以下实施例。所述实施例还说明本文所述的本发明的各种实施方案的附加特征。然而，应理解，所述实施例是说明性的而并不应解释为限制本文所述的本发明的其它实施方案。另外，应理解，实施例的其它变型被包括在本文所述的本发明的各种实施方案内。实施例

[0272] 材料

[0273] N10-三氟乙酰基蝶酸购自Eprova AG，Schaffhausen，Switzerland。肽合成试剂购自NovaBiochem和Bachem。从J.T. Baker购买纤维素板和DEAE离子交换板。从A. K. Scientific (Mountain View, CA)购买紫杉醇。从Purdue Pharmacy (West Lafayette, IN)购买Taxotere和abraxane。

[0274] 方法

[0275] 体内抗肿瘤实验。

[0276] 将四至六周大的雌性nu/nu小鼠(Charles River, Wilmington, MA)或六至七周大的雌性Balb/c小鼠(Harlan Sprague Dawley, Inc. , Indianapolis, IN)维持在标准12小时亮-暗周期上并且在实验的持续时间内无限制喂食贫叶酸盐食物( Harlan diet #_TD00434, Harlan Teklad, Madison, WI)。使用含有10%热灭活胎牛血清(HIFCS)无叶酸盐RPMI介质(FFRPMI) ，在37℃下5% CO2/95%空气加湿气氛中且无抗菌素情况下，使FR阳性人鼻咽KB细胞和人卵巢IGROV细胞以单细胞层的形式连续地培育。同系FR阳性Madison 109 (M109)肺癌细胞从M109肿瘤中产生，并且在植入小鼠之前数天，在含有10%
6
HIFCS的FFRPMI中培养数天。将100μL中KB细胞(每个nu/nu小鼠1×10 )、M109细胞
6 6
(每个Balb/c小鼠1×10)、IGROV细胞(每个nu/nu小鼠4×10 )注射入背内侧区的皮下组织中。将小鼠分为五组，并且新制备测试物品并且在无菌状况下在体积为200μL的磷酸
3
盐缓冲盐水(PBS)中通过侧尾部静脉注射。典型地当肿瘤体积为大约100-200 mm时，开始静脉内(i.v.)治疗。对照组中的小鼠不接受治疗。各s.c.肿瘤生长，随后在治疗期间每周
3
测量肿瘤三次，此后每周测量两次直至达到1500 mm的体积。在两个垂直方向上使用游标
2
卡尺测量肿瘤，并将其体积计算为0.5×L×W，其中L = 最长轴的测量值(mm)并且W =垂直于L的轴的测量值(mm)。作为毒性的一般测量，按照与肿瘤体积测量相同的安排测定体重的变化。每日监测动物的存活率。使垂死(或不能获得食品或水)的动物通过CO2窒息安乐死。根据美国实验室动物照料评审协会准则(American Accreditation Association of Laboratory Animal Care guidelines)，执行所有体内研究。

[0277] 对于个体肿瘤，将部分应答(PR)定义为体积退化>50%，但始终保持可测量的肿瘤3 3
(> 2 mm)。将完全应答(CR)定义为直至研究结束为止某些位置的可测量肿瘤块(< 2 mm)消失。将治愈定义为在研究期限内无肿瘤再生长的CR。

[0278] 实施例

[0279] EC145与多西他赛的组合疗法：

[0280] 具有KB肿瘤(范围144-212 mm3)的随机nu/nu小鼠是(a)未治疗的；或如下：(b)1μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (d) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗的，或 (c) 1μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周治疗的。
治疗时期的肿瘤应答参见图1，且重量变化参见图2。单独采用多西他赛的治疗未产生部分应答、完全应答或治愈。组合疗法产生5个治愈。
实施例

[0281] EC145与Abraxane的组合疗法：

[0282] 具有KB肿瘤(范围103-173 mm3)的随机nu/nu小鼠是(■)未治疗的；或用：(●) 1μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 20 mg/kg的Abraxane (紫杉醇等价物)，TIW 1周中任一项治疗的，或 (▼) 1μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 20 mg/kg的Abraxane(紫杉醇等价物)，TIW 1周治疗的。治疗期间的肿瘤应答参见图3，和治疗期间的重量变化参见图4。
实施例

[0283] EC145与克列莫佛/乙醇中的紫杉醇的组合疗法：

[0284] 具有KB肿瘤(范围111-173 mm3)的随机nu/nu小鼠是(■)未治疗的；或用：(●)1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 20 mg/kg的紫杉醇，克列莫佛（Cremophor）/乙醇中TIW 1周中任一种治疗的，或 (▼) 1 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+克列莫佛/乙醇中20 mg/kg的紫杉醇，TIW 1周治疗的；或者(◆)单独的克列莫佛/乙醇赋形剂治疗的。治疗时期的肿瘤应答参见图5，和治疗时期的重量变化参见图6。
实施例

[0285] 具有IGR-OV1(人卵巢)肿瘤的小鼠(■)是未治疗的；或用：(●) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周；或 (▲) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗的；或 (▼) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周 + 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周治疗的。治疗时期的肿瘤应答参见参见图7，和治疗时期的重量变化参见图8。实施例

[0286] 具有M109肿瘤的小鼠是(a)未治疗的；或用：(b) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW2周；或 (d) 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周中任一种治疗的；或 (c) 2 μmol/kg/注射的EC145，TIW 2周+ 10 mg/kg的多西他赛，TIW 1周治疗的。治疗时期的肿瘤应答参见参见图9，和治疗时期的重量变化参见图10。

[0287] 化合物实施例

[0288] 材料

[0289] 根 据 US 7,601,332 或WO 2011/014821 的 描 述 或 如 下 文 所 述 (PCT/US2011/037134)，制备EC145 API (活性药品)。

[0290] 其它材料、工具和设备得自商业来源，包括以下：注射用水(WFI)；柠檬酸三钠二水合物，EMD 1.06432.0500；柠檬酸，JT Baker 0122-01；甘露糖醇，JT Baker 2553-01；氩气；氮气；过滤器，Pall 12122；管道；小瓶，Wheaton #_ 223685/W008230, 5 mL, 20 mm，管式，I型玻璃；瓶塞，(West pharmaceutical #19700021或19700022) 20 mm, S-10-F451,4432/50 灰色w/ B2-40涂层(血清瓶塞)；Crimps, 蓝色 (具有血清瓶塞) ；瓶塞，West 20 mm 4432/50, S-87-J, 灰色w/ B2-44涂层(裙部开槽冷冻干燥瓶塞)；Crimps, Helvoet Pharma 110009704, 棕色6028 (具有裙部开槽冷冻干燥瓶塞)；Milli-Q水，Millipore Direct Q 3 UV System；磷酸二氢钠一水合物，Mallinckrodt 7868；磷酸氢二钠二水合物，Fisher S472-500；氯化钠，Mallinckrodt 7581；氯化钾，Fisher P330-500；柠檬酸钠二水合物，Aldrich 39,807-1；蔗糖，Sigma S3929-1KG；氢氧化钠，JT Baker 3278-01；盐酸，EMD HX0603P-S；冰乙酸，EMD AX0074-6；乙酸三乙胺，Fisher, 04885-1；5 N氢氧化铵，Acros, AC612570010；乙腈，Sigma-Aldrich 34851-4L；HPLC柱，Waters Symmetry C18, 3.5 µm,
4.6×75mm, P/N WAT066224；保护柱，Waters Symmetry C18, 5 µm, 3.9×20 mm, P/N WAT054225。

[0291] 工具和设备

[0292] HPLC: Waters Alliance 2695，具有Waters 2487双λ吸收检测器；HPLC: Agilent 1200，具有PDA检测器；pH计，pH-08, Corning 340；高压锅，Hotpack蒸汽杀菌器，PE5-004；烘箱，VWR 1370FM；烘箱，Gruenberg干热烘箱；天平，Sartorius R300S；天平，Sartorius CP34001；泵，Watson Marlow 505S；移液器，Eppendorf Repeater Plus，具有50 mL Combitips；冷冻干燥器：FTS LyoStar II，具有LyoManager II数据汇集；封口机，Westcapper NPW-500, 5A-018。

[0293] 本文中使用对溶剂、试剂和保护基通用的缩写。CDSI用于表示氨甲酰基二硫化物中间体(4)。

[0294] 在实施例中用于馏分和样品评价的HPLC方法包括以下：

[0295] EC145-CMC-IP-0001

[0296] 样品制备：用8 M盐酸胍将材料烯释至大约0.5 mg/mL。

[0297] 柱：Waters XBridge BEH C18, 3.5 µm, 2.1×100 mm.

[0298] 移动相：A) 500 mM 碳酸氢铵，pH 9.2; B) 75:25乙腈-甲醇。

[0299] 注射体积：10 µL

[0300] UV检测：280 nm

[0301] 柱温度：50℃

[0302] 样品温度：5℃

[0303]

[0304] EC145-CMC-AM-0001 (版本 2.3)

[0305] 样品制备：用磷酸酯缓冲盐水或1:1乙腈-水(v/v)将材料烯释至大约1 mg/mL。

[0306] 管柱：Waters Symmetry C18, 3.5 µm, 4.6×75 mm.

[0307] 移动相：A) 10 mM 三乙铵乙酸盐，pH 7.5; B) 乙腈。

[0308] 注射体积：10 µL

[0309] UV检测：280 nm

[0310] 柱温度：25℃

[0311] 样品温度：5℃

[0312]实施例

[0313] EC119的制备

[0314]

[0315] (EC119)

[0316] 使用Fmoc基固相化学如下合成EC119：

[0317] 第一次偶合

[0318] 将2-氯三苯甲基氯树脂加入肽合成器皿。在DMF (10mL/g树脂)中溶胀。用DMF(10mL/g树脂)洗涤2次。添加0.8当量的DCM/DMF中的Fmoc-Cys (Trt)-OH。添加2当量的DIPEA。搅拌30分钟。添加甲醇(1mL/g树脂)并且搅拌10分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。用DMF洗涤3次。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至
20分钟。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。用DMF洗涤3次。
用MTBE洗涤3次。执行Kaiser测试以确认该偶合完成。

[0319] 第二次偶合

[0320] 用DMF(10mL/g树脂)洗涤3次。添加DMF中的2当量的Fmoc-Asp (OtBu)-OH。添加DMF中的2当量的HOBt。添加2当量的DIC。搅拌1.5至3小时。用Kaiser测试确
认偶合。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。用DMF洗
涤3次。用MTBE洗涤3次。执行Kaiser测试。

[0321] 第三次偶合

[0322] 用DMF洗涤3次。添加DMF中的2当量的Fmoc-Asp (OtBu)-OH。添加DMF中的2当量的HOBt。添加2当量的DIC。搅拌1.5至3小时。用Kaiser测试确认偶合。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗
涤3次。执行Kaiser测试。

[0323] 第四次偶合

[0324] 用DMF洗涤。添加DMF中的2当量的Fmoc-Asp (Pbf)-OH。添加DMF中的2当量的HOBt。添加2当量的DIC。搅拌1.5至3小时。用Kaiser测试确认偶合。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3
次。执行Kaiser测试。

[0325] 第五次偶合

[0326] 用DMF洗涤3次。添加DMF中的2当量的Fmoc-Asp (OtBu)-OH。添加DMF中的2当量的HOBt。添加2当量的DIC。搅拌1.5至3小时。用Kaiser测试确认偶合。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗
涤3次。执行Kaiser测试。

[0327] 第六次偶合

[0328] 用DMF洗涤3次。添加DMF中的2当量的Fmoc-Glu-OtBu。添加DMF中的2当量的HOBt。添加2当量的DIC。用Kaiser测试确认偶合。用MTBE洗涤2次。用DMF洗涤2次。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。添加DMF中的0.1M HOBt中6%哌嗪并且搅拌10至20分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。执行Kaiser测试。

[0329] 第七次偶合

[0330] 用DMF洗涤3次。添加最小量的DMSO中的1.2当量的N10-TFA-Pte-OH。添加DMF中的1.2当量的HOBt。添加DMF中的1.2当量的PyBOP。添加2.4当量的DIPEA。搅拌3至5小时。用Kaiser测试确认偶合。用DMF洗涤2次。用MTBE洗涤2次。

[0331] 去保护–除去三氟乙酰基

[0332] 用DMF洗涤2次。添加DMF中2%肼并且搅拌5分钟。添加DMF中2%肼并且搅拌5分钟。添加DMF中2%肼并且搅拌5分钟。用DMF洗涤3次。用MTBE洗涤3次。在真空
且室温下干燥该树脂。

[0333] 从树脂上裂解

[0334] 向烧瓶添加含有85% TFA、2.5%三异丙基硅烷、2.5%水和10%乙二硫醇的裂解试剂(10mL/g树脂)。在冰浴中冷却该混合物。添加该树脂并且允许在室温下反应2至3小时。过滤并收集滤液。将滤液加入冷MTBE (每1 mL滤液10mL MTBE)。在0至5℃下搅拌30±分钟。通过介质多孔性玻璃过滤器，过滤沉淀产物。用冷MTBE洗涤沉淀3次。在真空且室温下干燥该产物。在氮气且-20℃下储存。

[0335] 纯化

[0336] 使用反相C18柱(6英寸柱，2.8kg，10 μm, 100Å)通过制备型HPLC，纯化粗制EC119。移动相是0.5% NH4OAc (A)和0.5% NH4OAc/ACN (1:4) (B)。40g该粗制EC119溶于1-5% TFA，通过1 μm玻璃纤维过滤器过滤并且加载于6英寸柱上。收集馏分并抽样用于HPLC分析。在氮气下使用50% AcOH以沉淀该产物以便收集之后，立即将各馏分的pH调整到3至4。将沉淀产物离心，用0.1% AcOH洗涤并储存于2至8℃下直到进一步处理。容器在离心操作期间用氮气清空以降低氧化的可能性。池标准(pool criteria)是纯度≥98%，2 3 5 6
D-Arg4、D-Glu和D-Asp 的同分异构体≤0.25%，其它杂质≤0.5%。D-Asp 、D-Asp和D-Cys的异构体通过Prep-HPLC不能除去并且应在合成工艺中被抑制。满足所述池标准的材料尽快冷冻干燥(EC119溶液和湿沉淀不稳定)。最终产物的纯度大于98%。包括固相合成和纯化的纯EC119的总收率为大约40%。该产物在氮气下包装于琥珀玻璃瓶中并储存于- 20℃下。
实施例

[0337] A.长春花碱硫酸盐典型转化成去乙酰长春碱酰肼

[0338]

[0339] 材料

[0340] 长春花碱硫酸盐：USP; FW = 909.05 g/mol; 甲醇：无水；肼：无水；FW =32 g/mol; 去离子水；乙酸乙酯：LC/GC级；甲苯：LC/GC级；磷酸二氢钠：≥99.0%; FW = 120 g/mol; 磷酸氢二钠：≥99.0%; FW = 142 g/mol; 氯化钠：试剂级；FW = 58.4 g/mol; 硫酸钠：无水；5-降冰片烯 -2-甲酸。

[0341] 过程

[0342] 反应、提取加工和分离是在氮气或氩气气氛下进行。使用压力过滤器除去硫酸钠并且俘获产物。用于猝灭和洗涤的氯化钠溶液用氮气或氩气鼓泡，直至溶解的氧水平不大于0.9 ppm为止。

[0343] 将长春花碱硫酸盐和无水甲醇装填至经氩气吹扫的反应器。将5-降冰片烯-2-甲酸和无水肼加入反应器。搅拌混合物，并且在固体溶解之后，将混合物加热至约60℃。通过HPLC分析，当反应完成时，将其冷却、猝灭并提取到乙酸乙酯中。在干燥之后，产物从乙酸乙酯和甲苯中结晶。固体在真空下室温下干燥过夜。

[0344] 缓冲NaCl含有：10.0 g NaCl, 7.10 - 7.30 g NaH2PO4, 4.40 - 4.60 g Na2HPO4和90 mL水。用氩气或氮气鼓泡该溶液(溶解的氧含量< 0.9 ppm)。

[0345] 典型的分离收率为理论最大值的50-60%。

[0346] B. EC145方法的步骤 2和 3

[0347]

[0348] 步骤2和步骤 3方法

[0349] 材料

[0350] 去乙酰长春碱酰肼：FW=768.9 g/mol; 20.5 g, 26.7 mmol; 混合碳酸盐 (3): FW=384.9 g/mol; 10.7 g, 27.8 mmol; 乙腈：适量；三乙胺：FW=101.2 g/mol; 2.67 g, .26.4 mmol; Na2PO4 7 H2O:47.84 g; EC119:29.9 g 28.6 mmole; 0.5 N HCl:适量; WFI: 适量

[0351] 过程

[0352] 注意，此方法中使用的所有水是注射用水(WFI)。

[0353] 用氩气吹扫合适器皿。装填20.5±0.3 g的去乙酰长春碱酰肼；该装填量经效能调整，即，如果效能是90.0%，则该装填将为22.8 g。装填10.7±0.2 g的混合碳酸盐(经效能调整)。装填800±30 mL乙腈和2.67±0.11g三乙胺。在氩气下于10至14℃下混合20至28小时。取得样品用于HPLC (EC145-CMC-AM-0001，版本2.3)。预期结果是CDSI与酰肼的比率> 25:1。如果不是，则在氩气下于10至14℃下继续混合2至4小时并且再次抽样。

[0354] 用氩气鼓泡780至820 mL水，直至溶解氧水平小于0.9 ppm；记录溶解的氧水平。将47.8±0.5 g磷酸二氢钠七水合物溶解于该脱氧水中。向合适的容器，加入29.8±0.5 g EC119；(装填量经效能调整)。将磷酸钠溶液加入EC119中并在氩气下混合。测量溶液的pH，并且如有必要，则用0.5 N HCl将该pH调整到5.8至6.2。

[0355] 将缓冲EC119溶液加入该反应混合物。在氩气下于20至25℃下混合60至75分钟。取得样品用于HPLC (EC145-CMC-AM-0001，版本2.3)。如果EC145与CDSI的比率≥25:1，则继续进行。如果不是，则在在氩气下于20至25℃下继续混合并再次抽样。如果EC145与CDSI的比率≥ 25:1，则继续进行。如果不，则加入额外的1 g EC119并在氩气下于20至
25℃下混合30分钟并再次抽样。

[0356] 制备6.9 L至7.1 L 25 mM磷酸盐缓冲液（185至195 mM NaCl，pH 7.2至7.5），用氩气鼓泡水直至溶解的氧水平小于0.9 ppm而制得。用此缓冲液烯释所述反应混合物。如果该混合物发展超过薄雾，则产物溶液需要过滤（Whatman Polycap TC75或TC150，0.45或1.0微米）；可以在将产物加载到Biotage柱上的同时进行该过滤。

[0357] 液相色谱纯化

[0358] 使用Biotage 150M, C18柱体。这一尺寸的柱体可以容纳目前所述柱体的尺寸的两倍的反应混合物。

[0359] 柱制备：

[0360] a.用以下冲洗该柱

[0361] i.12 - 13 L乙腈

[0362] ii.12 - 13 L80%乙腈和20%水 (v/v)

[0363] iii.12 - 13 L50%乙腈和50%水 (v/v)

[0364] iv.12 - 13 L10%乙腈和90%水 (v/v)

[0365] 纯化：

[0366] 制备25 mM磷酸盐缓冲液，(185 – 195 mmol) NaCl, pH 7.3 – 7.5

[0367] 用氩气鼓泡该缓冲液直至溶解的氧含量≤0.9 ppm。

[0368] 制备：缓冲盐水中41 L的10%乙腈(v/v)；缓冲盐水中13 L的16%乙腈(v/v)，缓冲盐水中52 L的27%乙腈(v/v)。

[0369] 检查移动相溶液的溶解的氧含量。如果溶解氧含量大于0.9 ppm，则用氩气或氮气鼓泡移动相直至溶解的氧水平≤0.9 ppm。

[0370] 用26至27 L的10%乙腈移动相冲洗该柱。

[0371] 将产物溶液加载到柱上。

[0372] 使用以下顺序的移动相洗脱该产物：

[0373] i.13 -14 L 10%乙腈移动相。

[0374] ii.13 L 16%乙腈移动相。

[0375] iii.51 -52 L 27%乙腈移动相。

[0376] 注意：直列式UV检测器是有益的；在带宽为8至13 L的15至19 L的27%乙腈移动相处开始，应该出现产物。

[0377] 馏分评价

[0378] i.HPLC方法 EC145-CMC-IP-0001

[0379] ii.通过馏分 = ≥ 97.0% EC145和杂质不 ≥ 0.8%

[0380] 运行后的柱处理：

[0381] 该柱可以再使用一次。如果该柱将用于第二次运行，则执行ii至iv。

[0382] i.用12至13 L 1:1乙腈-水冲洗该柱

[0383] ii.用20至22 L乙腈冲洗该柱

[0384] iii.重复柱制备步骤ii至iv。

[0385] 超滤

[0386] 用氩气或氮气鼓泡适量水，直至溶解氧水平小于0.9 ppm为止。将通过的色谱法馏分组合并用等体积的鼓泡水组合并烯释。使用标称MW截止值为1000的微孔再生纤维素膜(cat#_ CDUF002LA)组装超滤设备，并用9 L脱氧水漂洗它。开始产物溶液的超滤。维持30至50 psi的反压。继续超滤，直至滞留物体积为2至3 L。添加11至12 L脱氧水。继续超滤，直至滞留物体积为2至3 L。添加11至12 L脱氧水。继续超滤，直至滞留物体积为2至3 L。添加8至10 L脱氧水。继续超滤，直至滞留物体积为2 L。必须通过GC和浓缩分析滞留物的样品，确定超滤终点。规格为每毫克的EC145，≤50微克的乙腈。如果未实现，则执行另一循环的超滤。该API溶液的浓度必须调整以便包装材料为6至12 mg/mL。在超滤完成时，用1 L水漂洗该设备。因此，在必要时继续超滤或添加水。一旦产物溶液离开超滤设备，则用1 L脱氧水漂洗该超滤设备并且与产物溶液组合。

[0387] 在该漂洗液与产物溶液合并之后，该溶液必须通过0.2微米绝对过滤器过滤，并且包装该滤液(在惰性气氛下执行)。

[0388] 分离产物的典型收率为理论最大值的50至60%。实施例

[0389] 冷冻干燥EC145

[0390] 总体积22 mL的两小瓶EC145水溶液在环境温度下解冻，并且转移到四个20 mL冷冻干燥小瓶中。将小瓶转移入冷冻器大约1.5小时。使用LABCONCO冷冻干燥器进行冷冻干燥，所述LABCONCO冷冻器干燥器在加载样品之前被预冷却至- 72℃(搁板温度)。样品在- 20℃下冷冻干燥约30分钟，随后再于20℃下干燥38.5小时。所得蓬松浅黄色固体合并到一个小瓶中用于进一步表征。

[0391] 制剂

[0392] 水性制剂：

[0393] 以下提供这样的制剂，其可以1.4 mg/mLEC145的浓度提供EC145。单独的小瓶用于提供2.5 mg大丸剂剂量的EC145。实施例

[0394] pH 7.4，磷酸盐缓冲的EC145制剂

[0395] 以下制剂提供用于静脉内(IV)施用的EC145药品，作为在具有Flurotech™ -涂层橡胶瓶塞的单独使用的透明玻璃瓶（其在惰性气体下冷冻储存）中的2.0 mL水性无菌液体制剂（pH 7.4）。各小瓶含有1.4 mg/mL EC145。药品的定量组成示于下表。单独的小瓶用于提供2.5 mg大丸剂剂量的EC145。该制剂提供10 mM磷酸盐缓冲液：pH 7.4；138 mM氯化钠，和2.7 mM氯化钾。

[0396] EC145药品成分

[0397] 。

[0398] 实施例

[0399] pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的 EC145制剂

[0400] 以下制剂提供一种溶液，其为50 mM柠檬酸盐缓冲的pH 6.2的EC145溶液。

[0401] EC145药品成分

[0402] 。

[0403] 用于冷冻干燥的制剂。实施例

[0404] 具有3%甘露糖醇的 pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的 EC145制剂

[0405] 以下制剂提供一种溶液，其为pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的EC145溶液，所述EC145溶液含有3%甘露糖醇作为可用于冷冻干燥和复水的增容剂。

[0406] EC145药品成分

[0407] 。实施例

[0408] 具有4%甘露糖醇 /1%蔗糖的 pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的 EC145制剂

[0409] 与上文3%甘露糖醇所述相同的制剂，但具有80 mg甘露糖醇和20 mg蔗糖。实施例

[0410] 安慰剂，具有3%甘露糖醇的 pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的 EC145制剂

[0411] 以下制剂提供一种安慰剂溶液，其为pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的溶液，所述溶液含有3%甘露糖醇作为可用于冷冻干燥和复水的增容剂。

[0412] 安慰剂产品成分

[0413] 。实施例

[0414] 冷冻干燥的EC145和安慰剂药用组合物的制备

[0415] 用含有3%甘露糖醇的EC145小瓶、含有4%甘露糖醇/1%蔗糖的EC145小瓶和安慰剂小瓶(无EC145 API)，运行冷冻干燥周期。将探针置于EC145溶液小瓶和安慰剂小瓶中以记录周期期间的溶液温度。在将最终产物暴露于空气之前，所有周期用氩气回填，并且所述小瓶在冷冻干燥器中塞紧。在塞住之后，立即将小瓶摺扎并标记。

[0416] 在不同参数的若干次冷冻干燥中，含3%甘露糖醇的小瓶与含4%甘露糖醇/1%蔗糖的小瓶之间未见明显差异。实施例

[0417] 配制方法的描述

[0418] 用过量WFI装填大烧瓶，并用惰性气体鼓泡30分钟以将氧含量降低至< 1.0 ppm。用过程中的测试确认配制开始之前的氧含量。在整个配制过程中，在配制溶液上维持持续的正压惰性气体覆盖层。

[0419] 将冷冻的EC145药物物质(API)溶液从冷藏箱中移除，并在20℃至-25℃控温循环水浴中解冻。将解冻的API溶液加入称皮重的惰性气体吹扫的器皿，以确定待配制API溶液的量。基于密度和溶液中的EC145浓度，加入称皮重器皿的溶液的重量用于确定可按1.4 mg EC145/mL填充的总计最终溶液。

[0420] 称重具有搅拌棒的器皿，并用WFI的最终填充体积的62.5%总体积来装填。添加甘露糖醇以提供3%甘露糖醇的最终浓度。将柠檬酸钠加入该器皿，随后用鼓泡的WFI漂洗。将柠檬酸加入该器皿，随后用鼓泡的WFI漂洗。混合鼓泡的溶液，直至所有柠檬酸溶解。

[0421] 用pH 4和7缓冲标准使pH计标准化，以测量溶液的pH。如果pH值不是6.0至6.2，则用1.0M柠檬酸或1.0M柠檬酸钠调整pH值。

[0422] 器皿包裹于箔中以保护EC145以免光照。伴随搅拌和惰性气体鼓泡将EC145药物物质溶液加入配制器皿。用WFI溶液将含药物物质的器皿漂洗两次。伴随鼓泡搅拌该混合物，直至获得视觉上均匀的混合物为止。确定最终目标制剂重量，并且用WFI将该溶液充填至目标重量。

[0423] 溶液通过0.22微米无菌过滤器过滤，使用蠕动泵进行预湿润和起泡点测试。在整个过滤过程中，维持接收器皿的惰性气体吹扫。过滤后，重复起泡点测试以确保在整个过程中维持有效过滤。

[0424] 校准填充头，以向各小瓶递送2.03克( 2.0 mL, 2.8 mg EC145)的EC145制剂溶液。在填充过程期间，常规地检查填充量。

[0425] 在填充过程中，瓶塞在小瓶上半塞。

[0426] 将热电偶置于冷冻干燥托盘中的合适小瓶内，并且按照每定义的周期，冷冻干燥所述托盘。实施例

[0427] 冷冻干燥周期

[0428] 使用上面描述的含3%甘露糖醇的pH 6.2的柠檬酸盐缓冲的EC145溶液(5 mL小瓶中2 mL)的以下冷冻干燥周期提供具有令人满意的饼状表观的冷冻干燥EC145制剂，其容易地水中复水，并且保持高API纯度(>95%)。

[0429] 小瓶用氩气鼓泡，用2 mL EC145制剂填充，用裙部开槽的冷冻干燥瓶塞以半塞位置塞住。一旦托盘被填充和塞紧，则将其置于5℃下冷冻干燥器中。

[0430] 1. 将冷冻干燥器搁板预冷却至5℃。

[0431] 2. 将填充的托盘加载到预冷却搁板上。

[0432] 3. 在加载完成之后，启动冷冻干燥周期。

[0433] 4. 搁板温度在5℃下保持30至60分钟

[0434] 可选地，将搁板预冷却至-50℃到5℃，这使得可减少预冷却所述填充托盘的时间；并且可能不需要步骤4。

[0435] 5. 立即将搁板温度升至-50℃。

[0436] 6. 搁板温度在-50℃下保持60至360分钟。

[0437] 7. 将腔室压力降低至50到150 mTorr。

[0438] 8. 搁板温度在-50℃下保持180至1740分钟。

[0439] 9. 经历73分钟将搁板温度升至-37℃(0.20℃/分钟)。

[0440] 10.搁板温度在-37℃下保持60至720分钟。

[0441] 11.经历150分钟将搁板温度升至-20℃(0.11℃/分钟)。

[0442] 12.搁板温度在-20℃下保持60至360分钟。

[0443] 13.经历60至360分钟将搁板温度升至20℃到30℃。

[0444] 14.搁板温度在20℃至30℃下保持60到600分钟。

[0445] 15.用氩气或氮气将腔室回填至12.5 psia (870毫巴)。

[0446] 16.毁坏所述搁板(全塞小瓶)。

[0447] 17.用过滤的空气回填至大气压力。

[0448] 18.卸载冷冻干燥器。

[0449] 上述冷冻干燥循环的具体实例（5℃下初次冷却30分钟）可以概述形式如下表示：

[0450] ，

[0451] 随后将小瓶封口以提供作为令人满意滤饼的在各小瓶中的最终产物。

[0452] 抗肿瘤实验

[0453] 先前发现，在严重预处理的NSCLC患者中的单药EC145的II期研究中(6个前期化学疗法方案的中值) ，肿瘤损伤全部表达叶酸盐受体(FR++)的亚组具有7.1个月的有希望的延长无进展存活期和10.8个月的总存活期。疾病的KB模型中的体外和体内研究显示EC145和TAXOTERETM 之间的良好协同作用。

[0454] 在肿瘤损伤全部表达叶酸盐受体(FR++)的第二线NSCLC患者中，测量单药EC145TM相对目前标准TAXOTERE 的活性。

[0455] 用EC145加TAXOTERETM的组合，治疗第二线NSCLC (非小细胞肺癌)患者的两个亚组中的患者：(1) 肿瘤损伤全部表达叶酸盐受体(FR++)的患者，和 (2) 具有至少一个而不是全部表达叶酸盐受体的损伤(FR+)的患者。

[0456] 在治疗期间测定以下测量值：无进展存活期(PFS)；总肿瘤应答率(ORR = CR+PR)；肿瘤应答的持续时间(DOR)；疾病控制率(DCR = CR+PR+SD)；DCR的持续时间；和总TM TM存活期(OS)。其它测试为采用EC145、EC145+TAXOTERE 和TAXOTERE 单药的安全性和耐
99m
受性，以及 Tc-EC20治疗的安全性和耐受性。

[0457] 筛选患者，用于包括在通过采用99mTc-EC20成像的平面及单光子发射计算断层照相(SPECT)的研究中。

[0458] 满足资格标准的合格患者被随机至(1:2:2)三个治疗方案中的一个：单独采用TM TMEC145的治疗(分部A)，采用EC145+TAXOTERE 的组合治疗(分部B)，或采用TAXOTERE 的单独治疗(分部C)。

[0459] 针对从最后一次化疗后的时间(<3个月对≥3个月)，对最后一次化疗的最佳应答(目标肿瘤应答/稳定疾病对渐进性疾病/未知)，阶段(IIIB对IV)，和采用EGFR抑TM TM制剂的前期治疗(是对否)，对研究的TAXOTERE 分部和TAXOTERE + EC145分部（FR+对FR++），对患者随机化分级。

[0460] 99mTc-EC20施用：在EC20成像程序之前，患者接受0.5 mg叶酸的一次静脉内(IV)99m
注射，随后1至3分钟内，注射由20至25 mCi的 Tc标记的0.1 mg EC20 1至2 mL。在
99m
注射 Tc-EC20后1至2小时，患者经历平面成像(大腿中部至头，臀部和头部图像)。在采集平面图像后，立即获得已知含有靶标损伤的区域的SPECT图像。如果在SPECT成像之前不能识别含有肿瘤的解剖区域，则采集胸部/腹部和腹部/骨盆的SPECT (或SPECT/计算断层照相[CT])图像。

[0461] EC145施用(分部A和B)：在3周周期的第一周和第二周期间，在周一和周三，将EC145作为2.5 mg IV推注施用。

[0462] TAXOTERETM施用(分部B和C)：在3周周期的第一天，经历1小时，以75 mg/m2 IV施用TAXOTERE。针对安全性，将密切观察组合分部B中的前3个患者。在每2个周期结束时，用CT评价患者。

[0463] 分部A: EC145(n=60 FR++):2.5 mg IV; 在3周周期的第一周和第二周期间，周一和周三。

[0464] 分部B: EC145+ TAXOTERETM(n= 60 FR++,60 FR+) ，如分部A和分部C安排。

[0465] 分部C: TAXOTERETM (n=60 FR++,60 FR+)。

[0466] 测定在治疗分部中的无进展存活期(PFS)。首要关注的对比是：EC145 + TM TM TMTAXOTERE 对TAXOTERE ( FR+和FR++单独亚组)和EC145对TAXOTERE (仅FR++)。

[0467] 统计分析：

[0468] 显著性水平为单侧α=0.10，并对多次测试无调整。

[0469] 对上述对比的中每一个而言，来自120位患者的94起PFS事件提供大约75%的可TM能性检测到等于0.67的危害比。假设对于TAXOTERE 中值PFS为3个月，则在测试分部中，所述危害比对应于4.5个月，即，在中值PFS中增加50%。

[0470] 虽然上文已描述和/或例示了本发明的某些实施方案，但可以设想其大量变化和修改是可能的。因此，本发明不局限于本文所述和/或例示的具体实施方案。