迎阳报春组培快繁方法

摘要

本发明公开了一种迎阳报春的组培快繁方法，包括外植体的选择与灭菌、不定芽诱导、继代增殖培养、生根壮苗培养、试管苗移栽。本发明提高了迎阳报春的繁殖系数、缩短生长周期，能在较短时间内获得优质苗，为迎阳报春的种质保存、应用推广提供技术保障。

权利要求

1.一种迎阳报春组培快繁方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：

选迎阳报春的叶片中下部为外植体，经水冲洗干净后，转入超净工作台，用75%的酒精表面灭菌30s，无菌水冲洗2-3次，再用0.1%HgCl2溶液消毒5-8min，取出后用无菌水反复清洗3-4次，无菌滤纸吸干水分，用剪刀剪除四周受伤组织，然后将叶片切成0.5cmx0.5cm小块，叶面向下接种在不定芽诱导培养基MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA中，蔗糖35g/L，琼脂5 g/L，且 pH 5.8-6.0，培养温度为20±2℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2500-3000Lux；

4周以后移至增殖培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，蔗糖35g/L，琼脂5 g/L，且 pH

5.8-6.0，培养温度为20±2℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2500-3000Lux，继代2-3次；

把高1.5-2.0cm的芽转接到生根壮苗培养基MS中进行生根培养，试管苗生根后25d后，苗高4.0-5.0厘米时，置于自然条件下2~3天，再打开封口膜炼苗一周后，取出瓶苗，洗净培养基，移入到经过灭菌的混合基质中，混合基质为泥碳：蛭石按质量比3：1的混合而成，一次性喷水灌透，再用塑料薄膜将容器蒙上，每天早晚掀开薄膜透气 10 -15min后再盖上薄膜，

10天后揭去覆盖塑料膜进行正常培养；所述叶片中下部是指沿叶尖往叶柄方向去除2/3的叶片，剩下的1/3的叶片即为叶片中下部。

说明书

迎阳报春组培快繁方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种迎阳报春（Primula oreodoxa Franch)的组培快繁方法。

背景技术

[0002] 迎阳报春(Primula oreodoxa Franch)是报春花科(Primulaceae)报春花属的多年生常绿草本植物。1886 年被发现，模式产地在我国四川峨眉山，分布于四川西北部(马边、峨眉、天全、宝兴、灌县) 等地，为四川特有种。自然条件下4～5月份开花，花葶高5-14厘米，直立，被长粗毛；伞形花序有3-10朵小花，花朵从上而下陆续开放，紫红色，十分艳丽，具有较高的观赏价值，可作盆栽、地被、花坛用花。由于在自然界条件下，该花所结种子粒细小而瘪，种子繁殖率低，生长周期长，且出苗不整齐，限制了该花的大面积种植，不能满足生产需求。组织培养是快速繁殖优良植物品种的一条重要途径，同属的鄂报春、灰岩皱叶报春、高穗花报春、小报春、滇北球花报春已有过组培方面的报道，而迎阳报春的组织培养在国内外均没有相关研究与报道，因此有必要开展迎阳报春的组织培养研究，并建立一套专门的快繁技术体系。

发明内容

[0003] 鉴于上述不足之处，本发明的目的在于提供一种迎阳报春的组培快繁方法，提高迎阳报春的繁殖系数、缩短生长周期，能在较短时间内获得优质苗，为迎阳报春的种质保存、应用推广提供技术保障。

[0004] 为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

[0005] （1）对外植体的选择：

[0006] 在现有对报春花的组培技术中，大部分采用腋芽、茎尖、花药和种子作为外植体，对原植株有较大的破坏作用，不仅会影响原植株的生长和发育，而且取材数量有限。

[0007] 本发明所采用的外植体为叶片，采用叶片作为外植体对原植株不会造成破坏，且数量多。经过申请人的大量反复研究实验，得出采用叶片中下部（结合图1和图2所示）作为外植体对迎阳报春组培快繁效果最好，最早诱导出不定芽，且每个外植体平均能诱导出15-20个不定芽，显著高于叶片其他部位，其不定芽诱导率100%，平均根条数，苗高，移栽成活率均高于其他外植体。本发明采用的是2012年4月初采自四川峨眉山大乘寺附近（海拔
2300米）迎阳报春植株的叶片，组培时将叶片中下部切割成长0.5厘米，宽0.5厘米的切片，叶背向下接种在诱导培养基上。

[0008] （2）再生途径的考量：

[0009] 通过对现有技术中再生途径的研究发现：现有技术均是通过愈伤组织间接发生途径而获得再生植株，该再生植株易发生性状变异，成苗时间均较长，同时因为需要筛选愈伤组织诱导、增殖和分化的最佳培养基配方，同时也增加了试验成本。在此基础上，本发明在叶片上（特别是叶柄与叶片结合部位）直接诱导出不定芽，不需通过诱导愈伤组织、愈伤组织增殖、分化途径来获得大量再生植株。通过不定芽发生途径，不仅能稳定遗传性状，不会发生性状变异，还能缩短成苗周期，在2月内就能形成完整植株，只需4-5个月就可获得大批量的再生植株。

[0010] （3）植物激素配比选择：

[0011] 通过对现有技术的对比，本申请人通过大量的创造性劳动，得出了如下结论：

[0012] 本发明采用浓度较高的激素6-BA、NAA，在不定芽诱导阶段采用的6-BA为3.0 mg/L，NAA为0.5mg/L，而现有技术6-BA的浓度均在2.0 mg/L以下，NAA浓度在0.2 mg/L以下，在本试验中也使用过6-BA 1.0、2.0mg/L与NAA 0.1、0.2mg/L的配比，但是不定芽诱导效果没有在6-BA3.0 mg/L+NAA0.5mg/L的配比下好；生根培养基使用不添加任何激素的基本培养MS，生根率100%，且组培苗的生长势好。

[0013] （4）培养条件的筛选：

[0014] 本发明的培养温度均为(20±2) ℃，光照时间12 h/d, 光照强度为2500-3000 Lux。当温度高于25℃，诱导不定芽的时间会延长，且芽苗、组培苗生长缓慢，叶片也会变黄，光照时间少于12小时,以及光照强度低于2500 Lux，组培苗表现为失绿、细弱现象，很难恢复成健壮苗。

[0015] 本发明的具体技术方案为：

[0016] 一种迎阳报春的组培快繁方法包括以下步骤：

[0017] 选迎阳报春的叶片中下部为外植体，经水冲洗干净后，转入超净工作台，用75%的酒精表面灭菌30s，无菌水冲洗2-3次，再用0.1%HgCl2溶液消毒5-8min，取出后用无菌水反复清洗3-4次，无菌滤纸吸干水分，用剪刀剪除四周受伤组织，然后将叶片切成0.5cmx0.5cm小块，叶背向下接种在不定芽诱导培养基MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA中；4周以后移至增殖培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，继代2-3次；把高1.5-2.0cm的芽转接到生根壮苗培养基MS中进行生根培养，试管苗生根后25d后，苗高4.0-5.0厘米时，置于自然条件下2~3天，再打开封口膜炼苗一周后，取出瓶苗，洗净培养基，移入到经过灭菌的混合基质中，一次性喷水灌透，再用塑料薄膜将容器蒙上，每天早晚掀开薄膜透气 10 -15min后再盖上薄膜，10天后揭去覆盖塑料膜进行正常培养。

[0018] 本发明中叶片中下部如图1所示，沿叶尖往叶柄方向去除2/3的叶片，剩下的1/3的叶片即为叶片中下部。

[0019] 上述诱导培养基和增殖培养基内均加有蔗糖35g/L，琼脂5 g/L，且 pH 5.8-6.0。

[0020] 在诱导培养和增殖培养时：培养温度为(20±2) ℃，光照时间为12 h/d， 光照强度为2500-3000Lux 。

[0021] 上述混合基质为泥碳：蛭石按质量比3：1的混合而成。

[0022] 本发明的有益效果在于：

[0023] 1.建立了一种迎阳报春(Primula oreodoxa Franch)的组培快繁方法，相比传统的报春花属植物育苗繁殖方法，如播种繁殖和分株繁殖，极大地提高了迎阳报春(Primula oreodoxa Franch)的繁殖系数，为该物种的繁殖提供了技术保障。

[0024] 2.以往的有关报春花组培技术采用的外植体为腋芽、茎尖、种子，不仅取材数量有限，而且对原植株破坏较大，也受季节限制。而本发明采用叶片为外植体进行组培快繁，对原植株不会造成破坏，不受季节限制，极大地扩大了外植体的数量。

[0025] 3.利用组培快繁方法繁育迎阳报春(Primula oreodoxa Franch)，解除了季节与气候的限制, 任何时候都可以进行组培繁殖，从而缩短了育苗周期,增加了繁殖量。

[0026] 4.利用组培快繁方法繁育迎阳报春所得到的幼苗生长健壮,一致性强，叶色浓绿,很少病虫害,易于管理。

[0027] 5.利用组培再生体系繁育迎阳报春,为以后通过遗传转化技术培育新品种奠定了基础。

附图说明

[0028] 图1为迎阳报春叶结构示意图。

[0029] 图2为迎阳报春叶的叶片中下部结构示意图。

[0030] 图中：1.叶片中下部；2.叶尖；3叶柄。

具体实施方式

[0031] 一种迎阳报春组培快繁方法包括以下步骤：

[0032] 选迎阳报春的叶片中下部1为外植体（结合图1和图2所示，本实施例中叶片中下部为沿叶尖2往叶柄3方向去除2/3的叶片，剩下的1/3的叶片即为叶片中下部1），经水冲洗干净后，转入超净工作台，用75%的酒精表面灭菌30s，无菌水冲洗2-3次，再用0.1%HgCl2溶液消毒5-8min，取出后用无菌水反复清洗3-4次，无菌滤纸吸干水分，用剪刀剪除四周受伤组织，然后将叶片切成0.5cmx0.5cm小块，叶面向下接种在不定芽诱导培养基MS+3.0mg/L6-BA+0.5mg/LNAA中，蔗糖35g/L，琼脂5 g/L，且 pH 5.8-6.0，培养温度为(20±2) ℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2500-3000Lux；4周以后移至增殖培养基MS+2.0mg/L6-BA+0.2mg/LNAA，蔗糖35g/L，琼脂5 g/L，且 pH 5.8-6.0，培养温度为(20±2) ℃，光照时间为12 h/d，光照强度为2500-3000Lux，继代2-3次；把高1.5-2.0cm的芽转接到生根壮苗培养基MS中进行生根培养，试管苗生根后25d后，苗高4.0-5.0厘米时，置于自然条件下2~3天，再打开封口膜炼苗一周后，取出瓶苗，洗净培养基，移入到经过灭菌的混合基质（泥碳：蛭石按质量比3：1混合）中，一次性喷水灌透，再用塑料薄膜将容器蒙上，每天早晚掀开薄膜透气 10 -15min后再盖上薄膜，10天后揭去覆盖塑料膜进行正常培养。

[0033] 采用本发明技术，在MS基本培养基上，迎阳报春的生根率100%，平均根条数为12.7条，苗高6.5 cm，叶色深绿，苗生长健壮，移栽成活率达90%。