用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法

摘要

本发明公开了一种用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，它包括以下步骤：S1.菌种复苏培养：将冻干的奈瑟氏菌种用生理盐水溶解后，接种于奈瑟氏菌培养基中，置于二氧化碳培养箱中培养；S2.固体传代培养：将复苏培养后的奈瑟氏菌株转接至半综合固体培养基中恒温培养；奈瑟氏菌培养基由酸水解酪蛋白、磷酸二氢钾、七水合硫酸镁、L-胱氨酸、氯化血红素、无水乙酸钠、酵母透析液、葡萄糖、琼脂粉、可溶性淀粉、蒸馏水组成；本发明方法提供的培养基能保证奈瑟氏菌生长旺盛，能进行正常代谢，且具有取材来源广，价格低的特性；利用该培养基培养奈瑟氏菌的方法操作简单、生产成本低、更适合大规模生产。

权利要求

1.一种用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，其特征在于，它包括以下步骤：

S1. 菌种复苏培养：将冻干的奈瑟氏菌种用生理盐水溶解后，接种于奈瑟氏菌培养基中，置于浓度为5～10%二氧化碳培养箱中培养16～20h，培养温度为35～37℃；其中，所述奈瑟氏菌培养基由以下组分组成：酸水解酪蛋白 2～5g；磷酸二氢钾 0.05～0.12g；七水合硫酸镁 0.05～0.08g；L-胱氨酸 1～4mg；氯化血红素 2～8mg；无水乙酸钠 0.4～

0.7g；酵母透析液 4～7ml；葡萄糖 0.1～0.4g；琼脂粉 1.5～2.0g；可溶性淀粉0.2～

0.6g；蒸馏水加至1000ml，调pH为7.5～7.7；

S2. 固体传代培养：将复苏培养后的奈瑟氏菌株转接至半综合固体培养基中，恒温培养16～18h，培养温度为35～37℃，其中，所述半综合固体培养基由以下组分组成：酸水解酪蛋白 2～5g；磷酸二氢钾 0.05～0.12g；七水合硫酸镁 0.05～0.08g；L-胱氨酸 1～

4mg；无水乙酸钠 0.4～0.7g；酵母透析液 4～7ml；葡萄糖 0.1～0.4g；琼脂粉 1.5～

2.0g；可溶性淀粉0.2～0.6g；蒸馏水加至1000ml，调pH为7.5～7.7。

说明书

用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种培养基及培养方法，尤其是用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] 奈瑟氏菌（Neisseriaceae），细菌的一科，革兰氏染色阴性，球形或球杆型，营呼吸代谢。球菌多呈双球菌状排列，相邻一侧扁平或略凹呈肾状；杆菌则端粗，长宽相比为（或不到）2:1，无鞭毛，好氧。脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis，Nm)是脑膜炎和爆发性败血症的首要致病菌，流行性脑脊髓膜炎(以下简称为流脑)的发病常呈散发性，各病例之间并无明显关联，通常以小规模方式爆发，在一些地区可转变为灾难性的、难以预料的地方性流行病。全球每年流脑发病人数约为50万，死亡5万，由于发病急，病情发展快，死亡率高，对易感人群—儿童暴发型病死率可达40%-60%，因而一直受到国内外的普遍重视。

[0003] 脑膜炎球菌性脑膜炎是人类的主要急性呼吸道传染病之一，流行性脑脊髓膜炎是由脑膜炎球菌引起的细菌性脑膜炎。根据脑膜炎球菌荚膜抗原的化学结构分13个血清群，A群、B群和C群约占流行菌群的90%，W135群和Y群也有上升趋势。现已有A、C、Y、W135群各型单价或多价多糖疫苗和结合疫苗在世界各流行地区广泛应用。为研究和制备A、C、Y、W135四价多糖疫苗，需要各型菌群的规模化培养。菌种复苏得到生长状态良好且菌量适宜的种子液成为规模化培养的基础。

[0004] 虽然对脑膜炎奈瑟氏菌研究甚早，并取得一定成果，但是其培养方面的相关报道很少。中国专利CN101089190A发明了一种营养血液培养基，主要提供一般标本和已使用过抗生素及磺胺药的病人标本分离培养基，不适合于大规模培养，具有局限性。目前国内外较多应用巧克力双抗琼脂作为分离培养基，该培养基的分离检验效果很好，但因制作时需使用新鲜脱纤维羊血，然而，《预防用疫苗临床前研究技术指导原则》中提到生产用培养基尽可能避免使用动物来源和可能引起人体不良反应的原材料，禁止使用来自疯牛病疫区的牛源性原材料。在采集羊血时，存在感染羊布鲁氏杆菌病和绵羊痒病等疾病的危险，也可能造成羊血的污染；另外目前的脑膜炎培养基多为分离培养基，其主要目的是分离和检测，故为了分离检出，现有培养基要使用抗生素。

[0005] 由于脑膜炎奈瑟氏菌对环境的要求非常苛刻，其生长不仅与菌种本身特性有关，如属专性需氧菌，培养过程中常因菌体产生自溶酶而导致自身裂解死亡，必须赋予合适的培养基才能使其良好生长代谢，因此，完全有必要研制并开发适合工业规模化生产，且材料来源广，价格低，能避免菌体产生自溶酶的适应脑膜炎奈瑟氏菌生长代谢的培养基。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种奈瑟氏菌培养基及培养方法，该方法提供的培养基能保证奈瑟氏菌生长旺盛，能进行正常代谢，且具有取材来源广，价格低的特性；利用该培养基培养奈瑟氏菌的方法操作简单、生产成本低、更适合大规模生产。

[0007] 本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，它包括以下步骤：

[0008] S1. 菌种复苏培养：将冻干的奈瑟氏菌种用生理盐水溶解后，接种于奈瑟氏菌培养基中，置于浓度为5～10%二氧化碳培养箱中培养16～20h，培养温度为35～37℃；

[0009] S2. 固体传代培养：将复苏培养后的奈瑟氏菌株转接至半综合固体培养基中，恒温培养16～18h，培养温度为35～37℃。

[0010] 所述步骤S1中奈瑟氏菌培养基由以下组分组成：

[0011] 酸水解酪蛋白 2～5g； 磷酸二氢钾 0.05～0.12g；

[0012] 七水合硫酸镁 0.05～0.08g； L-胱氨酸 1～4mg；

[0013] 氯化血红素 2～8mg； 无水乙酸钠 0.4～0.7g；

[0014] 酵母透析液 4～7ml； 葡萄糖 0.1～0.4g；

[0015] 琼脂粉 1.5～2.0g； 可溶性淀粉0.2～0.6g；

[0016] 蒸馏水加至1000ml，调pH为7.5～7.7。

[0017] 所述步骤S2中半综合固体培养基由以下组分组成：

[0018] 酸水解酪蛋白 2～5g； 磷酸二氢钾 0.05～0.12g；

[0019] 七水合硫酸镁 0.05～0.08g； L-胱氨酸 1～4mg；

[0020] 无水乙酸钠 0.4～0.7g； 酵母透析液 4～7ml；

[0021] 葡萄糖 0.1～0.4g； 琼脂粉 1.5～2.0g；

[0022] 可溶性淀粉0.2～0.6g；

[0023] 蒸馏水加至1000ml，调pH为7.5～7.7。

[0024] 本发明具有以下优点：本发明的奈瑟氏菌培养基用氯化血红素代替了传统培养基中的羊血，避免动物来源的羊血带来羊布鲁氏杆菌病和绵羊痒病等疾病的危险；降低了因采血过程和培养基配制过程带来的培养基感染几率，该培养基能保证奈瑟氏菌生长旺盛，能进行正常代谢，具有取材来源广，价格低的特性；利用该培养基培养奈瑟氏菌的方法操作简单、生产成本低、更适合大规模生产。

具体实施方式

[0025] 下面结合实施例对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述。

[0026] 实施例1：一种用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，它包括以下步骤：

[0027] S1. 菌种复苏培养：将冻干的A群脑膜炎奈瑟氏菌种用生理盐水溶解后，接种于奈瑟氏菌培养基中，置于浓度为5%二氧化碳培养基中培养16h，培养温度为35℃；经菌种复苏培养后，A群脑膜炎奈瑟氏菌生长良好，灰白色的菌苔，光滑湿润，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液，镜检菌体形态良好；

[0028] S2. 固体传代培养：将复苏培养后的A群脑膜炎奈瑟氏菌株转接至半综合固体培养基中，恒温培养16h，培养温度为35℃；经固体传代培养后，镜检菌体形态良好，收集到的种子液OD600为5.8能满足种子罐传代要求。

[0029] 所述步骤S1中奈瑟氏菌培养基由以下组分组成：

[0030] 酸水解酪蛋白 2g； 磷酸二氢钾 0.05g；

[0031] 七水合硫酸镁 0.05g； L-胱氨酸 1mg；

[0032] 氯化血红素 2mg； 无水乙酸钠 0.4g；

[0033] 酵母透析液 4ml； 葡萄糖 0.1g；

[0034] 琼脂粉 1.5g； 可溶性淀粉0.2g；

[0035] 蒸馏水加至1000ml，调pH为7.5。

[0036] 所述步骤S2中半综合固体培养基由以下组分组成：

[0037] 酸水解酪蛋白 2g； 磷酸二氢钾 0.05g；

[0038] 七水合硫酸镁 0.05g； L-胱氨酸 1mg；

[0039] 无水乙酸钠 0.4g； 酵母透析液 4ml；

[0040] 葡萄糖 0.1g； 琼脂粉 1.5g；

[0041] 可溶性淀粉0.2g；

[0042] 蒸馏水加至1000ml，调pH为7.5。

[0043] 实施例2：一种用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，它包括以下步骤：

[0044] S1. 菌种复苏培养：将冻干的Y群脑膜炎奈瑟氏菌中用生理盐水溶解后，接种于奈瑟氏菌培养基中，置于浓度为10%二氧化碳培养箱中培养20h，培养温度为37℃；经菌种复苏培养后，Y群脑膜炎奈瑟氏菌生长良好，灰白色的菌苔，光滑湿润，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液，镜检菌体形态良好；

[0045] S2. 固体传代培养：将复苏培养后的Y群脑膜炎奈瑟氏菌株转接至半综合固体培养基中，恒温培养18h，培养温度为37℃；经固体传代培养后，镜检菌体形态良好，收集到的种子液OD600为6.6能满足种子罐传代要求。

[0046] 所述步骤S1中奈瑟氏菌培养基由以下组分组成：

[0047] 酸水解酪蛋白 5g； 磷酸二氢钾 0.12g；

[0048] 七水合硫酸镁 0.08g； L-胱氨酸 4mg；

[0049] 氯化血红素 8mg； 无水乙酸钠 0.7g；

[0050] 酵母透析液 7ml； 葡萄糖 0.4g；

[0051] 琼脂粉 2.0g； 可溶性淀粉0.6g；

[0052] 蒸馏水加至1000ml，调pH为7.7。

[0053] 所述步骤S2中半综合固体培养基由以下组分组成：

[0054] 酸水解酪蛋白 5g； 磷酸二氢钾 0.12g；

[0055] 七水合硫酸镁 0.08g； L-胱氨酸 4mg；

[0056] 无水乙酸钠 0.7g； 酵母透析液 7ml；

[0057] 葡萄糖 0.4g； 琼脂粉2.0g；

[0058] 可溶性淀粉0.6g；

[0059] 蒸馏水加至1000ml，调pH为7.7。

[0060] 实施例3： 一种用氯化血红素替代羊血培养奈瑟氏菌的方法，它包括以下步骤：

[0061] S1. 菌种复苏培养：将冻干的C群脑膜炎奈瑟氏菌中用生理盐水溶解后，接种于奈瑟氏菌培养基中，置于浓度为8%二氧化碳培养箱中培养19h，培养温度为36℃；经菌种复苏培养后，C群脑膜炎奈瑟氏菌生长良好，灰白色的菌苔，光滑湿润，菌苔易取下，在生理氯化钠溶液中呈现均匀混悬液，镜检菌体形态良好；