一种疏螺旋体BSK贮存液培养基及单菌落分离纯化方法和应用

摘要

本发明公开了一种疏螺旋体BSK贮存液培养基及单菌落分离纯化方法和应用，培养基由CMRL-1066、牛血清白蛋白V、新胨蛋白胨、羟乙基哌嗪乙硫磺酸、柠檬酸钠、葡萄糖、酵母粉、碳酸氢钠、丙酮酸钠、乙酰葡萄糖氨、兔血清、氢氧化钠等组成。配置BSK贮存液培养基，制备琼脂糖凝胶并高压灭菌，逐渐融化，按照比例与BSK贮存液培养基混合均匀，倾倒制备下层固体培养基。用梯度稀释的伯氏疏螺旋体菌悬液与贮存液培养基混合，倾注上层培养基。出现肉眼可见的单菌落，用牙签挑取菌落用暗视野显微镜检查，观察到典型的伯氏疏螺旋体菌株，该方法操作简单快速，结果明晰。并且遗传背景均一无异质性，适用于后续的科学研究及作为标准品菌株。

权利要求

1.一种BSK贮存液培养基分离纯化单菌落疏螺旋体的非诊断性方法，其步骤如下：(1)琼脂糖凝胶制备：用低熔点琼脂糖配置5％W/V琼脂糖凝胶，121℃,103.4千帕斯卡灭菌20-40分钟，置于20-30℃备用；

(2)底层固体培养基的制备：调节水浴锅温度至55℃，将5％W/V琼脂糖凝胶置于其中融化，按照体积比为1：1的比例与BSK贮存液培养基混合均匀，倾倒至培养皿；20-30℃静置12-24小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后于4℃冰箱保存待用；

(3)将待分离的疏螺旋体菌株用BSK-H常规液体培养基培养至对数生长期，通过暗视

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野显微镜计数，确定其浓度达到10-10细胞/毫升，用BSK-H常规液体培养基梯度稀释，分

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别获得浓度为10、10、10、10、10细胞/毫升的菌悬液；

(4)调节水浴锅温度至55℃，将5％W/V琼脂糖凝胶至于其中融化,然后在灭菌的离心管中混合7.5毫升BSK贮存液培养基与7.5毫升5％W/V琼脂糖凝胶，混匀后加入1毫升不同浓度的待分离的疏螺旋体菌悬液，上下颠倒10-20次混合均匀后倾倒至已经制备好的底层固体培养基中；20-30℃静置12小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后放入37℃，5％V/V二氧化碳培养箱中培养；

(5)观察培养基及细菌生长情况，确定无细菌或者霉菌的污染，出现肉眼可见的单菌落后用牙签挑取菌落用暗视野显微镜检查；

所述的BSK贮存液培养基，其成分如下：

2.根据权利要求1所述方法，所述的BSK贮存液培养基成分如下：

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

4.权利要求1所述的疏螺旋体单菌落分离纯化非诊断性方法在制备疏螺旋体纯培养物中的应用。

说明书

一种疏螺旋体BSK贮存液培养基及单菌落分离纯化方法和

应用

技术领域

[0001] 本发明涉及医学微生物学领域，具体涉及一种疏螺旋体BSK贮存液培养基，还涉及利用该贮存液培养基分离纯化疏螺旋体单菌落的方法，还涉及该分离纯化的方法在制备微生物学科研、临床诊断中的单菌落及纯培养物中的用途。

背景技术

[0002] 单菌落分离和微生物纯培养技术是微生物学科研、医疗、工业生产中最常见最重要的技术之一。含有一种以上的微生物培养物称为混和培养物，如果在一个菌落中所有细胞均来自于一个亲代细胞，那么这个菌落称为纯培养。在进行菌种鉴定、工业生产及科学研究时，所用的微生物一般均要求为纯的培养物。因为混合培养物中可能有多种来源不同的菌种，可能造成微生物培养物的异质性，表现为生物学性状的不稳定，给工业生产带来损失，并可能导致临床诊断的错误。分离含有一种单一细菌的微生物学技术方法叫做单菌落分离，由单菌落而获得纯培养的过程称为分离纯化，常见的微生物单菌落分离及纯培养的方法有以下几种。

[0003] 1、涂布平板法

[0004] 首先把微生物悬液进行梯度的稀释，取一定量的稀释液放在无菌的已经凝固的营养琼脂平板上，然后用无菌的玻璃刮刀把稀释液均匀地涂布在培养基表面上，培养箱倒置培养可以得到单个菌落。取单个菌落制成悬液，重复上述步骤数次，便可得到纯培养物。

[0005] 2、平板划线法

[0006] 最简单、常见的分离微生物单菌落的方法是平板划线法。用无菌的接种环取培养物少许在平板上进行划线。当接种环在培养基表面上往后移动时，接种环上的菌液逐渐稀释，其目的都是把细菌分散越开越好，最后在所划的线上分散着单个细胞，经培养后各自形成单个菌落，将单个菌落移种增殖后可得到纯种细菌。该方法也是微生物单菌落分离最常见的方法。

[0007] 3、富集培养法

[0008] 通过创造特定的生长条件，如温度、特殊营养成分、碳源、氮源、pH等，在这些条件下，所需要的微生物能有效地与其他微生物进行竞争，在生长能力方面远远超过其他微生物。在相同的培养基和培养条件下，经过多次重复移种，淘汰其它的微生物，最后富集的菌株很容易在固体培养基上长出单菌落。

[0009] 疏螺旋体（Borrelia）为革兰氏阴性细菌，该属微生物具有5-10个疏而不规则的螺旋，运动活泼，易着色，微需氧，适温为28-37度，人工培养较困难。该属细菌包括多个人类的致病菌，如引起莱姆病的伯氏疏螺旋体（Borrelia burgdorferi），由蜱传播给人类。伯氏疏螺旋体的感染对人体多个系统有影响，经过不同的临床阶段，受影响的器官会发生长期的机能障碍；引起人类回归热的回归热疏螺旋体，根据回归热传播媒介昆虫的不同，可分为两类。一为虱传回归热，或称流行性回归热，其病原体为回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)。另一为蜱传回归热，又称地方性回归热，其病原体多至15种，例如杜通疏螺旋体(Borrelia duttonii)、赫姆斯疏螺旋体(Borrelia hermsii)等。亚洲和中国流行的回归热主要是波斯疏螺旋体（Borrelia persica）和拉氏疏螺旋体（Borrelia latyschewii）。

[0010] 疏螺旋体有着特殊的基因组结构特征，它的基因组是由一个线状的约910kb的染色体和大约20个5-56kb大小不等的线状或者环状的质粒所组成。一些质粒在体外传代培养过程是不稳定的，然而却是维持在宿主动物体内具有感染性所必需的。遗传上的异质性还可以来源于同一个克隆的衍生物，即质粒丢失后的后代，这些质粒编码了重要的表型特征，例如抗原漂移以及NAD生物合成辅因子等。因此，疏螺旋体的单菌落分离和微生物纯培养技术在该领域的菌种鉴定、分型、临床诊断及科研中显得更为重要。因为质粒丢失、或者发生同源重组后的克隆很可能对最后的鉴定、诊断、治疗效果造成影响。

[0011] 然而疏螺旋体的单菌落分离及纯培养却不能按照常规的方法进行，首先是因为该菌株生长速度缓慢。疏螺旋体倍增的速度在体外培养最佳的条件下最快也需要5小时，因此，从一个细胞生成一个单菌落直至获得纯培养物，往往需要两周以上的时间，如果按常规的涂布平板法和平板划线法进行单菌落分离，如何在培养周期内保持平板的湿度是一个挑战。伯氏疏螺旋体在自然生活周期中是专性寄生的，代谢能力有限，只能在复杂的、关键营养成分不确定的BSK（Stoenner-Kelly Medium）培养基中生长。那些不确定的关键的BSK培养基成分，如兔血清、牛血清蛋白的粗提物等限制了对伯氏疏螺旋体营养缺陷型的鉴定，这就使得富集培养法分离单菌落获得纯培养几乎不可能。更为重要的是，疏螺旋体是一种不好氧的细菌，常规的涂布平板法和平板划线法进行单菌落分离时，平板表面完全暴露，不利于疏螺旋体的生长。这些都使得常规的微生物学单菌落分离方法很难应用的疏螺旋体的研究、诊断中。

[0012] 目前疏螺旋体的单菌落分离采用的是有限稀释法，即将想要分离的螺旋体混合培养物用培养基稀释，然后分别放入96孔板中，培养一周后，如果有小于12个孔有疏螺旋体细胞，则可认为每个孔中的培养物由一个单细胞复制产生，由此获得纯培养并实现疏螺旋体的分离和纯化。

发明内容

[0013] 本发明的目的是在于提供了一种疏螺旋体BSK贮存液培养基，该培养基适用于疏螺旋体细菌的培养和分离、纯化和鉴定。并且制备方法简单快速，能够分离到遗传背景单一的单克隆菌落。

[0014] 本发明的另外一个目的是在于提供了一种疏螺旋体单菌落分离纯化方法，该方法操作简单快速，能够直接在固体平板上看到单菌落，直观并且操作简单，适合推广使用。

[0015] 本发明的最后一个目的是在于提供了一种疏螺旋体分离纯化方法在制备纯培养物中的应用，利用该方法可以方便、快速的获得纯培养物，并且遗传背景均一无异质性，适用于后续的科学研究及作为标准品菌株。

[0016] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：

[0017] 一种BSK贮存液培养基，它由以下重量份的原料制成：

[0018]

[0019] 一种BSK贮存液培养基，它由以下重量份的原料制成（优选范围）：

[0020]

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[0022] 一种疏螺旋体BSK贮存液培养基，它由以下重量份的原料制成（最佳值）：

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[0024] 一种BSK贮存液培养基，它由以下重量份的原料制成：

[0025]

[0026]

[0027] 将上述组分按顺序逐个加入蒸馏水中，室温（20-30℃）充分搅拌均匀至完全溶解，待上一个组分完全溶解后再加入下一个组分，最后调整pH并定容。

[0028] 一种疏螺旋体单菌落分离纯化方法，其步骤如下：

[0029] （1）琼脂糖凝胶制备：用低熔点琼脂糖配置5%（质量体积比）琼脂糖凝胶，121℃高压（103.4千帕斯卡）灭菌20-40分钟，置于室温（20-30℃）备用。

[0030] （2）底层固体培养基的制备：调节水浴锅温度至55度，将5%琼脂糖凝胶至于其中逐渐融化。然后按照体积比为1：1的比例与BSK贮存液培养基混合均匀。倾倒至培养皿，直径10厘米的培养皿，每个需要10毫升底层固体培养基。室温静置12-24小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后于4度冰箱保存待用。

[0031] （3）将待分离的疏螺旋体菌株用BSK-H常规液体培养基（sigma公司产品）培养至7 8
对数生长期，通过暗视野显微镜计数，确定其浓度达到10-10细胞/毫升。用BSK-H常规
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液体培养基梯度稀释，分别获得浓度为10、10、10、10、10细胞/毫升的菌悬液。

[0032] （4）调节水浴锅温度至55℃，将5%琼脂糖凝胶至于其中逐渐融化。然后在灭菌的离心管中混合7.5毫升BSK贮存液培养基与7.5毫升5%琼脂糖凝胶，充分混匀后加入1毫升不同浓度的待分离的疏螺旋体菌悬液，上下颠倒10-20次混合均匀后倾倒至已经制备好的底层固体培养基中。室温静置12小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后放入37℃二氧化碳培养箱（5%）中培养。

[0033] （5）观察培养基及细菌生长情况，确定无细菌或者霉菌的污染，出现肉眼可见的单菌落后用牙签挑取菌落用暗视野显微镜检查。

[0034] 所述的BSK贮存液培养基，其成分如下：

[0035]

[0036]

[0037] 一种疏螺旋体单菌落分离纯化方法在制备疏螺旋体纯培养物中的应用，其应用过程是：

[0038] （1）疏螺旋体纯培养物的制备：

[0039] 用牙签挑取疏螺旋体单菌落，接种至12毫升BSK-H常规液体培养基（sigma公司产品），37℃二氧化碳培养箱（5%）中培养，观察疏螺旋体生长情况，菌株生长至对数生长期，7
菌落浓度达到10细胞/毫升以上，即可获得疏螺旋体的单菌落纯培养物。

[0040] （2）疏螺旋体内源性质粒的鉴定：

[0041] 疏螺旋体含有大小不等的线状或者环状的质粒所组成，根据每个质粒的序列设计特异性的引物，采用PCR的方法鉴定该菌落中是否含有某个质粒。

[0042] （3）内源性质粒图谱：

[0043] 将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果有特异性条带，说明该菌落含有目的质粒。筛选出的单菌落纯培养物，可用于后续研究及制备菌株标准品。

[0044] 本发明所涉及的微生物菌株包括但不仅限于伯氏疏螺旋体，所有可以用BSK-H常规液体培养基培养的疏螺旋体属细菌均可应用于本发明，包括回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)，杜通疏螺旋体(Borrelia duttonii)、赫姆斯疏螺旋体(Borrelia hermsii)、波斯疏螺旋体（Borrelia persica）和拉氏疏螺旋体（Borrelia latyschewii）。

[0045] 本发明与常规技术相比，具有以下优点和效果：

[0046] （1）疏螺旋体的单菌落分离很难按照常规的涂布平板法和平板划线法进行，因为伯氏疏螺旋体在自然生活周期中是专性寄生的，常规的涂布平板法和平板划线法进行单菌落分离时，平板表面完全暴露，不利于疏螺旋体的生长；而双层平板法创造的微厌氧的环境，更利于疏螺旋体的增殖。

[0047] （2）和通过无限的稀释方法获得单菌落相比，本发明的分离纯化方法简单快速，结果明晰，能够肉眼看到单菌落。

[0048] （3）本发明的方法利用5%的低熔点琼脂糖配置固体BSK培养基，低熔点琼脂糖具有较低的融化温度，这样在倾注培养皿时可以不因为温度过高影响菌悬液中的疏螺旋体细胞的生存。此外，低熔点琼脂糖具有较高的纯度，不会因为杂质影响疏螺旋体细胞的生长，而且配置的培养基透明，便于观察。并且低熔点琼脂糖交联度适中，适合疏螺旋体的生长，可以形成肉眼可见的单菌落。本发明采用双层的平板进行单菌落分离和纯培养，为的是为疏螺旋体的生长创造微厌氧的环境，便于细胞生长、定植和形成单菌落。附图说明：

[0049] 图1为一种双层平板倾倒法获得的伯氏疏螺旋体B31菌株的单菌落的示意图。

[0050] 左图为固体平板，可见白色不通透的单菌落产生，菌落直径约为0.2-1.5毫米，右图为局部左图的局部放大，有三个清晰的单菌落。

具体实施方式

[0051] 所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟悉，可以参考Sambrook等“分子克隆”（实验室手册，冷泉港，1989）以及“Zückert,W.R.2007.Laboratory Maintenance of Borrelia burgdorferi. Current Protocols in Microbiology.4:12C.1.1–12C.1.10.”本发明实施例中的试剂为分析纯以上，购自美国Sigma公司。

[0052] 下面结合具体实施方式对本发明作进一步说明，但本发明不受实施例的限制。

[0053] 实施例1：

[0054] 一种疏螺旋体BSK贮存液培养基，它由以下重量份的原料制成：

[0055]

[0056]

[0057] 一种疏螺旋体BSK贮存液培养基的制备方法，其步骤是：

[0058] 将上述组分按顺序逐个加入蒸馏水中，室温（20-30℃）充分搅拌均匀至完全溶解，待上一个组分完全溶解后再加入下一个组分。最后调整pH并定容。用0.22微米孔径的滤器过滤除菌，至于-20℃冰箱保存。

[0059] 实施例2：

[0060] 伯氏疏螺旋体B31固体平皿倾注及单菌落分离纯化：

[0061] （1）琼脂糖凝胶制备：用低熔点琼脂糖配置5%（重量体积比，以下相同）琼脂糖凝胶，121℃，103.4千帕斯卡灭菌20分钟，置于25℃备用。

[0062] （2）底层固体培养基的制备：调节水浴锅温度至55℃，将5%琼脂糖凝胶至于其中逐渐融化。然后按照体积比为1：1的比例与实施例1中制得的BSK贮存液培养基混合均匀，加入卡那霉素（sigma公司）至终浓度为200微克每毫升。倾倒至培养皿中，对于直径10厘米的培养皿，每个需要10毫升底层固体培养基。室温静置12小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后于4℃冰箱保存待用。

[0063] （3）将伯氏疏螺旋体B31菌株用BSK-H常规液体培养基（sigma公司产品）培养至7 8
对数生长期，通过暗视野显微镜计数，确定其浓度达到10-10细胞/毫升。然后用BSK-H
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常规液体培养基梯度稀释，分别获得浓度为10、10、10、10、10细胞/毫升的菌悬液。

[0064] （4）调节水浴锅温度至55度，将5%琼脂糖凝胶至于其中逐渐融化。然后在灭菌的离心管中混合7.5毫升实施例1中制得的BSK贮存液培养基与7.5毫升5%琼脂糖凝胶，充分混匀后加入1毫升不同浓度的伯氏疏螺旋体菌悬液，加入卡那霉素（sigma公司）至终浓度为200微克每毫升，上下颠倒20次混合均匀后倾倒至已经制备好的底层固体培养基中，室温静置12小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后放入37℃二氧化碳培养箱（5%）中培养。

[0065] （5）每天观察培养基及细菌生长情况，确定无细菌或者霉菌的污染，对于伯氏疏螺旋体B31菌株，需要约10天以后出现肉眼可见的单菌落，14天后单菌落变得更为明显。菌落直径约为0.5-1.5毫米，圆形，表面光滑，菌落边缘光滑或者粗糙，如图1所示。菌落生长于双层培养基中，用牙签小心挑取菌落用暗视野显微镜检查，可以观察到典型的伯氏疏螺旋体菌株。不同浓度的菌悬液获得的单细胞数目不同，并有明显的梯度效应。对于伯氏疏4 5
螺旋体B31菌株，过浓的菌悬液(10、10细胞/毫升)倾注的平皿，单菌落可能会过于密集而变得不可分离。

[0066] 实施例3：

[0067] 一种疏螺旋体单菌落分离纯化方法在制备伯氏疏螺旋体纯培养物中的应用，其应用过程是：

[0068] （1）伯氏疏螺旋体纯培养物的制备：

[0069] 用牙签小心挑取5个伯氏疏螺旋体B31菌株，接种至12毫升BSK-H常规液体培养基（sigma公司产品）中，37度二氧化碳培养箱（5%）中培养3-4天，观察伯氏疏螺旋体生长7
情况，菌株生长至对数生长期，菌落浓度达到10细胞/毫升以上，即可获得伯氏疏螺旋体的单菌落纯培养物。

[0070] （2）伯氏疏螺旋体内源性质粒的鉴定：

[0071] 伯氏疏螺旋体含有20个5-56kb大小不等的线状或者环状的质粒所组成，一些质粒在体外传代培养过程是不稳定的，然而却是编码了重要的表型特征，因此，伯氏疏螺旋体的内源性质粒鉴定对菌种鉴定分型、临床诊断等具有重要的意义。通常根据每个质粒的序列设计特异性的引物，采用PCR的方法鉴定该菌落中是否含有某个质粒。引物的序列参见文献报道，"Analysis of Mechanisms Associated with Loss of Infectivity of Clonal Populations of Borrelia burgdorferi B31M1".Infection and Immunity.June2001,p.3670-3677。

[0072] 取1毫升获得的单菌落纯培养物，8000g离心10，加入100微升水重悬，沸水中煮沸10分钟，离心收集上清即为细胞裂解液，用于PCR鉴定获得的伯氏疏螺旋体单菌落中是否还含有各种内源性质粒。

[0073] PCR反应组分如下：10倍缓冲液，5微升；10毫摩dNTP，4微升；10毫摩尔上游引物，1微升；10毫摩尔下游引物，1微升；细胞裂解液模板，1微升；rTaq酶0.2微升；补水至总体积50微升。

[0074] PCR反应条件：94℃预变性5分钟，30个循环的94℃变性30秒，51℃退火30秒，72℃延伸1分钟，然后72℃继续延伸10分钟。

[0075] （3）内源性质粒图谱：

[0076] 将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，如果有特异性条带，说明该菌落含有目的质粒。对获得的5个单克隆的检测结果如下表所示，+表示含有该质粒，-表示该质粒缺失。

[0077] 由结果可知，只有单克隆5#菌株含有所有检测的质粒，其它几个单克隆缺失一个或多个质粒，伯氏疏螺旋体单克隆5#具有所有的内源性质粒，适用于后续的研究及作为标准品菌株，这也说明在单菌落分离前最初的伯氏疏螺旋体菌株为一个混合菌群，里面混合了多个具有不同质粒图谱的单菌落。

[0078]

[0079] 实施例4：

[0080] 一种疏螺旋体单菌落分离纯化方法在制备疏螺旋体纯培养物中的应用，其应用过程是：

[0081] （1）将回归热疏螺旋体(Borrelia recurrentis)和赫姆斯疏螺旋体(Borrelia hermsii)分别用BSK-H常规液体培养基（sigma公司产品）培养至对数生长期，通过暗视野7 8
显微镜计数，确定其浓度达到10-10细胞/毫升。然后用BSK-H常规液体培养基梯度稀
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释，获得浓度为10细胞/毫升的菌悬液。

[0082] （2）调节水浴锅温度至55度，将5%琼脂糖凝胶至于其中逐渐融化。然后在灭菌的离心管中混合7.5毫升实施例1中制得的BSK贮存液培养基和7.5毫升5%琼脂糖凝胶，充分混匀后加入1毫升不同浓度的疏螺旋体菌悬液上下颠倒10次混合均匀后倾倒至实施例2中已经制备好的底层固体培养基中。室温静置12小时，待培养基完全凝固、表面无冷凝水后放入37℃二氧化碳培养箱（5%）中培养。

[0083] （3）每天观察培养基及细菌生长情况，确定无细菌或者霉菌的污染，菌落生长于双层培养基中，用牙签小心挑取菌落用暗视野显微镜检查。对于回归热疏螺旋体菌株，需要约14天以后出现肉眼可见的单菌落，20天后单菌落变得更为明显。菌落直径约为0.2-1.0毫米，圆形，表面光滑，菌落边缘光滑或者粗糙。菌落生长于双层培养基中，用牙签小心挑取菌落用暗视野显微镜检查，可以观察到典型的回归热疏螺旋体菌株。对于赫姆斯疏螺旋体菌株，需要约12天以后出现肉眼可见的单菌落，15天后单菌落变得更为明显。菌落直径约为
0.5-2.0毫米，圆形或者近圆形，表面光滑，菌落边缘光滑或者粗糙。菌落生长于双层培养基中，用牙签小心挑取菌落用暗视野显微镜检查，可以观察到典型的赫姆斯疏螺旋体菌株。