一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基和培养方法

摘要

本发明公开了一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基和培养方法。花粉离体萌发是指依据花粉萌发所需的条件，选择适宜的营养物质配制液体或固体培养基，使花粉粒在培养基上萌发。其中所述的花粉培养基，以双蒸水为溶剂，包括的组分为15%的蔗糖和萌发液，培养基pH值为6.0；所述的培养方法是收集拟南芥成熟期的花粉，于花粉离体萌发液体培养基中，在25℃光照培养箱中，湿度保持在85％以上，进行光照培养。该发明提供的培养基大大得提高了拟南芥花粉离体萌发率和增加了花粉管长度，可以广泛的应用于相关科研试验中。

权利要求

1.一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基，其特征在于，是以双蒸水为溶剂，其中含有

15%的蔗糖，3 mmol/L 硼酸，8 mmol/L MgSO4•7H2O，5 mmol/L CaCl2，1 mmol/L KCl，10 µg/L肌醇，500 mg/L脯氨酸，5 mmol/L MES；培养基用10 mmol/L KOH调节pH至6.0。

2.一种拟南芥花粉离体萌发培养方法，其特征在于：收集拟南芥成熟期的花粉，于权利要求1所述的花粉离体萌发液体培养基中，在25℃光照培养箱中，湿度保持在85％以上，进行光照培养。

3.根据权利要求2所述的拟南芥花粉离体萌发培养方法，其特征在于，具体步骤是：

（1）配制权利要求1所述的花粉离体萌发液体培养基，

（2）待花粉进入成熟期后，选择主茎上露白或刚刚盛开的花朵，采摘置于1.5 mL离心管中，加入上述花粉离体萌发液体培养基500 µL，在振荡器上振荡1 min，立即取上清液并转移到新离心管中，重复1次，将2次收集的上清液12000 rpm离心1 min，沉淀花粉，以去除花器官其它部分的碎片；

（3）将收集到的花粉转移至含有300 µL上述花粉离体萌发液体培养基的离心管中，混匀，并置于25℃光照培养箱中，湿度保持在85％以上，进行光照培养。

说明书

一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基和培养方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基和培养方法。

背景技术

[0002] 拟南芥（Arabidopsis thaliana）是十字花科植物，广泛分布于欧洲、亚洲、北美洲。拟南芥是总状花序顶生，开花后花梗延长，下部花序呈疏松态。8花白色，很小，花朵直径在1毫米左右。花序有时具苞片，萼片长圆形，长约2毫米，花瓣匙形，长约4毫米，雄蕊6个，雌蕊圆柱形。具有显花植物的全部特征。拟南芥属于自花授粉植物。

[0003] 花粉是植物的雄配子体，在有性生殖中发挥重要的作用，传递雄性亲本的遗传信息。花粉萌发与花粉管生长是植物完成有性生殖的重要过程，也是研究植物细胞极性生长、分化以及信号转导的重要体系，所以观察花粉萌发和花粉管生长的发育过程就显得非常的重要。

[0004] 目前，离体萌发法是普遍认为检测花粉活力最接近花粉的实际活力，因为花粉离体萌发与花粉管生长测定结果较为稳定，更能反映花粉活力的实际状况。但花粉离体萌发需要适宜的培养基，常用的培养基主要成分是蔗糖和硼酸，蔗糖浓度一般为10%～20%，硼酸为0.001%～0.005%，pH为5.5～6.5。对于拟南芥花粉离体萌发的研究，还存在着培养时间长，萌发率低等缺点，所以提供一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基以及培养方法是非常有意义的，并为拟南芥花粉实验研究打下基础。

发明内容

[0005] 本发明解决的问题在于提供一种拟南芥花粉离体萌发液体培养基。

[0006] 本发明所述的拟南芥花粉离体萌发液体培养基，是以双蒸水为溶剂，包括15%的蔗糖，3mmol/L H3BO3，8mmol/L MgSO4·7H2O，5mmol/L CaCl2，1mmol/L KCl，10μg/L肌醇，500mg/L脯氨酸，5mmol/L MES；培养基用10mmol/L KOH调节pH至6.0。

[0007] 本发明还公开了拟南芥花粉离体萌发培养方法，是收集拟南芥成熟期的花粉，于上述的花粉离体萌发液体培养基中，在25℃光照培养箱中，湿度保持在85％以上，进行光照培养。

[0008] 具体步骤为：

[0009] （1）配制本发明的的花粉离体萌发液体培养基。

[0010] （2）待花粉进入成熟期后，选择主茎上露白或刚刚盛开的花朵，采摘置于1.5mL离心管中，加入上述花粉离体萌发液体培养基500μL，在振荡器上振荡1min，立即取上清液并转移到新离心管中，重复1次，将2次收集的上清液12000rpm离心1min，沉淀花粉，以去除花器官其它部分的碎片。

[0011] （3）将收集到的花粉转移至含有300μL上述花粉离体萌发液体培养基的离心管中，混匀，并置于25℃光照培养箱中，湿度保持在85％以上，进行光照培养。

[0012] 本发明提供的拟南芥花粉离体萌发液体培养基配方及培养方法，在离体培养花粉6h后，其萌发率即可达到95%以上，平均花粉管的长度达到300μm以上。与其他常规花粉培养基相比，本发明的培养基配方，不仅可以很大得提高拟南芥花粉在离体条件下的萌发率，并且有效地缩短了花粉萌发时间和增加了花粉管长度。本发明的培养基极大得提高了拟南芥花粉萌发率，可以广泛的应用于相关科研试验中。

附图说明

[0013] 图1花粉萌发培养基和ME3培养基对拟南芥花粉萌发率和花粉管长度的影响。

[0014] 图2蔗糖浓度对拟南芥花粉萌发率和花粉管长度的影响。

[0015] 图3pH值对拟南芥花粉萌发率和花粉管长度的影响。

[0016] 图4温度对拟南芥花粉萌发率和花粉管长度的影响。

[0017] 图5两种培养基对拟南芥花粉萌发率的影响。

[0018] 图6两种培养基对拟南芥花粉管长度的影响。

具体实施方式

[0019] 下面通过具体实施例对本发明进行详细描述：

[0020] 实施例一：拟南芥花粉离体萌发培养条件的筛选

[0021] ①花粉离体培养基的筛选

[0022] 培养基的种类及成分对植物花粉离体萌发的影响较大，针对不同的植物花粉萌发适宜的培养基有所不同。设置两种不同的培养基分别为：（1）花粉萌发培养基；（2）ME3培养基。

[0023] ME3培养基的组成成分为：MgSO4·7H2O370mg/L、KON3950mg/L、KH2PO485mg/L、CaCl·2H2O880mg/L、NH4NO3412.5mg/L、KCl175mg/L、H3BO350mg/L、Na2EDTA7.45mg/L、FeSO4·7H2O0.025mg/L、KI0.83mg/L、Na2MoO4·2H2O0.25mg/L、CuSO4·5H2O0.025mg/L、CoCl2·6H2O0.025mg/L、VB11.0mg/L、VB61.0mg/L。

[0024] 花粉萌发培养基的组成成分为：3mmol/L硼酸、8mmol/L MgSO4·7H2O、5mmol/L CaCl2、1mmol/L KCl、10μg/L肌醇、500mg/L脯氨酸、5mmol/L MES。

[0025] 将拟南芥花粉分别在相同的光照、温度、湿度条件下用上述两种培养基进行培养，通过花粉萌发率和花粉管的长度来分析培养基对花粉离体萌发的影响。

[0026] 花粉萌发以萌发管长度大于花粉直径为标准，每个实验重复3次，每个重复观察花粉数不少于100粒，统计花粉萌发率；对于花粉管的长度测量，用ImageJ软件来测量，每个处理共测90个花粉管长度，每个实验重3次，计算其平均值，花粉管生长的情况可以反映花粉粒生理状况的优劣。

[0027] 结果如图1A和图1B所示，拟南芥花粉在设计的2种培养基中均可萌发，但是花粉萌发率和花粉管生长速度存在显著差异，其中在花粉离体萌发培养基上拟南芥花粉能够较好的萌发，其萌发率可以达到91.8%，花粉管长度也得到较好的生长。

[0028] ②最适蔗糖浓度的筛选

[0029] 蔗糖对于花粉萌发起到一定的作用，它是一种渗透调节物质，在花粉萌发培养基中分别添加0%、5%、10%、15%、20%放入蔗糖，观察含有不同浓度蔗糖的培养基对拟南芥花粉萌发和花粉管生长的影响。

[0030] 结果如图2所示，花粉萌发培养基中含有的蔗糖浓度不同对拟南芥花粉萌发率（图2A）和花粉管生长（图2B）的影响不同，观察可以发现，当蔗糖浓度为15%时，拟南芥花粉萌发率最高，花粉管生长最好。

[0031] ③最适pH值的选择

[0032] 在相同液体萌发培养基和蔗糖浓度的条件下，用10mmol/L KOH调节pH为5、5.5、6、6.5、7，观察培养基不同的pH值对拟南芥花粉萌发和花粉管生长的影响。

[0033] 由图3可见，不同的pH值对拟南芥花粉萌发和花粉管生长有明显差异，通过观察发现，当pH值为6.0的时候，拟南芥花粉的萌发率和花粉管的长度都达到最佳值，而且培养基的pH值过高和过低都不利于拟南芥花粉的萌发。

[0034] ④最适培养温度的选择

[0035] 用含有15%蔗糖的花粉萌发液作为拟南芥花粉萌发培养基，在培养温度分别为20℃、25℃、30℃、35℃的培养条件下，观察拟南芥花粉萌发和花粉管生长状况。

[0036] 结果由图4所示，可以看出温度对拟南芥花粉萌发具有显著影响，在20℃～33℃的范围内，拟南芥花粉萌发的最适培养温度为25℃，在这个温度下培养拟南芥，其萌发率和花粉管长度分别达到91.8%和392.4μm。

[0037] 实施例二：对比实验

[0038] （1）配制培养基

[0039] 培养基A：为本发明的花粉离体萌发液体培养基，以双蒸水为溶剂，15%的蔗糖，3mmol/L H3BO3，8mmol/L MgSO4·7H2O，5mmol/LCaCl2，1mmol/L KCl，10μg/L肌醇，500mg/L脯氨酸，5mmol/L MES。用10mmol/L KOH调节pH至6.0。

[0040] 培养基B：为传统花粉萌发培养基，以双蒸水为溶剂，10%的蔗糖，1.5mmol/L H3BO3，8mmol/L MgSO4·7H2O，5mmol/L CaCl2，1mmol/LKCl，10μg/L肌醇，5mmol/L MES。用10mmol/L KOH调节pH至7.0。

[0041] （2）上午9:00～10:00，采集拟南芥花粉，选择主茎上露白或刚刚盛开的花朵，采摘30朵置于1.5mL离心管中，分别加入培养基500μL，在振荡器上振荡1min，立即取上清液并转移到新离心管中，重复1次，将2次收集的上清液12000rpm离心1min，沉淀花粉，以去除花器官其它部分的碎片。

[0042] 将收集到的花粉转移至含有300μL培养基离心管中，混匀，并置于25℃光照培养箱中，湿度保持在85％以上，进行光照培养6h后，如图5和图6所示，使用本发明培养基A得到的花粉萌发率平均达到95%，平均花粉管长度为315μm。与之相比用传统培养基B得到的花粉萌发率仅为50%，花粉管平均长度为207μm，在培养8h后，花粉萌发率才可以达到70%。