一种萤火虫荧光素酶及其编码基因及获取方法

摘要

本发明涉及一种萤火虫荧光素酶及其编码基因及获取方法；克服原有北美萤火虫荧光素酶热稳定性差，尚不能满足高温下应用的缺陷，对原有北美萤火虫荧光素酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提高其应用价值。氨基酸序列为SEQ ID NO.1；编码中所述蛋白质DNA序列为SEQ ID NO.2。提供上述北美萤火虫荧光素酶突变体的编码基因及制备方法。该方法是构建含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体，利用亲和层析的方法纯化该蛋白，该方法简单易行，操作简单，成本低廉。

权利要求

1.一种具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质,其特征是氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

2.权利要求1中所述氨基酸序列获得方法，其特征是步骤如下：

1)从PDB数据库中下载北美萤火虫荧光素酶的PDB格式的坐标文件1BA3，利用DeepView4.1软件对1BA3文件进行处理：补全缺失残基及原子，去除配体分子；

2)利用Gromacs4.5.4对处理后文件进分子动力学模拟，计算蛋白质每个脯氨酸的RMSF(Root Mean Square Fluctuation)值；确定了具有最高灵活性的区域482-491aa；

3)脯氨酸出现在I型，II型β转角的i+1位置氨基酸及II型β转角i位置氨基酸的概率最大；确定萤火虫荧光素酶结构中提高稳定性突变位点：H489P，即将野生型萤火虫荧光素酶氨基酸序列的第489位的组氨酸突变为脯氨酸。

3.编码权利要求1中所述蛋白质的基因，其特征是DNA序列为SEQ ID NO.2。

4.含有权利要求3中所述基因的重组载体与重组菌。

5.如权利要求4所述的重组载体与重组菌，其特征在于：所述重组载体通过将包含野生型荧光素酶(Luc)基因的载体进行定点突变得到，该突变是将野生型北美萤火虫荧光素酶(P.Pyralis luciferase)基因上的第489位的组氨酸密码子改变成脯氨酸的密码子。

6.如权利要求4、5所述重组载体与重组菌，其特征在于：所述重组载体的获取方法步骤如下：1)含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组载体的构建：(1)以含有荧光素酶基因的质粒pGL2-control vector的核苷酸序列，结合质粒pET28a的多克隆位点与荧光素酶(Luc)基因的限制性内切酶位点设计引物；引物中包含BamHⅠ和HindⅢ突变位点；

(2)以含有Luc基因的质粒pGL2-control vector为模板，进行PCR扩增；含有Luc基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a用T4连接酶进行连接；连接产物转化进入大肠杆菌DH5α；

(3)在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒；利用BamHⅠ和HindIII进行双酶切验证；验证成功的克隆子进行测序验证；

2)快速定点突变方法引入突变位点：

(1)设计引物，引物中包含使Luc基因中489位组氨酸密码子改变为脯氨酸密码子的突变点；

(2)以上述步骤1)获取的含有野生型Luc基因的表达载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体；该突变型重组表达载体内含有SEQ ID NO.2所示DNA序列。

7.权利要求4所述的重组载体与重组菌，其特征在于：所述重组菌是将权利要求5中获得的重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中得到。

说明书

一种萤火虫荧光素酶及其编码基因及获取方法

技术领域

[0001] 本发明涉及分子酶学与生物技术，更具体涉及一种高热稳定性高活性萤火虫荧光素酶的编码基因以及该酶的获取方法。

背景技术

[0002] 在镁离子,ATP,分子氧的存在下萤火虫荧光素酶催化底物虫荧光素的氧化同时发出荧光。这个反应具有极高的效率。目前萤火虫荧光素酶已经作为研究领域的新工具出现在市场上，它具有非放射性、反应灵敏、结果准确、应用范围广、操作简单、无毒副作用等多种优点，因此非常适合应用于分子生物学、生命科学、医学、刑侦、药理学、微生物检测等各个领域。例如在医疗中，它可被用于癌症转移的研究和检测抗癌疗法的疗效，在刑侦上可以用来检测血迹，而其中具有最广阔市场前景的便是荧光素酶在环境微生物检测方面上的运用。在过去的十年里，ATP荧光快速检测法已经变成一种国际测定物体表面清洁水平的标准方法。

[0003] 虫荧光素酶可以从萤火虫体内直接获取。随着分子生物学技术的发展，近年来通过基因工程技术制备虫荧光素酶的方法也已经成熟。1985年，De Wet等首次克隆了北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶的基因，并成功利用大肠杆菌表达制备了虫荧光素酶。国内方面，林金明等人于2008年获得了含有虫荧光素酶基因表达载体的重组细胞，培养该细胞，成功获得具有生物活性的虫荧光素酶，实现了虫荧光素酶生产的国产化。

[0004] 然而，野生型和重组型的荧光素酶很不稳定，当它们暴露于30℃，尤其是35℃以上时会迅速失去活性。这样的热稳定性不能满足该酶在高温下的使用及保存，或通过加热提高反应速度。目前有很多针对提高萤火虫荧光素酶(luciferase)稳定性方面的改造。例如，Peter JWhiter等人在北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶引入的两个突变点E354K，A215L已经被证明有效的提高了虫荧光素酶的热稳定性。另外，2010年Mehdi Imani等人在北美萤火虫荧光素酶(luciferase)中引入突变点A296C/A326C,同样成功提高了其热稳定性并降低了其对PH的敏感度。尽管在提高虫荧光素酶的稳定性方面取得一定进展，但目前该方面研究主要集中于西方国家。随着萤火虫荧光素酶在国内应用的普遍，非常有必要生产具有自主知识产权的高稳定性虫荧光素酶。

发明内容

[0005] 本发明首先所要解决的技术问题是克服原有北美萤火虫荧光素酶热稳定性差，尚不能满足高温下应用的缺陷，对原有北美萤火虫荧光素酶进行突变，得到热稳定性显著提高的突变酶，提高其应用价值。

[0006] 本发明的另一个技术问题是提供编码上述北美萤火虫荧光素酶突变体的编码基因。

[0007] 本发明还有一个技术问题是提供上述北美萤火虫荧光素酶突变体的制备方法。该方法是构建含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组表达载体，利用亲和层析的方法纯化该蛋白，该方法简单易行，操作简单，成本低廉。

[0008] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的：

[0009] 一种具有北美萤火虫荧光素酶活性的蛋白质,其氨基酸序列为SEQ ID NO.1。

[0010] 本发明的氨基酸序列获得方法，步骤如下：

[0011] (1)从PDB数据库中下载北美萤火虫荧光素酶的PDB格式的坐标文件1BA3，利用DeepView4.1软件对1BA3文件进行处理：补全缺失残基及原子，去除配体分子；

[0012] (2)利用Gromacs 4.5.4对处理后文件进分子动力学模拟，计算蛋白质每个脯氨酸的RMSF(Root Mean Square Fluctuation)值；确定了具有最高灵活性的区域482-491aa；

[0013] (3)脯氨酸出现在I型，II型β转角的i+1位置氨基酸及II型β转角i位置氨基酸的概率最大；确定萤火虫荧光素酶结构中提高稳定性突变位点：H489P，即将野生型萤火虫荧光素酶氨基酸序列的第489位的组氨酸突变为脯氨酸。

[0014] 编码中所述蛋白质的基因，DNA序列为SEQ ID NO.2。

[0015] 本发明包括所述基因的重组载体与重组菌。

[0016] 本发明所述的重组载体获取方法，通过将包含野生型Luc基因的载体进行定点突变得到，该突变是将野生型北美萤火虫荧光素酶(P.Pyralis luciferase)基因上的第489位的组氨酸密码子改变成脯氨酸的密码子。

[0017] 重组载体获取方法步骤如下：

[0018] 1)含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组载体的构建：

[0019] (1)以含有荧光素酶基因的质粒pGL2-control vector的核苷酸序列，结合质粒pET28a的多克隆位点与荧光素酶(Luc)基因的限制性内切酶位点设计引物；引物中包含BamHⅠ和HindⅢ突变位点；

[0020] (2)以含有Luc基因的质粒pGL2-control vector为模板，进行PCR扩增；含有Luc基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a用T4连接酶进行连接；连接产物转化进入大肠杆菌DH5α；

[0021] (3)在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒；利用BamHⅠ和HindIII进行双酶切验证；验证成功的克隆子进行测序验证；

[0022] 2)快速定点突变方法引入突变位点：

[0023] (1)设计引物，引物中包含使Luc基因中489位组氨酸密码子改变为脯氨酸密码子的突变点；

[0024] (2)以上述步骤1)获取的含有野生型Luc基因的表达载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体；该突变型重组表达载体内含有SEQ ID NO.2所示DNA序列。

[0025] 本发明的重组菌是将获得的重组载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)中得到。

[0026] 具体内容详细说明如下：

[0027] 一种北美萤火虫荧光素酶突变体,其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其具有SEQ ID NO.2所示DNA序列。其在野生型北美萤火虫荧光素酶(P.Pyralis luciferase)基因上具有1466位由A突变为C的点突变。

[0028] 含有上述核苷酸的表达载体以及含有该表达载体的宿主细胞同样属于本发明的保护范畴之列。

[0029] 本发明通过计算机辅助设计的手段设计高热稳定性的萤火虫荧光素酶突变酶。其原理是：蛋白质的三级结构中存在不稳定区域(Weak Spots)，这些不稳定区域直接影响蛋白质的稳定性。通过突变不稳定区域内氨基酸，优化其中的相互作用，能够有效的提高蛋白质的稳定性。不稳定区域常为原子热运动剧烈区域，具有很高的灵活性。本发明利用分子动力学模拟软件Gromacs 4.5.4分析荧光素酶的三级结构，确定高灵活性区域，向这些区域内引入具有最大刚性的氨基酸：脯氨酸，进而提高萤火虫荧光素酶的稳定性。脯氨酸的结构很特殊，由于吡咯环的存在，其主链的二面角Φ限制在-63±15°。在蛋白质解折叠过程，吡咯环对主链进行限制，将减少蛋白质解折叠构象的数量，从而降低蛋白质解折叠的构象[0030] 其主要步骤如下：

[0031] 首先利用Gromcas 4.5.4软件对萤火虫荧光素酶的三维晶体结构进行分析，确定高灵活性区域：从PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下载荧光素酶的PDB格式的坐标文件1BA3，利用DeepView 4.1软件对1BA3文件进行处理：补全缺失残基及原子，去除配体分子。对处理后文件进分子动力学模拟，计算蛋白质每个氨基酸的RMSF(Root Mean Square Fluctuation)值。该值反应了氨基酸在分子动力学模拟轨迹中的构象状况，越高表明构象越不稳定。通过分析，排除活性位点所在区域，最终确定了具有最高灵活性的区域482-491aa。

[0032] β转角是最小的二级结构类型，与其他二级结构相互连接，折叠，形成蛋白质的三维结构，其占有蛋白质约25％的氨基酸。β转角通常包含四个氨基酸，分别命名为i，i+1，i+2，i+3。根据i+1，i+2的Φ，ψ角度可以将β转角分为六种不同的类型。脯氨酸由于其构象的特殊性，广泛存在于β转角中。Ι和ΙΙ型β转角的i+1位置的氨基酸Φ角是-60°，因此与其他氨基酸相比，熵驱动导致脯氨酸更倾向于存在于β转角特定的位置上。对PDB数据库中所有蛋白的结构及序列信息分析后发现，脯氨酸出现在I型，II型β转角的i+1位置氨基酸及II型β转角i位置氨基酸的概率最大。基于此信息，确定萤火虫荧光素酶结构中可能提高稳定性突变位点：H489P，即将野生型萤火虫荧光素酶氨基酸序列的第489位的组氨酸突变为脯氨酸。

[0033] 本发明另一个需要解决的技术问题是提供高稳定性萤火虫荧光素酶的制备方法，其步骤是：

[0034] 1.突变酶H489P突变位点的引入。

[0035] 1)含有野生型萤火虫荧光素酶基因的重组载体的构建：

[0036] (1)以含有北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶基因的质粒pGL2-control vector(购自Promega公司)的核苷酸序列，结合质粒pET28a(购自Novagen公司)的多克隆位点与荧光素酶(Luc)基因的限制性内切酶位点设计引物。引物中包含BamHⅠ和HindⅢ突变位点。

[0037] (2)以含有Luc基因的质粒pGL2-control vector(购自promega公司)为模板，进行PCR扩增。含有Luc基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a(购自Novagen公司)用T4连接酶进行连接。连接产物转化进入大肠杆菌DH5α。

[0038] (3)在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒。利用BamHⅠ和HindIII进行双酶切验证。验证成功的克隆子进行测序验证。

[0039] 2)快速定点突变方法引入突变位点：

[0040] (4)快速定点突变(Quick Change)的引物设计方法参照北京全式金生物技术有限公司产品目录。引物中包含Luc基因中使1466位置由A突变为C的突变点。

[0041] (5)以上述步骤1)获取的野生型萤火虫荧光素酶重组表达载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体。该突变型重组表达载体内含有SEQ ID NO.2所示DNA序列。

[0042] (6)利用DpnⅠ酶切上步中的PCR扩增产物，以清除模板。酶切后产物转化进入大肠杆菌DH5α。在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒，进行测序验证。

[0043] 2.将上述的含有H489P突变位点的突变型重组表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中；挑取单菌落，接种于4ml含有终浓度50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养过夜。将菌悬液以1:100的体积比扩大培养，每批摇瓶发酵的体积为400ml。当摇瓶内菌液的OD600值达到0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。降低转速到160rpm，降低温度到20℃，继续培养18h。

[0044] 3.400ml菌体发酵液冷却后离心处理。离心的条件为转速10000r/min，温度为4℃，离心时间10分钟。离心完成后去除上清，获得湿菌体。超声波破碎菌体后离心获得上清，通过亲和层析使用GE Healthcare的AKTAprime Plus蛋白质纯化仪及Amersham Pharmacia Biotech公司的DEAE Sepharose Fast Flow介质进行蛋白质的纯化，由此得到一种改造的蛋白，一种分离的蛋白，其序列为SEQ ID NO.2所示氨基酸序列。

[0045] 4.用北京鼎国生物技术有限公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行浓度测定，以BSA作标准曲线。蛋白质定量后配置10ug/ml蛋白液。进行稳定性及活性的测定。最终结果显示该突变型荧光素酶的热稳定性较野生型酶热稳定性提高了约2倍，意外发现，相比于野生型酶，该突变型酶具有更高的催化活性，提高至少2倍。萤火虫荧光素酶在食品，医药领域具有广泛的应用，高稳定性的萤火虫荧光素酶可以更好的满足其实际需要，可以满足在30℃以上的实际应用。同时期活性同样具有显著提高，这可以有效降低同一反应所需酶量，节约成本。

附图说明

[0046] 图1突变位点在萤火虫荧光素酶三维结构中的位置示意图；

[0047] 图2野生型萤火虫荧光素酶基因重组载体双酶切验证图；

[0048] 图3含有野生型萤火虫荧光素酶基因表达载体的构建过程；

[0049] 图4Quick Change定点突变过程；

[0050] 图5萤火虫荧光素酶及其突变酶纯化各阶段的SDS-PAGE分析。泳道1为纯化前野生型酶样品，泳道2为亲和层析后野生型酶样品，泳道3为凝胶过滤后野生型酶样品，泳道4为凝胶过滤后突变型酶样品，泳道5为亲和层析后突变型酶样品，泳道6为纯化前突变型酶样品。M为蛋白质分子量标准，大小为170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD。

[0051] 图6野生型与突变型萤火虫荧光素酶发光强度比较示意图；

[0052] 图735℃萤火虫荧光素酶及其突变酶的热稳定性比较；

[0053] 图8不同温度下萤火虫荧光素酶及其突变酶的热稳定性比较。

具体实施方式

[0054] 实施例1计算机辅助设计高稳定性突变位点

[0055] 从PDB数据库(http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do)中下载荧光素酶的PDB格式的坐标文件1BA3，利用DeepView 4.1软件对1BA3文件进行处理：补全缺失残基及原子，去除配体分子。对处理后文件进分子动力学模拟，所有模拟均是在恒定温度(300K)，恒定压强(常压)，力场采用Gromos 96.1(53A6)的条件下进行，最终模拟时间10ns。选择蛋白质分子动力学轨迹中的最后2ns(9-10ns)，计算蛋白质每个氨基酸的RMSF(Root Mean Square Fluctuation)值。该值反应了氨基酸在分子动力学模拟轨迹中的构象状况，越高表明构象越不稳定。通过分析，排除活性位点所在区域，最终确定了具有高灵活性的区域：482-491aa。脯氨酸是20种基本氨基酸中结构最特殊的一个。由于吡咯环的存在，其主链的二面角Φ限制在-63±15°。在蛋白质解折叠过程，吡咯环对主链进行限制，将减少蛋白质解折叠构象的数量，降低蛋白质解折叠过程的熵值。因此在高灵活性区域内引入脯氨酸，理论上将能够稳定这些区域，进而提高蛋白质的稳定性。对PDB数据库中所有蛋白的结构及序列信息分析后发现，脯氨酸出现在I型，II型β-转角i+1位置氨基酸及II型β-转角i位置氨基酸的概率最大。基于此信息，确定萤火虫荧光素酶结构中三个可能提高稳定性的突变位点：H489P。通过后续的实验验证，含有H489P突变点的突变型酶具有显著提高的热稳定性。H489P突变点在萤火虫荧光素酶结构内的位置如图1所示。

[0056] 实施例2含有萤火虫荧光素酶基因表达载体的构建

[0057] 1.引物设计

[0058] 以含有北美萤火虫(P.Pyralis)荧光素酶基因的质粒pGL2-control vector(购自Promega公司)的核苷酸序列，结合质粒pET28a(购自Novagen公司)的多克隆位点与Luc基因的限制性内切酶位点设计引物，如下：

[0059] 引物luc+:5-CGGGATCCATGGAAGACGCCAAAAAC-3

[0060] 引物luc-:5-CCCAAGCTTTTACAATTTGGACTTTCCGC-3

[0061] 其中上游引物中CG为保护碱基，上游引物中GGATCC为BamHⅠ内酶切位点，下游引物中CCC为保护碱基，AAGCTT为HindⅢ内切酶位点。引物的性质参数经oligo6软件辅助评价合格后，委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行引物合成。

[0062] 2.萤火虫荧光素酶基因(Luc)的PCR扩增

[0063] 以含有Luc基因的质粒pGL2-control vector(购自promega公司)为模板，进行PCR扩增，具体反应体系为：

[0064]

[0065] 将反应体系混匀，短暂离心后，放入PRC扩增仪，按下列反应程序进行PCR反应：94℃预变性5分钟；然后开始循环：变性94℃40秒，退火60℃，30分钟，延伸72℃，3分钟。
进行25个循环；25个循环后进行最后延伸，72℃7分钟。反应结束后，设定4℃保存。

[0066] 3.重组表达载体的构建

[0067] 将上述步骤2中的含有Luc基因的PCR扩增产物纯化后，用限制性内切酶BamHⅠ和HindIII进行双酶切，酶切产物与用同样酶切的载体pET28a(购自Novagen公司)用T4连接酶进行连接。连接产物转化进入大肠杆菌DH5α。构建过程如图3所示。

[0068] 4.重组子阳性克隆的筛选和鉴定

[0069] 在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒。利用BamHⅠ和HindIII进行双酶切。酶切产物1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。由于在目的基因的上游和下游分别设计了BamH Ⅰ和HindIII酶切位点，酶切后将会有约5369bp大片段和1653bp DNA小片段出现。从图可以看出重组表达载体酶切后确为两条带，一条带为载体pET28a,另一条带为大小约1650bp的Luc基因。然后将双酶切验证后的重组载体测序以进一步验证，委托北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。测序结果表明，插入的Luc基因序列与原序列一致。

[0070] 实施例3Quick Change方法定点突变萤火虫荧光素酶基因(Luc)

[0071] 快速定点突变是对特定双链DNA中的氨基酸直接以PCR的方法引入突变，一步完成,不需进行亚克隆，这是目前最简单的定点突变方法。其原理是：以环状质粒为模板，采用一对含有突变点的引物进行扩增，产物是未甲基化的完整质粒，因模板质粒是从大肠杆菌提取的已甲基化的质粒，可以采用DpnⅠ酶切方法清除模板，最后产物中仅剩余新扩增的突变质粒，产物可直接转化进入大肠杆菌的感受态细胞中，挑选阳性克隆子，进行测序验证。其过程如图4所示。

[0072] 1.引物设计

[0073] 本发明的突变引物并非传统的完全互补形式。引物设计方法参照北京全式金生物技术有限公司产品目录。该方法有效的避免了完全互补的两对引物易形成引物二聚体问题。引物包含5’端重叠区和3’端延伸区，重叠区包含15-20个碱基，延伸区包含至少10个碱基，引物总长度约30个碱基。含有突变位点的引物设计如下：

[0074] 上游引物H489P+:5-GTTGTTGTTTTGGAGCCCGGAAAGACGATGACG-3

[0075] 下游引物H489P-:5-GGCTCCAAAACAACAACGGCGGCGGCGGGAAGTT-3

[0076] 引物序列中标有下划线的位置为重叠区，标粗的碱基为突变碱基。

[0077] 2.突变型重组载体的PRC扩增

[0078] 以实施例2中的获取的萤火虫荧光素酶重组表达载体为模板，进行PCR扩增，扩增产物为突变型重组表达载体，具体反映体系为：

[0079]

[0080] 将反应体系混匀，短暂离心后，放入PRC扩增仪，按下列反应程序进行PCR反应：95℃预变性5min。然后30个循环，每个循环：解螺旋，95℃20s；退火，退火温度为两个引物中最低Tm值减5℃，30s；延伸，72℃2.5min，最后延伸，72℃5min,4℃冷却备用。

[0081] 3.突变型重组表达载体的筛选及鉴定

[0082] 利用DpnⅠ酶切步骤2中的PCR扩增产物，以清除模板。酶切后产物转化进入大肠杆菌DH5α。在固体培养基上随机挑取几个单菌落接种至含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h，提取质粒，进行测序验证。测序由北京奥科鼎盛生物科技有限公司完成。测序结果显示在重组萤火虫荧光素酶表达载体内成功引入目的突变点，同时未引起其他变异。

[0083] 实施例4萤火虫荧光素酶及突变型酶基因的原核表达及纯化

[0084] 1.萤火虫荧光素酶的诱导表达

[0085] 将实施例2中获得的野生型萤火虫荧光素酶表达载体及实施例3中获得的突变型酶表达载体转化进入大肠杆菌BL21(DE3)的感受态细胞中；挑取单菌落，接种于4ml含有终浓度50ug/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃，220rpm震荡培养过夜。将菌悬液以1:100的体积比扩大培养，每批摇瓶发酵的体积为400ml。当摇瓶内菌液的OD600值达到0.6时，加入终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)。降低转速到160rpm，降低温度到20℃，继续培养18h。

[0086] 2.萤火虫荧光素酶的分离纯化

[0087] 400ml菌体发酵液冷却后离心处理。离心的条件为转速10000r/min，温度为4℃，离心时间10分钟。离心完成后去除上清，获得湿菌体。将收集到的湿菌体应用亲和层析的平衡缓冲液(10mM磷酸二氢钠，10mM磷酸氢二钠，0.5M NaCl，20mM咪唑，PH 7.4)重新悬浮，再次离心。离心后菌体用40ml平衡缓冲液悬浮，加入0.05体积的10mg/ml的溶菌酶，冰上放置30min。超声破碎后，离心收集上清液。离心条件为，转速12000r/min,时间30min。应用0.45um滤膜过滤上清制备好待上样品。

[0088] 蛋白质的纯化采用AKTAprime plus蛋白质纯化仪及Amersham Pharmacia Biotech公司的DEAE Sepharose Fast Flow介质。具体纯化步骤如下：

[0089] 1)平衡柱子：先用分子级的水将柱子里的乙醇冲洗干净，然后用3-4倍柱体积的平衡缓冲液(10mM磷酸二氢钠，10mM磷酸氢二钠，0.5M NaCl，20mM咪唑，PH 7.4)，平衡柱子，其中体积流量为2ml/min。

[0090] 2)进料吸附：将上清液用0.45um滤膜过滤去。除大分子杂质后，用泵抽取上样，体积流量为1ml/min，至上样结束后。

[0091] 3)清洗：应用平衡缓冲液冲洗色谱柱，直至基线走平。

[0092] 4)洗脱：基线走平后，用洗脱缓冲液(10mM磷酸二氢钠，10mM磷酸氢二钠，0.5M NaCl，0.5M咪唑，pH 7.4)，以体积流量1mL/min的速度恒定洗脱，将目标蛋白从色谱柱上洗脱下来，收集样品。

[0093] 5)采用凝胶过滤手段对亲和层析获得的产物进行脱盐。凝胶过滤过程采用AKTAprime plus蛋白质纯化仪及GE Healthcare公司的HiTrapTm Desalting Columns完成。凝胶过滤的缓冲液为50mM Tris-HCl，100mM NacL，2mM EDTA，1mM DTT。

[0094] 6)将收集到的样品应用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定

[0095] 结果如图5所示，其中泳道1为纯化前野生型酶样品，泳道2为亲和层析后野生型酶样品，泳道3为凝胶过滤后野生型酶样品，泳道4为H489P凝胶过滤后突变型酶样品，泳道5为亲和层析后H489P突变型酶样品，泳道6为纯化前H489P突变型酶样品。M为蛋白质分子量标准，大小为170KD，130KD，100KD，70KD，55KD，40KD，35KD。

[0096] 实施例5野生型萤火虫荧光素酶及突变型酶活性测定及稳定性检测[0097] 1.酶活性的测定

[0098] 用北京鼎国生物技术有限公司生产的BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行浓度测定，以BSA作标准曲线。蛋白质定量后配置10ug/ml蛋白液。在100ul荧光素酶活性检测试剂(0.3mM荧光素，1mM ATP，10mM MgSO4，1mM EDTA，25mM HEPES PH7.8)内加入5ul上述蛋白液，使用Promega公司的GloMaxTM 20/20Luminometer进行反应发光强度的测定。如图6所示，在同等条件下，改造后的萤火虫荧光素酶比野生型酶的发光强度提高了至少两倍。

[0099] 同时测定了底物的动力学参数。底物虫荧光素LH2的Km值测定采用如下方式：在一个1.5ml的离心管内，首先向50ul的混合溶液(1mM EDTA,2mM ATP and 10mM MgSO4,25mM HEPES,PH 7.8)中加入50ul不同浓度的虫荧光素(0.0025-1mM)，然后加入10ul的上述蛋白液激活反应。利用GloMaxTM 20/20Luminometer(购买自Promega公司)测定反应的发光值，延迟2秒，光测量时间为10秒。底物ATP的Km值测定采用相似的方法：在一个1.5ml的离心管内，首先向50ul的混合溶液(1mM EDTA,10mM MgSO4and 0.6mM荧光素,25mM HEPES，PH 7.8)加入50ul不同浓度的ATP溶液(0.004-3mM)，然后加入10ul的蛋白液开始发光反应，采用上述方法测定发光强度。最后采用Lineweaver-Burk曲线计算野生型及突变型萤火虫荧光素酶的动力学参数。结果见表1，发现突变型荧光素酶对底物的亲和力变化很小，但是其对底物的周转速率有了明显提高，对底物ATP提高了1.79倍，对底物LH2提高了约1.90倍。

[0100] 表1野生型酶和H489P突变型酶对底物的动力学参数结果

[0101]

[0102] 2.热稳定性分析

[0103] 将步骤1中野生型和突变型酶蛋白液(10ug/ml)置于35℃下，每隔一段时间取出部分酶溶液，置于冰上，10min后测定发光强度。测定方法为：在100ul的混合溶液(0.3mM荧光素，1mM ATP，10mM MgSO4，1mM EDTA，25mM HEPES)中加入5ul荧光素酶溶液，利用GloMaxTM20/20Luminometer(购买自Promega公司)测定反应的发光值。结果如图7所示。计算35℃下两种酶的半衰期t1/2,即活性降到初始活性50％时所用的时间。

[0104] 野生型酶：t1/2约为8.3min

[0105] 突变型酶：t1/2约为17.6min

[0106] 因此可以知道H489P突变型荧光素酶稳定性较野生型提高了一倍以上。

[0107] 同时还测定了野生型和突变型酶在不同温度下热稳定性情况。将野生型酶与突变型酶分别放置在30℃，35℃，40℃，45℃，50℃水浴锅中，5min后置于冰上，10min后测定发光强度，方法如上。结果如图8所示。可以发现野生型和突变型荧光素酶的发光强度都随着水浴温度的增加而降低。野生型荧光素酶在45℃下水浴5min后酶活性几乎全部丧失，发光强度很弱，但是H489P突变型萤火虫荧光素酶却仍保持20％左右的发光强度。

[0108] 结合上述热稳定性分析结果，可以知道将北美萤火虫荧光素酶489位置的组氨酸替换为脯氨酸，能够有效的提高酶的热稳定性，同时活性提高了约2倍。