稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用

摘要

本发明公开了一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用，功能型分子标记包括Pi-d2A和Pi-d2B，Pi-d2A为由引物对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶MluI酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型；Pi-d2B为由引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶PvuI酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型。利用上述引物对从水稻中扩增出Pi-d2A和Pi-d2B，并用对应的特异限制性内切酶酶切，两段核苷酸序列中至少一段被成功酶切，则水稻中含有稻瘟病抗性基因Pi-d2。本发明能直接鉴定种质资源和育种后代中的抗性基因Pi-d2，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

权利要求

1.一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记，其特征在于，将其命名为Pi-d2A：所述Pi-d2A为由碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶A酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型；

所述水稻为水稻品种地谷、谷农13、谷梅2号或谷梅4号；

所述特异限制性内切酶A为MluI。

2.一种获得稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记Pi-d2A的引物对，其特征在于，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

3.一种鉴定水稻中稻瘟病抗性基因Pi-d2的方法，其特征在于，包括如下步骤：由碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对从水稻基因组DNA中扩增出一段核苷酸序列，该段核苷酸序列由特异限制性内切酶MluI酶切；

上述核苷酸序列能被对应的特异限制性内切酶酶切，则所述水稻中含有瘟病抗性基因Pi-d2。

说明书

稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序

列与应用

技术领域

[0001] 本发明涉及水稻生物技术领域，具体涉及一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用。

背景技术

[0002] 水稻是人类赖以生存的主要粮食作物之一，它是超过一半世界人口的主粮。稻瘟病是世界水稻生产上最具毁灭性的真菌病害之一(Ou et al.Rice diseases(2nd edition).The Cambridge News Ltd,Cambridge,UK,1985,380-381)。至今已有80余个国家报道有稻瘟病的发生，其中以亚洲和非洲发病最为严重。据估计，每年因稻瘟病损失的水稻足以养活6000万人（Subhankar et al.,Rice blast fungus sequenced.Current Science.2005,89(6):930-931）。

[0003] 在农业生产中，防治稻瘟病的主要途径包括化学药剂防治和选育抗病品种，虽然化学药剂防治对提高产量起到重要作用，但化学方法也带来了如环境污染、影响生物多样性等弊端；实践证明，选育和推广抗性品种是防治稻瘟病最经济有效的途径（杨一龙等，水稻稻瘟病部分抗性基因的定位与克隆研究进展.作物杂志,2010，6:10-14）。然而，利用传统育种方法选育抗稻瘟病水稻不仅时间长、周期慢，而且准确性达不到100%。随着现代分子生物学的不断发展，特别是分子标记的出现，为加快抗稻瘟病育种进程奠定了基础，为传统育种注入了新的活力。传统育种过程中的表型选择，与基因型的偏差，会造成选择的不准确性和效率低下。而应用分子标记辅助选择，可有效的检测基因型，有许多传统选择方法无可比拟的优势：其一，分子标记是一种中性标记，不会带来任何有害的表型；其二，分子标记大多为显性或共显性标记，便于识别；其三，分子标记是基于DNA水平上的选择，可在作物的任何生育阶段进行。

[0004] 尽管过去开发了大量与抗稻瘟病基因连锁的分子标记，如RFLP标记、SSLP标 记、RAPD 标 记（Naweed et al.,Identification of RAPD markers linked to a major blast resistance gene in rice.Molecular Breeding.1995,1(4):341-348；Naqvi et al.,Development of a sequence characterized amplified region(SCAR)based indirect selection method for a dominant blast-resistance gene in rice.Genome,1996,39(1):26-30;朱立煌等，用分子标记定位一个未知的抗稻瘟病基因.中国科学(B辑),1994,24(10):1048-1052）、STS标记和SNP标记(Pik-h)（Xu et al.,Efficient authentic fine mapping of the rice blast resistance gene Pik-h in the Pik cluster,using new Pik-h-differentiating isolates.Molecular Breeding,2008,22(2):289-299）等。但这些标记仅是紧密连锁的标记，而且需要依赖构建相应F2群体才能使用，从而影响了标记的利用效率。因此，为了提高选择的效率，有必要发展新型的分子标记。

[0005] 近年来，针对特定基因发展了功能型分子标记，广泛用于高密度图谱构建、基因定位、图位克隆及分子标记辅助育种等(Andersen and Lübberstedt.Functional markers in plants.Trends in Plant Science.2000,8:554–560)。功能型分子标记是建立在关联分析或近等基因系中等位基因功能性基序中单核苷酸多态性位点基础上的一类新型分子标记，一个分子标记位点代表一个特定的基因，甚至与某种性状联系起来，因此通过对某个分子标记的筛选即能对性状进行准确筛选。而传统广泛使用的基于PCR基础的分子标记如RAPD、SSLP和AFLP等标记则是扩增非编码区域或随机在基因组中扩增，得到的位点一般与目标性状基因距离较远，这使得这些标记在应用上与其目标有一定的偏差。

[0006] 功能型分子标记的优点包括：(1)是一类显性或共显性分子标记；(2)不依赖于分子遗传作图；(3)辅助选择性高，理论上选择效率可达100%。主要的缺点：(1)可开发利用的分子标记相对较少；(2)部分基因基因不能开发相应的功能型分子标记。

[0007] 截止目前，相关学者已开发了多个用于鉴定抗稻瘟病基因的功能型分子标记。Jia等(Jia et al.,Direct interaction of resistance gene and avirulence gene products confers rice blast resistance.The EMBO Journal,2000,19(15):4004-4014)开发了可特异扩增抗稻瘟病基因Pi-ta内部序列的显性分子标记YL155/YL87、YL153/YL154、YL100/YL102。Robert等(Robert et al.,Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferring resistance to multiple Pyricularia grisea pathotypes.Crop Science,2004,44:1790-1798)设计了能特异扩增Pib基因内部序列的显性分子标记PibDom；刘洋等(刘洋等,水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用,中国农业科学，2008,41（1）：9-14)又在此基础上增加了可扩增Pib等位感病基因的分子标记。高利军等(高利军等,5个抗稻瘟病基因分子标记的建立及应用．2010,硕士学位论文，中国农业大学图书馆)利用抗稻瘟病基因Pi-d2、Pi9、Pi2、Pi-ta、Pi5与其等位感病基因之间的序列差异，开发了特异性的分子标记M-Pid2、M-Pi9、M-Pi2、M-Pita和M-Pi5。这些分子标记特异性强，能够精确地鉴定水稻抗稻瘟病材料中含有的抗性基因，并且其辅助选择的准确率高，理论上可以达100%。如王忠华等(王忠华等，水稻抗稻瘟病基因Pi-ta的分子标记辅助选择.作物学报,2004，12:1259-1265)利用显性分子标记YL155/YL87与YL183/YL87对350个杂交F3代株系进行早期筛选，得到
118个抗稻瘟病基因Pi-ta纯和的株系，并且田间抗性调查结果与Pi-ta基因分子检测结果一致。刘洋等(刘洋等,水稻抗稻瘟病Pib基因的分子标记辅助选择与应用,中国农业科学，2008,41（1）：9-14)用Pib特异性的分子标记对600个杂交F2代单株进行早期筛选，得到185个抗稻瘟病基因Pib纯合的单株，并且这些单株的田间抗性调查结果显示Pib基因存在与否与水稻稻瘟病抗性相吻合。

[0008] 本实验室与中国水稻研究所吴建利课题组合作，针对Pi25基因开发了一套行之有效的功能型分子标记，选择效率可以达到100%（Wang et al.,Development and validation of CAPS markers for marker-assisted selection of rice blast resistance gene Pi25.Acta Agronomica Sinica,2012,11:1960-1968）。

[0009] 尽管授权专利号ZL200310118434.3的发明专利针对Pi-d2基因公开了一种分子标记dCAPs1，但由于该标记仅是Pi-d2基因的紧密连锁标记，而非Pi-d2基因的功能型分子标记，因此无疑会影响Pi-d2基因的选择效率。为了加快Pi-d2基因在抗稻瘟病育种上的应用，使其选择效率在理论上达到100%，本领域迫切需要针对Pi-d2基因开发更有效功能型分子标记并应用于分子育种中。

发明内容

[0010] 本发明提供了一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用，不仅能快速有效地区分水稻品种的基因型，而且还能直接鉴定种质资源和育种后代中的抗性基因Pi-d2，

[0011] 一种稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记，其特征在于，包括Pi-d2A和Pi-d2B：

[0012] 所述Pi-d2A为由碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶A酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型；

[0013] 所述Pi-d2B为由碱基序列如引SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4的引物对从水稻基因组DNA中扩增出的核苷酸序列，经特异限制性内切酶B酶切之后，与稻瘟病抗性基因Pi-d2呈特异性带型。

[0014] 所述的功能型分子标记Pid2A和Pid2B的引物序列如下所示：

[0015] Pi-d2A上游引物：CTTTTGTACTGAGGGACCAC（SEQ ID NO.1）；

[0016] Pi-d2A下游引物：CGATTATCTCAAGCAAAACC（SEQ ID NO.2）。

[0017] Pi-d2B上游引物：GAGAATGTTCTACTTGAC（SEQ ID NO.3）；

[0018] Pi-d2B下游引物：TCGAAGATGTCCTGACGA（SEQ ID NO.4）。

[0019] 所述水稻为水稻品种地谷、谷农13、谷梅2号或谷梅4号。

[0020] 所述特异限制性内切酶A为MluI。

[0021] 所述特异限制性内切酶B为PvuI。

[0022] 所述的稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记Pid2A和Pid2B的确定方法，是通过PCR方法从抗性材料和感病材料中扩增Pi-d2(或pi-d2)等位基因并进行测序及比对分析，分析得到2处SNP（单核苷酸多态性），利用在线软件dCAPS Finder（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html）确定单碱基改变引起的相应限制性酶切位点的变化，最后利用在线引物设计软件（http://frodo.wi.mit.edu/primer3/）设计了上述功能型分子标记Pid2A和Pid2B的引物序列。

[0023] 本发明还提供一种获得稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记Pi-d2A的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

[0024] SEQ ID NO.1：CTTTTGTACTGAGGGACCAC；

[0025] SEQ ID NO.2：CGATTATCTCAAGCAAAACC。

[0026] 本发明还提供一种获得稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记Pi-d2B的引物对，所述引物对的碱基序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

[0027] SEQ ID NO.3：GAGAATGTTCTACTTGAC；

[0028] SEQ ID NO.4：TCGAAGATGTCCTGACGA。

[0029] 本发明还提供了一种鉴定水稻中稻瘟病抗性基因Pi-d2的方法，包括如下步骤：

[0030] 由碱基序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示的引物对从水稻基因组DNA中扩增出一段核苷酸序列，该段核苷酸序列由特异限制性内切酶MluI酶切；

[0031] 由引物对SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4从水稻基因组DNA中扩增出另一段核苷酸序列，该段核苷酸序列由特异限制性内切酶PvuI酶切；

[0032] 任一一段或两段核苷酸序列能被对应的特异限制性内切酶酶切，则所述水稻中含有瘟病抗性基因Pi-d2。

[0033] 本发明的功能性分子标记还用于水稻种质资源的筛选、分子标记辅助育种、基因聚合育种以及转基因育种中。

[0034] 本发明相对于现有技术具有如下优点：

[0035] 本发明的功能型分子标记Pid2A和Pid2B是通过PCR技术实现的，不仅能快速有效地区分水稻品种的基因型，而且还能直接鉴定种质资源和育种后代中的抗性基因Pi-d2，可以在育种进程的任何阶段进行，不受任何外界因素的影响，极大地缩短了育种进程，提高了育种效率。

附图说明

[0036] 图1是不同水稻材料的分子标记Pi2A鉴定结果。泳道1-20分别为水稻品种Bettment、江西984112、浙3-5、光辉、花90-68、三芦占7号、85-404、早红突B、金龙B、协B、二九南B、明珠1号、寒粳、水源258、93-11、浙恢7954、02428、谷梅4号、谷梅2号、地谷B。M是DNA标准物DL2000。

[0037] 图2是回交水稻材料的叶瘟抗性鉴定结果。1-4分别是回交后代(恩施地谷B//02428/明直B)BC3F5、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-3、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-2、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-1。

[0038] 图3是回交水稻材料的穗瘟抗性鉴定结果。1-4分别是回交后代(恩施地谷B//02428/明直B)BC3F5、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-3、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-2、(赣香B/恩施地谷B)BC3F5-1。

具体实施方式

[0039] 以下实施例所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术，在Ausubel编写的由John Wiley and Sons公司出版的Current Protocols in Molecular Biology和J.Sambrook等编写的由Cold Spring Harbor Laboratory Press(2001)出版的Molecular rdCloning:A Laboratory Mannual,3 ED.等文献均有详细的说明。以下实施例中所用的实验材料如无特殊说明均为市售购买产品。

[0040] 实施例1：Pi-d2等位基因编码区序列的比对及SNP的鉴定

[0041] 根据已发表的Pi-d2基因（GenBank accession number:NM_001064221）(Chen et al.,A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance.The Plant Journal,2006,46(5):794-804)设计3对特异引物（见表1），利用PCR扩增技术，从持久高抗抗稻瘟病籼稻品种谷梅2号和稻瘟病敏感粳稻品种日本晴中扩增Pi-d2基因，并进行测序（测序委托于上海桑尼公司），利用多序列比对软件DNAMAN对测序获得的等位基因进行比对分析，鉴定得到2个SNP（单核苷酸多态性位点），分别是翻译起始位点后第1023和2232个碱基发生了变化。

[0042] 表1.Pi-d2基因的扩增特异引物

[0043]

[0044] 实施例2：Pi-d2基因的功能型特异分子标记的设计与验证分析

[0045] 根据dCAPS标记设计原理（Neff et al.,Web-based primer design for single nucleotide polymorphism analysis.Trends Genet.2002,18(12):613-615），利用标记设计在线软件dCAPS Finder2.0（http://helix.wustl.edu/dcaps/dcaps.html），针对上述2个SNP分别设计了相应功能型分子标记及其引物（见表2）。

[0046] 表2.Pi-d2基因的功能型分子标记及其引物

[0047]

[0048] 用表2中的两对引物扩增水稻材料中的抗（或感）病基因，经表2中的限制性内切酶酶切后，可以被酶切的材料为含有抗性基因，反之则为没有。

[0049] 利用上述合成的引物分别扩增抗病品种和感病品种，PCR扩增体系和反应程序如下：

[0050]

[0051] 反应参数：

[0052] 98℃，10秒，55℃，15秒，72℃，30秒，35个循环。72℃延伸5分钟。

[0053] PCR产物经琼脂糖胶确定后，经MluI或PvuI酶于37度条件下酶切3小时。酶切体系如下：

[0054] 限制性酶酶切反应体系：

[0055]

[0056] 酶切反应完后，经8%的PAGE胶电泳检测，电泳条件100V，跑2小时。所检测的抗感材料的结果见图1，结果表明，仅有协B、寒粳、谷梅4号、谷梅2号、地谷B等5个材料中含有Pi-d2抗性基因。根据协B和寒粳的系圃，其原始亲本中含有抗病材料谷梅2号和中花8号（在chen等（2006）（Chen et al.,A B-lectin receptor kinase gene conferring rice blast resistance.The Plant Journal,2006,46(5):794-804）的文献中，中花8号为含有Pi-d2基因的抗性材料）。因此，可以认为上述功能型标记是可靠的。

[0057] 实施例3：Pi-d2基因的功能型特异分子标记在回交后代中的辅助应用[0058] 利用高抗稻瘟病材料地谷B为亲本，与当前被广泛应用的保持系金23B、中9B、赣香B和明直B等保持系杂交，经多代回交和自交获得一批性状优良的保持系（见表3）。根据王宁（2011）（王宁，Pi5基因的分子标记辅助选育及转甘薯储藏蛋白基因的抗稻瘟病水稻新材料培育，2011，硕士学位论文，浙江大学图书馆）中的DNA提取方法分别提取DNA。利用实施例2中开发的功能型标记分析转育后代中的内源Pi-d2基因。结果表明50%的回交后代中含有Pi-d2抗性基因（见表3）。

[0059] 与此同时，利用10-139（C13小种）和11-01（B13小种）两个生理小种进行人工叶瘟鉴定以及在浙江武义进行自然穗瘟鉴定，内源抗性基因结果见表3、植株叶瘟抗性结果见表3和图2、植株穗瘟抗性结果见表3和图3。由表3的结果可知，由本发明的分子标记及鉴定方法鉴定的结果与实测结果基本一致，由本发明方法检测出含有Pi-d2基因的水稻材料的稻瘟病病抗性一般变现为高抗以上。

[0060] 表3.回交后代的Pi-d2基因及其稻瘟病抗性鉴定结果

[0061]

[0062] 备注：a中“√”为含有Pi-d2基因；“×”为含有pi-d2基因；b中0级为免疫；1-3级为高抗；4-6级为中抗；7-8级为感病；9级为高感；c中0为无病；1为发病率低于5%；3为发病率5-10%；5为病率11-25%；7为发病率26-50%；9为发病率高于50%。