一种检测雌激素硫酸转移酶活性的方法

摘要

本发明涉及一种检测雌激素硫酸转移酶活性的方法，属于新技术开发领域。本发明提供一种灵敏度高、重现性好、取材方便、操作简单易行的方法，可用于临床和科研来评价雌激素硫酸转移酶的活性。可以快速分析多种组织样本和血液中的雌激素硫酸转移酶活性，为自然流产、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等雌激素相关疾病的预警、辅助诊断和治疗策略提供重要指标。

权利要求

1.一种非诊断目的的检测雌激素硫酸转移酶SULT1E1活性的方法，利用同位素标记反应底物和/或硫供体，所述反应底物和硫供体在含有SULT1E1的待测样品的催化作用下发生硫化反应，通过对反应得到的硫化底物进行检测，计算出SULT1E1的活性；所述的反应底物选自甲状腺激素；所述甲状腺激素为甲状腺素、三碘甲腺原氨酸或四碘甲腺原氨酸；所述的硫供体为5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷；所述的待测样品为血浆。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用液体闪烁计数仪对硫化反应得到的硫化底物进行检测，根据同位素测试结果计算出待测样品中SULT1E1的活性。

131

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用[ I]标记三碘甲腺原氨酸/四碘甲

131

腺原氨酸（[ I]-T3/T4）作为反应底物，用5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷作为硫供体提供硫

131

酸基团，添加含有SULT1E1的待测样品，反应后产生的 [ I]-三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺

131

原氨酸的硫化物（[ I]-T3/T4-S）用液体闪烁计数仪进行检测，计算出待测样品中SULT1E1的活性。

35

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：用[ S]标记的5'-磷酸磺基-2'-磷酸

35

腺苷（[ S]- 5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷）提供硫酸基团，用三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原

35

氨酸作为反应底物，添加含有SULT1E1的待测样品，反应后产生 [ S]-三碘甲腺原氨酸/四

35

碘甲腺原氨酸的硫化物（[ S]- T3/T4-S）用液体闪烁计数仪进行检测，计算出中待测样品中SULT1E1的活性。

说明书

一种检测雌激素硫酸转移酶活性的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种检测雌激素硫酸转移酶活性的新技术领域。通过检测组织(胎盘、肿瘤等)、血液和尿中的雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性，可作为自然流产、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等的预警和辅助诊断指标。

背景技术

[0002] 雌激素（estrogen，E2）的代谢则主要通过硫酸化途径完成，可将雌激素转化为硫酸化的雌激素（E2-S）。雌激素硫酸转移酶（Estrogen sulfotransferase，EST）是雌激素硫酸化反应的关键酶。人体内能催化雌激素硫酸化的关键酶SULT主要包括SULT1E1，SULT1A1，SULT1A3和SULT2A1。其中SULT1E1对雌激素的亲和力最强，是关键的雌激素硫酸转移酶。近年的研究证明，SULT1E1通过雌激素的硫酸化使雌激素失活，而甾体硫酸酯酶（Steroid sulfatase，STS）使E2-S水解为雌激素。因此，E2-S被认为是具有生物活性雌激素的前体，参与机体雌激素水平的调节。

[0003] 自然流产与SULT1E1：我国育龄妇女中不孕和自然流产发生率逐年上升。据“2010中国不孕不育现状调研报告”显示，我国自然流产率达15%，死胎率（孕20周之后发生的胎儿死亡）达到15%～20%。妊娠第20-42周，胎盘产生大量的SULT1E1，使卵巢分泌的雌激素转化成E2-S。与雌激素相比，E2-S容易通过胎盘屏障进入胎儿体内，经STS作用再还原成游离雌激素。雌二醇能刺激合成促肾上腺皮质激素（ACTH）和促甲状腺激素（TSH），促进胎儿的成长和脑的发育。此外，随着工业化进程的不断加快，我国环境污染问题日益突出，环境内分泌干扰物对生殖健康的影响备受关注。近年来，中国人血清中某些环境雌激素浓度增加了约50多倍，脐带血有机氯农药的检出率高达97.9%。本发明的研究发现，作为化妆品和护肤品防腐剂的三氯生通过与雌激素竞争性结合SULT1E1，抑制SULT1E1的活性，导致E2-S水平降低。由于游离雌激素水平急剧增加易发生高凝状态和激活凝血因子，导致胎盘发生大量的血栓，血-胎盘屏障破坏和胎盘组织坏死，胎儿宫内死亡。由此可见，SULT1E1活性降低可作为自然流产的预警指标。

[0004] 乳腺癌与SULT1E1：乳腺癌是妇女常见的恶性肿瘤之一。邓文慧等报道（Chinese Journal of Cancer，2004：23）雌激素刺激乳腺的SULT1E1基因扩增和转录频率增加,易产生基因突变或转录后修饰异常,导致SULT1E1表达下降,增加乳腺细胞的癌变。SULT1E1在肿瘤组织的表达较正常。体内实验发现过表达SULT1E1可以抑制雌激素引起的细胞增殖。SULT1E1能抑制雌激素诱导的肿瘤细胞增殖。章烨等（中华临床医师杂志，2012：13）认为SULT1E1在75％乳腺癌组织中表达降低对激素依赖型乳腺癌的发生非常重要。由此可见，SULT1E1活性降低可能是乳腺癌变的预警指标。

[0005] 子宫内膜癌、子宫肌瘤与SULT1E1：子宫内膜癌是常见的女性生殖道恶性肿瘤之一，近年来其发病率有上升趋势，且发病年龄逐渐年轻化。子宫内膜癌被认为是雌激素依赖性肿瘤，发病与长期大量雌激素刺激有关。姜展红等（中国妇产科临床杂志，2010：11）报道SULT1E1低表达与子宫内膜癌发病密切相关。此外，采用免疫组化染色法检测SULT1El蛋白的表达，结果显示肌瘤组织中SULTIE1蛋白表达低于肌瘤包膜外肌层组织，推断子宫肌瘤的发生、发展与子宫肌瘤组织局部SULT1El水平降低有关。由此可见，SULT1E1的低表达和低活性可作为子宫内膜癌、子宫肌瘤的预警和辅助诊断指标。

[0006] 卵巢癌与SULT1E1：卵巢上皮性癌(卵巢癌)的病死率高居妇科恶性肿瘤首位。近年来虽然卵巢癌的诊治手段取得了一定的进展，但其病死率仍无明显改善。近年的研究发现，SULT1E1在卵巢浆液性肿瘤组织中的表达及其临床意义。由此可见，SULT1E1的表达降低可作为卵巢上皮性癌(卵巢癌)的预警和辅助诊断指标。

[0007] 上述的研究资料显示，SULT1E1的表达减少和活性降低与自然流产、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢上皮性癌(卵巢癌)发生密切相关，因此检测SULT1E1的表达水平和活性可作为自然流产、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢上皮性癌(卵巢癌)发生的预警和辅助诊断指标，也是雌激素依赖型乳腺癌的甄别指标。

[0008] 目前已有的SULT1E1表达水平的检测方法主要有以下几种：（1）SULT1E1蛋白水平的检测试剂盒（人雌激素硫酸转移酶重组蛋白的C末端融合了一个6个氨基酸的His标签，该蛋白最终由标准的色谱技术纯化出）；（2）用SULT1E1抗体进行免疫组织染色，反映SULT1E1的表达量；（3）用Western blot的方法，检测SULT1E1的蛋白水平；（4）用实时定量RT-PCR的方法，检测细胞中SULT1E1的mRNA水平。但是上述这些方法只能反映SULT1E1的含量，不能准确地反映SULT1E1对雌激素的硫酸化能力。此外，作为疾病发生的预警指标和辅助诊断，检测血液、尿液、唾液等非创伤性标本尤为合适。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一种简单便捷且准确度高的检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性的方法。为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

[0010] 一种检测雌激素硫酸转移酶SULT1E1活性的方法，利用同位素标记反应底物和/或硫供体，所述反应底物和硫供体在含有SULT1E1的待测样品的催化作用下发生硫化反应，通过对反应得到的硫化产物进行检测，可计算出SULT1E1的活性。

[0011] 本发明所述的方法，其中，所述的反应底物选自雌激素或甲状腺激素；所述雌激素为雌二醇、雌酮或雌三醇；所述甲状腺激素为甲状腺素、三碘甲腺原氨酸或四碘甲腺原氨酸。（因为SULT1E1能引起雌激素或甲状腺激素的硫基化反应。）

[0012] 本发明所述的方法，其中，所述的硫供体为5'-磷酸磺基-3'-磷酸腺苷（又可称3磷酸腺苷-5磷酸硫酸）或5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷。

[0013] 本发明所述的方法，其中，所述的待测样品优选为血浆，利用血浆作为待测样品能够直观、准确地检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性。（因为免疫印迹技术已确定血浆中有SULT1E1的存在。请见实施例1的图1-A）

[0014] 此外，所述的待测样品还可以为组织细胞提取物，如胎盘、卵巢、乳腺、子宫、血管内皮细胞等的组织标本。

[0015] 本发明所述的方法，用液体闪烁计数仪检测同位素标记硫化产物，并计算出待测样品中SULT1E1的活性。

[0016] 本发明所述的方法，具体可以采用如下技术方案：

[0017] （方法一，如图9所示）用[3H]标记-雌二醇（[3H]-E2）、[131I]标记三碘甲腺原氨131
酸/四碘甲腺原氨酸（[ I]-T3/T4）作为反应底物，用5'-磷酸磺基-3'-磷酸腺苷（PAPS,又称活性磺基）或5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷（另一种活性磺基）作为硫供体提供硫酸
3
基团，添加含有SULT1E1的待测样品，反应后产生的[H]-17β雌二醇-3硫酸盐结合体
3 131 131
（[H]-E2-S）或[ I]-三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸的硫化物（[ I]-T3/T4-S）用液体闪烁计数仪进行检测。计算出单位待测样品（微克蛋白或毫升血浆）中SULT1E1的活性，所述的待测样品为组织提取物或血浆样品，优选为血浆。

[0018] 更具体地以[3H]-E2为例，方法一优选包括如下步骤：

[0019] （1）待测样本的处理：在非妊娠成年雌鼠和妊娠第15-18天的雌鼠，采血0.5-1.0毫升（抗凝），4℃离心（3500rpm）后取上清；用BCA法测量上清蛋白浓度；（2）反应体系：依3
次加入以下反应体系（总量达0.5毫升）：[H]-E2（0.25～10nM）、血浆蛋白量（100～1600微克）、3磷酸腺苷-5磷酸硫酸(PAPS，10～1000μM)、DTT（8mM）、Tris-Cl(pH7.4，100mM)、MgCl2（10mM）；37℃反应45分钟后，加入1.5毫升的冰三氯乙酸或冰甲醇停止反应，震荡混匀；加入1毫升二氯甲烷或氯仿抽提，4℃离心（12000rpm）后取上清（0.2毫升）；（3）反应
3
物的检测和结果分析：用液体闪烁计数仪检测[H]-E2-S，计算出待测样品中SULT1E1的活性。

[0020] 或（方法二，如图10所示），用[3H]标记-雌激素（[3H]-E2）或[131I]标记三碘131
甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸（[ I]-T3/T4）作为反应底物，添加待测样品（含有内源性
3 131
SULT1E1和PAPS），反应后产生的[H]-E2-S或[ I]-T3/T4-S用液体闪烁计数仪进行检测，计算出待测样品中SULT1E1的活性，所述的待测样品为组织提取物，优选为胎盘、卵巢、乳腺或子宫等组织标本。

[0021] 或（方法三，如图11所示），用[35S]标记-PAPS（[35S]–PAPS）提供硫酸基团，用雌二醇或三碘甲腺原氨酸/四碘甲腺原氨酸作为反应底物，添加含有SULT1E1的待测样品，反35 35 35
应后产生[ S]标记17β雌二醇-硫酸盐结合体([ S]-E2-S)或[ S]标记三碘甲腺原氨
35
酸/四碘甲腺原氨酸的硫化物([ S]-T3/T4-S)用液体闪烁计数仪进行检测，计算出待测样品中SULT1E1的活性，所述的待测样品可以为组织提取物或血浆。

[0022] 采用上述技术方案，本发明提供了一种灵敏度高、重现性好、取材方便和多样（组织、血液）、操作简单易行的方法，该方法能够快速且准确检测和分析SULT1E1的活性。通过检测血液中SULT1E1的活性，为自然流产、乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等雌激素相关疾病的预警、辅助诊断和治疗策略提供重要指标。

附图说明

[0023] 图1A-F为用方法一的技术检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性的结果示意图；

[0024] 图2为用方法二的技术检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性的结果示意图；

[0025] 图3为用方法三的技术检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性的结果示意图；

[0026] 图4A-B为妊娠期三氯生染毒能降低胎盘、血浆中SULT1E1活性示意图；

[0027] 图5A-B为妊娠期三氯生染毒不改变SULT1E1的表达的结果示意图；

[0028] 图6A-C为妊娠期三氯生染毒增加血浆E2水平，但是降低绒毛膜促性腺激素水平的结果示意图；

[0029] 图7A-B为妊娠期三氯生染毒引起胎盘内出现大量的血栓和严重的组织坏死的结果示意图；

[0030] 图8A-B为妊娠期三氯生染毒明显增加胎鼠的死亡率和流产率的结果示意图；

[0031] 图9方法一的示意图；

[0032] 图10方法二的示意图；

[0033] 图11方法三的示意图。

具体实施方式

[0034] 本发明结合附图和实施例作进一步说明雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）的活性检测，以及在制备自然流产以及乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌等疾病的预警检测试剂盒中的应用。

[0035] <实施例1>用方法一的技术检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性

[0036] 实验主要材料：ICR小鼠（雌性80只），体重25克～30克，购自江苏省实验动物中心。

[0037] 实验操作：雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性检测方法包括如下步骤：

[0038] （1）标本提取：①胎盘组织：取出妊娠第15天的雌鼠胎盘。每0.1克胎盘组织加入400微升全蛋白裂解液（主要包括磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂、PMSF等成分），超声匀浆，冰中静置30分钟,4℃离心(12000rpm)15分钟，取上清。用BCA法测量上清的蛋白浓度。②血清/血浆：非妊娠雌鼠、妊娠第15天的雌鼠，采用毛细吸管进行内眦取血0.5-1.0毫升或从尾静脉采血1.0毫升（抗凝），4℃离心（3500rpm）20分钟，抽取上清。用BCA法测量上清蛋白浓度。③尿液：采集非妊娠雌鼠、妊娠第15天和第18天的雌鼠尿液，4℃离心（3500rpm）
20分钟，抽取上清。

[0039] （2）标本反应：依次加入以下反应体系总量达0.5毫升。0.25-10nM的[3H]-E23
（[6,7-H(N)]-E2，60Ci/mmol，Perkin-Elmer Life Sciences Inc.）、待测样本的蛋白量（100～1600微克）或等体积的尿液（或加0.5-70纳克/毫升的SULT1E1，纯度>92%，Sino Biological Inc.）、DTT（8mM）、Tris-Cl(pH7.4，100mM)、MgCl2（10mM）、3磷酸腺苷-5磷酸硫酸(PAPS，10～1000μM)。37℃反应45分钟后，加入1.5毫升的冰三氯乙酸或冰甲醇停止反应，震荡混匀。加入1毫升二氯甲烷或氯仿抽提，4℃(12000rpm)离心10分钟，抽取上清（0.2毫升）。

[0040] （3）标本检测：用液体闪烁计数仪检测[3H]标记的17β-雌二醇-3硫酸盐结合体3
（[H]-E2-S）的dpm（每分钟衰变数）。

[0041] （4）检测结果分析：1（Ci）=2.22×1012（dpm）。1（dpm）=1/2.22×10-12（Ci）-12 -9 -12 -9=1/2.22×10 /60×10 （pmol）。X（dpm）×1/2.22×10 /60×10 （pmol）÷样本蛋白
3
量＝[H]-E2-S（pmol/min/mg）＝SULT1E1活性（pmol/min/mg）。反应体系中加SULT1E1产
3
生的[H]-E2-S（pmol/min/mg）量效关系，以确定该反应体系是否适合用于胎盘组织和血浆样本的检测，可以比对得到待测样本中产生雌激素硫基化反应的SULT1E1相对量。

[0042] （5）Western blot检测（免疫印迹）：胎盘组织、血浆样本中加入RIPA蛋白裂解液，4℃离心(12000rpm)，取上清液测蛋白浓度。胎盘（蛋白20微克）、血浆（蛋白100微克）或等体积的尿液，进行蛋白电泳。与SULT1E1一抗反应（24小时），再与辣根过氧化物（HRP）标记二抗反应，然后进行化学发光显色。用凝胶成像系统对胶片进行薄层密度扫描，记录相应条带的透射光积分光密度（IOD）值反映蛋白含量。

[0043] 实验结果（图-1）：

[0044] （1）免疫印迹检测结果显示，妊娠期胎盘组织蛋白的SULT1E1浓度是同浓度血浆蛋白的约25倍，而非妊娠雌鼠血浆的SULT1E1浓度仅是妊娠雌鼠血浆的1/3（图-1A）。

[0045] （2）采用方法一的技术，当[3H]-E2（5nM）、SULT1E1（0.5-50纳克/毫升）、PAPS（100μM）加入反应体系中，检测SULT1E1活性（pmol/min/mg）的SULT1E1浓度-反应曲线（图-1B）。本反应体系可用于检测SULT1E1的最大浓度是30纳克/毫升。

[0046] （3）如图-1C所示，当[3H]-E2（5nM）、PAPS（100μM）的反应体系中添加不同浓度的血浆蛋白（100～16000微克）时，非妊娠雌鼠和妊娠期雌鼠血浆SULT1E1活性显示剂量依赖性增加（图-1C）。与图-1B进行比对，非妊娠雌鼠800微克血浆蛋白产生的SULT1E1活性与0.73纳克/毫升SULT1E1的作用相当，而妊娠期雌鼠800微克血浆蛋白的SULT1E1活性与1.75纳克/毫升SULT1E1的作用相当。

[0047] （4）当PAPS（100μM）、血浆蛋白量（800微克）的反应体系中添加不同浓度的3 3 3
[H]-E2（0.25～10nM）时,[H]-E2转化为[H]-E2-S的最大浓度在1.0nM（图-1D）。

[0048] （5）在[3H]-E2（5nM）、血浆蛋白量（800微克）、PAPS（10、100或1000μM）的反应体系中，当PAPS为100μM时，SULT1E1活性达到最大（图-1E）。

[0049] （6）采用[3H]-E2（5nM）、胎盘或血浆蛋白（800微克）、PAPS（100μM）反应体系。结果显示，与非妊娠雌鼠相比，妊娠期雌鼠血浆蛋白的SULT1E1活性增加了3倍以上（图-1F）。在妊娠期雌鼠，胎盘蛋白产生SULT1E1活性大约是血浆的4倍（图-1F）。尿液中不能检测到
3
[H]–E2-S（图-1F）。

[0050] ◎试验结果提示，这种检测方法以及反应体系中反应底物[3H]-E2（2～5nM）、硫供体PAPS（100μM）和血浆蛋白（800～1600微克）可适用于检测血浆标本的SULT1E1活性。

[0051] <实施例2>

[0052] 用方法二的技术检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性

[0053] 实验主要材料：同实施例1。

[0054] 实验操作：

[0055] （1）标本提取：同实施例1。

[0056] （2）标本反应：依次加入以下反应体系达0.5毫升：5nM的[3H]-E2、总蛋白（800微克）或等体积的尿液、DTT（8mM）、Tris–Cl(pH7.4，100mM)、MgCl2（10mM）。37℃反应45分钟后，加入1.5毫升的冰三氯乙酸或冰甲醇停止反应，震荡混匀。加入1毫升二氯甲烷或氯仿抽提，4℃12000rpm离心10分钟，抽取上清（0.2毫升）。

[0057] （3）标本检测：用液体闪烁计数仪进行检测[3H]-E2-S。

[0058] （4）检测结果和分析：同实施例1。

[0059] 实验结果（图-2）：

[0060] （1）采用方法二的技术，不能检测到非妊娠和妊娠雌鼠血浆和尿液的SULT1E1活性；

[0061] （2）采用方法二的技术，能检测到胎盘组织提取液的SULT1E1活性。

[0062] ◎与方案一的检测结果相比，方案二的技术更适用于检测组织标本的SULT1E1活性，而不太适用于检测血浆标本的SULT1E1活性。

[0063] <实施例3>

[0064] 用方法三的技术检测雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性

[0065] 实验主要材料：同实施例1。

[0066] 实验操作：

[0067] （1）标本提取：同实施例1。

[0068] （2）标本反应：依次加入以下反应体系总量达0.5毫升：17β-estradiol（E2，5nM）、待测样本蛋白（800微克）或等体积的尿液、MgCl2（10mM）、0.4%BSA（8mM）、35
Tris-Cl(pH7.4，100mM)、加20μM的[ S]-PAPS(3Ci/mmol，Perkin-Elmer Life Sciences Inc.)。37℃反应30分钟后，加入0.1毫升的冰醋酸（2.5%）和四丁基磷酸二氢铵（0.2mM）的1:1混合液，停止反应，震荡混匀。加入2毫升的乙酸乙酯饱和液抽提，去除未反应的
35
[ S]-PAPS。4℃离心（12000rpm）10分钟，抽取乙酸乙酯相（0.5毫升），加入液体闪烁液。

[0069] （3）标本检测：用液体闪烁计数仪检测[35S]标记的17β-雌二醇-3硫酸盐结合35
体（[ S]-E2-S）的dpm（每分钟衰变数）。

[0070] （4）检测结果分析：1(Ci)=2.22×1012(dpm)；1(dpm)=1/2.22×10-12(Ci)=1/2.22-12 -9 -12 -9 35×10 /3×10 (pmol)。X(dpm)×1/2.22×10 /3×10 (pmol)÷样本蛋白量=[S ]-E2-S
（pmol/min/mg）＝SULT1E1活性（pmol/min/mg）。

[0071] 实验结果（图-3）：

[0072] （1）用方案三的技术，当E2（5nM）、血浆蛋白量（800微克）、[35S]-PAPS（100μM）加35 35
入反应体系中，能检测到非妊娠雌鼠的血浆[ S]-E2-S，而尿液中不能检测到[ S]-E2-S。

[0073] （2）与非妊娠雌鼠相比，妊娠期雌鼠血浆SULT1E1活性增加了5.1倍。

[0074] （3）在妊娠期雌鼠，胎盘组织提取液的SULT1E1活性是血浆的5.0倍，同样尿液中35
仍然没有[ S]-E2-S。

[0075] ◎试验结果提示，这种检测方法适用于检测血浆标本和组织提取物的SULT1E1活性。

[0076] <实施例4>

[0077] 与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例在反应体系中以[131I]标记三碘甲腺原131 3 131
氨酸（[ I]-T3）取代[H]-E2作为反应底物，用液体闪烁计数仪进行检测[ I]-T3-S的dpm。

[0078] 实验结果同实施例1。

[0079] <实施例5>

[0080] 与实施例1相比，区别点仅在于，本实施例在反应体系中以[131I]标记三碘甲腺原131
氨酸（[ I]-T3）作为反应底物，所述硫供体为5'-磷酸磺基-2'-磷酸腺苷。

[0081] 实验结果同实施例1。

[0082] <实施例6>

[0083] 与实施例1相比，区别点仅在于，分别以卵巢、乳腺、子宫及血管内皮细胞作为待测样品进行试验。

[0084] 试验结果表明：在非妊娠雌鼠的卵巢、乳腺和子宫组织提取液中能检测到3
SULT1E1活性，但是在血管内皮细胞的提取液中[H]–E2-S水平非常低。

[0085] <实施例7>

[0086] 围妊娠期三氯生染毒能降低胎盘、血浆中SULT1E1活性

[0087] 实验主要材料：ICR小鼠（雌性各50只），体重25克～30克，购自江苏省实验动物中心。

[0088] 实验操作：

[0089] （1）围妊娠期三氯生的染毒模型制备：三氯生溶解于乙醇中，然后再用生理盐水将母液稀释到灌胃所需的浓度（以保持乙醇的最终浓度在0.5%以下）。按照每公斤体重1毫克、10毫克、100毫克的剂量给小鼠进行围妊娠期（妊娠前后各2周）灌胃处理。

[0090] （2）标本的制备：取出妊娠第15天和第18天雌鼠的胎盘组织、血浆和尿液。雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）活性检测方法和步骤：同实施例1。

[0091] 实验结果（图-4）：

[0092] （1）采用技术方案一的方法，与对照组妊娠期雌鼠相比，围妊娠期每公斤体重10～100毫克三氯生染毒可以导致胎盘组织提取液中SULT1E1活性减少了约34%；

[0093] （2）与妊娠期对照组雌鼠相比，围妊娠期每公斤体重10～100毫克三氯生染毒引起雌鼠血浆SULT1E1活性也降低了约32%。

[0094] ◎这些结果提示，围妊娠期三氯生染毒降低胎盘和血浆中SULT1E1的活性。

[0095] <实施例8>

[0096] 围妊娠期三氯生染毒不改变SULT1E1的表达

[0097] 实验主要材料：同实施例1。

[0098] 实验操作：

[0099] （1）围妊娠期三氯生染毒模型制备：同实施例4。

[0100] （2）实时定量RT-PCR：检测胎盘组织雌激素硫酸转移酶（SULT1E1）mRNA水平：取出妊娠第15天雌鼠的胎盘组织（50毫克），置于离心管中加入Trizol RNA提取液，冰浴中制备匀浆。加入0.2毫升氯仿，4℃离心(12000rpm)15分钟。转移上层无色水相至新的离心管中，加入0.5毫升异丙醇，室温放置10分钟，4℃离心(12000rpm)10分钟，弃上清，加入75%乙醇，涡旋振荡，4℃7500rpm离心5分钟。弃上清，用30微升DEPC处理水溶解RNA沉淀，核酸蛋白检测仪测定样品OD260、OD280和RNA的浓度，使用OD260/OD280比值在1.8-2.0左右的RNA作为反转录模板。混合后置于PCR扩增仪中进行逆转录反应：37℃15分钟，85℃5秒终止反应。转录后的cDNA加DEPC水稀释10倍混匀。应用StepOnePlus型实时荧光定量TMPCR仪和日本Takara公司的 Premix Ex Taq 试剂盒进行Real-time PCR。将反应体系加入到96孔板中，每个样品的目的基因和内参基因都设三个平行反应管。扩增条件：
第一步95℃预变性30秒，第二步PCR反应95℃5秒，60℃31秒，40个循环。实时定量PCR反应结束后，根据获得的融解曲细和扩增曲线分析结果的可靠性，输出Ct值。实时定量PCR的结果采用比较Ct值定量方法。

[0101] （3）免疫印迹检测：取出妊娠第15天的雌鼠的胎盘组织。加入RIPA蛋白裂解液，匀浆后低温高速离心（4℃,12000rpm,15分钟），取上清液，BCA法测定蛋白浓度，上清液置于-80℃保存。将蛋白样品与上样缓冲液混合，100℃加热5分钟，离心3分钟，取上清加样后进行蛋白电泳。蛋白经SDS-PAGE电泳、转至PVDF膜、封闭后，加SULT1E1特异性一抗，4℃孵育过夜，再与辣根过氧化物（HRP）标记的相应二抗室温反应2小时,经适当洗涤，ECL化学发光显色，X光片压片曝光。之后将PVDF膜用抗体洗脱液洗涤15分钟，重新封闭后分别加β-action特异性一抗及相应二抗体再次显色曝光。用凝胶成像系统对胶片进行薄层密度扫描，记录相应条带的透射光积分光密度（IOD）值反映蛋白含量。

[0102] 实验结果（图-5）：

[0103] 与对照组相比，围妊娠期三氯生染毒并不改变胎盘中SULT1E1的mRNA水平（图-5A）和SULT1E1蛋白水平（图-5B）。

[0104] ◎这些结果提示，围妊娠期三氯生染毒降低胎盘和血浆的SULT1E1活性并不是由于SULT1E1水平的减少。

[0105] <实施例9>

[0106] 围妊娠期三氯生染毒增加血浆雌激素（E2）水平

[0107] 实验主要材料：同实施例1。

[0108] 实验操作：

[0109] （1）围妊娠期三氯生染毒模型制备：同实施例4。

[0110] （2）用2%水合氯醛麻醉妊娠第15天的雌鼠，切开颈部皮肤，分离皮下组织，暴露颈静脉，用注射器抽出血液。血液置于肝素化的离心管中，室温静置半小时，上层有血浆析出后，4℃离心(3500rpm)15分钟，吸出上层血浆。采用放射性免疫测定检测血浆中雌激素（E2）、孕酮（P4）和绒毛膜促性腺激素（β-HCG）水平。

[0111] 实验结果（图-6）：

[0112] 与对照组相比，围妊娠期三氯生染毒能增加血浆雌激素（E2）水平，但是降低孕酮（P4）和绒毛膜促性腺激素（β-HCG）水平（图-6）。

[0113] ◎这些结果提示，围妊娠期三氯生染毒降低SULT1E1的活性，减慢雌激素的代谢，紊乱胎盘的激素水平。

[0114] <实施例10>

[0115] 围妊娠期三氯生染毒引起胎盘的血栓形成和严重的组织坏死

[0116] 实验主要材料：同实施例1。

[0117] 实验操作：

[0118] （1）围妊娠期三氯生染毒模型制备：同实施例4。

[0119] （2）用2%水合氯醛麻醉妊娠第15天的雌鼠，切开腹部皮肤，取出子宫，分离出胎盘。胎盘浸于4%多聚甲醛固定液(4℃)后固定24小时，脱水后进行石蜡包埋。胎盘组织进行5微克的切片，进行HE染色，观测胎盘组织的结构。

[0120] 实验结果（图-7）：

[0121] （1）围妊娠期三氯生染毒剂量依赖地导致妊娠第15天的胎盘出现大量的血栓（图-7A）；

[0122] （2）围妊娠期三氯生染毒引起妊娠第15天的胎盘组织坏死（图-7B）。

[0123] ◎这些结果提示，围妊娠期三氯生染毒降低SULT1E1的活性，减慢雌激素的代谢，导致胎盘组织血栓形成，最终造成胎盘组织坏死。

[0124] <实施例11>

[0125] 围妊娠期三氯生染毒明显增加胎鼠的死亡率和流产率

[0126] 实验主要材料：同实施例1。

[0127] 实验操作：

[0128] （1）围妊娠期三氯生染毒模型制备：同实施例4。

[0129] （2）用2%水合氯醛麻醉妊娠第15天的雌鼠，切开腹部皮肤，取出子宫，检查胎鼠的存活状态。

[0130] （3）计算胎鼠的死亡率：死胎数/（死胎数+活胎数）×100%；流产率：流产动物数/（流产动物数+未流产动物数）×100%。

[0131] 实验结果（图-8）：

[0132] 围妊娠期三氯生染毒能剂量依赖性地导致妊娠第15天胎鼠发生死亡数明显增加（图-8A），流产率高达85%（图-8B）。

[0133] ◎这些结果提示，围妊娠期三氯生染毒降低SULT1E1的活性，导致胚胎死亡和流产。